专利名称：应用重组质粒制备反义寡脱氧核苷酸的方法
本专利属于生物技术领域一种制备反义寡聚脱氧核糖核苷酸的方法，具有制药应用前景。
反义寡核苷酸(包括反义DNA和反义RNA)是一段能与基因转录后的RNA特异互补结合，长度为14-25碱基的核苷酸单链片段。当此段反义寡核苷酸进入细胞，与相对应mRNA互补结合成双链时，能有效地阻断该基因翻译成功能蛋白，从而干扰生物有机体或细胞的功能。应用反义寡核苷酸在医学上能起到治疗疾病的作用，如治疗病毒性疾病、肿瘤以及其它感染性疾病(如细菌感染)方面已证实有独特的疗效。但目前制备反义寡核苷酸的方法主要靠DNA合成仪，其昂贵的成本和低产出率是反义寡核苷酸进入临床中的最大障碍之一。本专利开创性地发明了应用基因工程重组质粒技术来大量制备反义寡脱氧核糖核苷酸(即反义DNA，以下称反义寡脱氧核苷酸)的方法。此方法不仅在以下的抗人乙型肝炎病毒(HBV)方面得到了有效的证实，其最大优点在于可适用于任何情况下的反义寡脱氧核苷酸的重组质粒制备。本专利申请的制备方法大体是化学合成含反义寡脱氧核苷酸的双链(根据其末端碱基不同独特地选用内切酶酶切位点顺序)→此双链和质粒用相同的酶切后，构建重组质粒→转化大肠杆菌→挑选含高拷贝重组质粒克隆→发酵菌种→提取质粒，酶切回收含反义寡脱氧核苷酸顺序的粘性片段→核酸酶S1除去粘性末端→磷酸三酯单链化和乙基化成高效与RNA(特别是mRNA)结合的反义寡脱氧核苷酸。
反义寡脱氧核苷酸如何插入重组质粒后，经内切酶切下的双链片段保证其碱基顺序与所设计的反义寡核苷酸碱基顺序完全一致是本专利的核心之处。首先，任何一种反义寡脱氧核苷酸顺序，无论其长度如何，它的5′和3′末端的碱基有以下二种，即嘌呤AT和嘧啶GC。如
图1中所示，以EcoRI内切酶(GAATTC)为例的一类内切酶在酶切核苷酸顺序后，其末端的碱基为G或C的嘧啶碱基。以HindIII内切酶(AAGCTT)为例的一类内切酶在酶切核苷酸顺序后，其末端碱基为A或T的嘌呤碱基。根据反义寡脱氧核苷酸的两末端碱基的不同可分为三类(1)两末端全为嘌呤(A.T或AT)。(2)两端全为嘧啶(G.C或GC)。(3)一末端为嘌呤(A.T)，另一末端为嘧啶(G.C)，见图2。当第一种情况时，将HindIII的酶切位点的顺序如图2所示的方法设计到待插入的含反义寡脱氧核苷酸的双链片段中；当第二种情况时，将EcoR I的酶切位点顺序设计避去；为第三种情况时，含嘌呤末端加上HindIII，含嘧啶末端加上EcoR I。用DNA合成仪合成设计好的互为互补两股单链，经退火成互补双链后，如图3所示的方法，将含有EcoR I或/和Hind III单一酶切位点的质粒与待插入的含反义寡脱氧核苷酸的双链经相同酶切后，在T4连接酶作用下，构建重组质粒，转化大肠杆菌，筛选出含高拷贝插入片段的菌种。
从重组质粒中大量制备反义寡脱氧核苷酸单链的过程如图4所示。含重组质粒的菌种发酵，收集菌体后大量提取质粒，将质粒用相应内切酶完全酶切，纯化含反义寡核苷酸顺序的短片段，此片段含有粘性末端，可用S1核酸酶切除。此时的双链片段顺序与所需的反义寡脱氧核酸酶的顺序完全一致。经乙酰化、磷酸三酯化和水解处理后，即可得到与mRNA互补结合的反义寡脱氧核苷酸。实例抗入乙型肝炎病毒聚合酶的反义寡脱氧核苷酸的制备用本专利的方法构建了含抗人乙型肝炎病毒聚合酶的反义寡脱氧核苷酸的重组质粒，并有效地制备出抗乙型肝炎病毒复制的反义寡核苷酸单链。人乙型肝炎病毒聚合酶位于基因组的P区，选用第2791至2810的基因顺序为反义寡脱氧核苷酸作用区，其反义顺序为5′-GAGGGAAACCACACGTAGC-3′。如图3所示，用DNA合成仪合成二条顺序互补的单链(两末端有EcoR I酶切位点)，经退火成双链后，用EcoR I酶切处理，同时提取pUC18质粒，同样用EcoR I酶切。将酶切的双链片段和pUC18在T4连结酶作用下，连结成重组质粒。因pUC18中单一EcoR I位点位于LacZ的区域，故选用氨苄青霉素和IPTG/X-gal选择双标记，挑选出白色菌落。然后经EcoR I鉴定出重复含反义寡脱氧核苷酸片段的高拷贝菌株(pHBV1)。发酵培养(37℃高密度发酵，无需IPTG诱生)，提取质粒。质粒经EcoR I酶切(如图4)，HPLC纯化出含反义寡脱氧核苷酸短片段，用S1核酸酶切除粘性末端。经50％acetic anhydride-puridine乙酰化保护，再经30％ethanol，30％lutidene，30％NN-dimethylformamide和17％p-tuluenesulfonyl chloride磷酸三酯化成单链。最后在加入0.5体积氨水情况下，将乙酰化保护基团水解成可在体内抗核酸酶降解的乙基磷酸三酯化修饰的反义寡脱氧核苷酸单链。
用重组质粒制备的抗人乙型肝炎病毒聚合酶的反义寡脱氧核苷酸在体外用HepG2/2215细胞做抗乙型肝炎病毒的实验证实，在加入重组质粒制备的反义寡脱氧核苷酸(5μmol/ml)72小时后，其抑制乙型肝炎病毒HBsAg表达的抑制率为91％。DNA合成仪合成的同顺序无修饰反义寡脱氧核苷酸抑制HBsAg表达70％以上时，其终浓度10μmol/ml。
权利要求
此专利是一种独创的适用于所有反义寡脱氧核糖核苷酸的大量制备方法，其专利权保护内容是。(1)用质粒将含反义寡脱氧核苷酸片段插入，经重组质粒在大肠杆菌中高拷贝后，再从质粒上切下含反义顺序的短片段，此片段经乙酰化、磷酸三酯化和水解成所需的反义寡脱氧核苷酸单链。
(2)如果反义寡脱氧核苷酸顺序两末端均为同一嘌呤即A.T或者一个A和一个T的情况下，选用Hind III的内切酶切点顺序(AGCTT)加入此反义顺序的两边。
(3)如果反义寡脱氧核苷酸顺序两末端均为同一嘧啶即G.C或一个G和一个C的情况下，选用EcoR I的内切酶切点顺序(AATTC)加入此反义顺序的两边。
(4)如果反义寡脱氧核苷酸顺序两边为一个嘌呤和一个嘧啶即AC.AG.TC.TG或CA.CT.GA.GT的情况下，则选用Hind III酶切位点顺序加在嘌呤末端，EcoR I酶切位点顺序加嘧啶末端。
(5)如果反义寡脱氧核苷酸顺序两边正好含有一平顶末端内切酶的顺序，如Mbo I(GATC)，Alu I(CTAG)的情况下，则选用相对应的有此平顶末端的顺序的内切酶加在此末端。
(6)任何一种带EcoR I和/或Hind III单一酶切位点的质粒均可作为此方法的载体，pUC，pBR，pET系列为佳。
(7)权利要求2和4中Hind III内切酶可被相类似内切酶替代，如Nco I和Spe I等。
(8)权利要求3和4中EcoR I内切酶可被相类似内切酶替代，如BamH I和Apa I等。
全文摘要
反义寡核苷酸(Antisense Oligonucletides)是一类具有抗病毒、抗癌等潜力的核酸类药物。应用重组质粒生产反义寡脱氧核糖核苷酸(即反义DNA)为反义核酸低成本大规模生产提供了一条开创性的方法。本发明大体可概括为将含反义寡核苷酸顺序的双链用内切酶的方法插入质粒中，待重组质粒扩增后，用内切酶切下含反义寡核苷酸顺序的双链，核酸酶S
文档编号C07H21/00GK1138047SQ9510684
公开日1996年12月18日 申请日期1995年6月14日 优先权日1995年6月14日
发明者范开 申请人:范开