NMNAT1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途与流程

本发明涉及疾病相关突变基因，具体而言涉及利伯先天性黑矇相关突变基因。

背景技术：
利伯先天性黑矇(Lebercongenitalamaurosis，LCA)是一种常染色体隐性视网膜营养不良，其表现为遗传异质性。利伯先天性黑矇是儿童遗传性失明的最常见原因之一1，是一种严重的视网膜营养不良，表现为在出生时或婴儿期低视力和眼震。迄今为止，发现LCA与至少17个基因有关。在20-30％的筛查到的LCA病例中缺乏可辨认的分子病因，表明仍有未被发现的LCA致病基因2-4。现在的临床试验通常通过基因替换寻找分子缺陷，或者对于RPE65和LRAT不足的情况通过口服9-顺式视黄醛绕过代谢阻断。因此，本领域仍然需要发现LCA相关的基因突变，以及检测相关突变基因的引物、试剂盒和方法。

技术实现要素：
发明人测序了患LCA个体的外显子组，鉴定出NMNAT1基因中的无义突变(c.507G>A,p.Trp169*)和错义突变(c.769G>A,p.Glu257Lys)，发现这种突变基因与LCA有关。因此，在第一方面，本发明涉及LCA的生物标记物，即突变的NMNAT1基因或NMNAT1蛋白，所述生物标记物是具有选自如下的突变的NMNAT1基因或NMNAT1蛋白：无义突变(c.507G>A,p.Trp169*)；错义突变(c.769G>A,p.Glu257Lys)。在一个实施方案中，本发明的突变NMNAT1基因的序列是具有以下突变的SEQIDNO:1：无义突变c.507G>A；和/或错义突变c.769G>A。在另一个实施方案中，本发明的突变的NMNAT1蛋白的序列是具有以下突变的SEQIDNO:2：无义突变p.Trp169*；和/或错义突变p.Glu257Lys。在第二方面，本发明涉及一种检测LCA的方法，所述方法包括检测受试者的NMNAT1基因或NMNAT1蛋白中是否存在突变位点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为患有LCA或易患LCA，或者其后代会患有LCA或易患LCA，所述突变位点选自如下任一种或其组合：无义突变(c.507G>A,p.Trp169*)；和错义突变(c.769G>A,p.Glu257Lys)。在一个实施方案中，所述检测LCA的方法包括步骤：提取受试者的DNA样品，对所述DNA样品进行PCR扩增得到扩增产物，得到NMNAT1基因外显子和外显子/内含子边界，将上述PCR扩增的扩增产物进行序列测定得到测序结果，对所述测序结果进行分析，确定NMNAT1基因中是否存在突变位点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为患有LCA或易患LCA，或者其后代会患有LCA或易患LCA，所述突变位点选自如下任一种或其组合：无义突变(c.507G>A,p.Trp169*)；和错义突变(c.769G>A,p.Glu257Lys)。在一个更优选的实施方案中，PCR使用KAPA2GRobustHotStart(KAPABIOSYSTEMS,Woburn,MA)进行。在一个更优选的实施方案中，PCR扩增的引物参考人基因组进行设计，例如如下至少一组引物：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；SEQIDNO:9和SEQIDNO:10。在一个更优选的实施方案中，序列测定是Sanger序列测定。在一个更优选的实施方案中，序列分析使用MutationSurveyorprogram(StateCollege,PA)进行。在一个实施方案中，NMNAT1蛋白为SEQIDNO:2的序列表示。在另一个实施方案中，NMNAT1基因为SEQIDNO:1的序列表示。在又一个实施方案中，本发明的检测LCA的方法包括如下至少一组引物扩增的步骤：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；SEQIDNO:9和SEQIDNO:10。在再一个实施方案中，本发明的检测LCA的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。在本发明第二方面的方法中，优选检测纯合的突变NMNAT1基因。在第三方面，本发明涉及一种检测突变NMNAT1基因或NMNAT1蛋白的方法，所述方法包括检测受试者的NMNAT1基因或NMNAT1蛋白中是否存在突变位点，所述突变位点选自如下任一种或其组合：无义突变(c.507G>A,p.Trp169*)；和错义突变(c.769G>A,p.Glu257Lys)。在一个实施方案中，本发明的检测突变NMNAT1基因的方法包括步骤：提取受试者的DNA样品，对所述DNA样品进行PCR扩增得到扩增产物，得到NMNAT1基因外显子和外显子/内含子边界，多上述PCR扩增的扩增产物进行序列测定得到测序结果，对所述测序结果进行分析，确定NMNAT1基因中是否存在突变位点，所述突变位点选自如下任一种或其组合：无义突变(c.507G>A,p.Trp169*)；和错义突变(c.769G>A,p.Glu257Lys)。在一个更优选的实施方案中，PCR使用KAPA2GRobustHotStart(KAPABIOSYSTEMS,Woburn,MA)进行。在一个更优选的实施方案中，PCR扩增的引物参考人基因组进行设计，例如如下至少一组引物：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；SEQIDNO:9和SEQIDNO:10。在一个更优选的实施方案中，序列测定是Sanger序列测定。在一个更优选的实施方案中，序列分析使用MutationSurveyorprogram(StateCollege,PA)进行。在一个实施方案中，NMNAT1蛋白为SEQIDNO:2的序列表示。在另一个实施方案中，NMNAT1基因为SEQIDNO:1的序列表示。在又一个实施方案中，本发明的检测突变NMNAT1基因或NMNAT1蛋白的方法包括如下至少一组引物扩增的步骤：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；SEQIDNO:9和SEQIDNO:10。在再一个实施方案中，本发明的检测突变NMNAT1基因或NMNAT1蛋白的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。本发明第三方面所述检测突变NMNAT1基因或NMNAT1蛋白的方法可以用于诊断LCA的目的，也可以用于非诊断疾病的目的。在一些实施方案中，本发明中所述的非诊断疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多肽性，用于家族演化研究。这样的应用是本领域技术人员可以理解的。根据本文的描述可以看出，有些个体携带本发明所述的突变NMNAT1基因但不患LCA，例如仅一条染色体携带所述突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以不涉及任何诊断疾病的目的，因为这些个体本身并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为有用的信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。因此，本发明第三方面所述检测突变NMNAT1基因或NMNAT1蛋白的方法涉及检测杂合突变。但本发明第三方面所述检测突变NMNAT1基因或NMNAT1蛋白的方法也包括检测纯合突变。在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变NMNAT1基因或NMNAT1蛋白中使用的引物对，所述突变是选自如下任一种或其组合：无义突变(c.507G>A,p.Trp169*)；和/或错义突变(c.769G>A,p.Glu257Lys)，其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上前后设计，使得扩增该位置：cDNA序列第507位和第769位。在一个实施方案中，所述引物对是：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；或SEQIDNO:9和SEQIDNO:10。在第五方面，本发明涉及与突变NMNAT1基因互补的核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合：无义突变c.507G>A；和/或错义突变c.769G>A，所述探针与突变NMNAT1基因的互补区包括选自如下的基因组序列或cDNA序列上的位置：cDNA序列第507位和第769位。在第六方面，本发明涉及检测突变NMNAT1基因或NMNAT1蛋白的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是选自如下任一种或其组合：无义突变(c.507G>A,p.Trp169*)；和错义突变(c.769G>A,p.Glu257Lys)，其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置：cDNA序列第507位和第769位。在一个实施方案中，所述检测突变NMNAT1基因或NMNAT1蛋白的试剂盒包含选自如下的至少一组引物：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4；SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；SEQIDNO:9和SEQIDNO:10。在第七方面，本发明涉及检测突变NMNAT1基因的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合：无义突变c.507G>A；和错义突变c.769G>A，所述探针与突变NMNAT1基因上包含选自如下位置的基因组序列或cDNA序列上的区域互补：cDNA序列第507位和第769位。在第八方面，本发明涉及一种检测基因外显子和外显子/内含子边界突变的方法，包括步骤：1.从受试者提取DNA样品，2.对上述DNA样品的外显子组和所有外显子/内含子边界序列进行测序得到测序片段，3.将上述测序片段与参考序列比对，得到基因外显子和外显子/内含子边界突变。在一个实施方案中，在第2步骤之前对上述样品进行外显子组捕获以收集人基因组DNA的CDS区，将富集外显子的DNA文库进行第二文库构建，用于序列测定。在一个实施方案中，第2步骤中的测序按如下进行：1)将样品DNA随机打断成200-300bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库；2)文库经纯化后经过连接反应介导的PCR(LM-PCR)的线性扩增与生物素标记的DNA文库进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序，读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少为50。在一个实施方案中，在第3步骤中去除重复测序片段。附图说明图1.患者1的视网膜表观，表明视网膜血管减少、视网膜黄斑色素沉着和萎缩性黄斑损害。图2.在NMNAT1基因中被确认的突变的原理图。对无以前鉴定的突变的LCA患者通过Sanger序列测定筛查NMNAT1基因突变。对于可得到的家庭成员也进行基因组DNA的分离和分析。自患者6的亲本样品不可获得。患者9和10仅目前样品可获得。图3.对无以前鉴定的突变的LCA患者通过Sanger序列测定筛查NMNAT1基因突变。对于可得到的家庭成员也进行基因组DNA的分离和分析。自患者6的亲本样品不可获得。患者9和10仅目前样品可获得。图4.图像表示显示了与人NMNAT1原聚体结构上鉴定的LCA突变相关的残基。总体结构显示为灰色带状物，结合的NAD为橙色棒状物。所有8个突变位点显示为棒状物(无义蓝绿色，错义绿色)。红色虚线显示三个残基和结合的NAD之间的最小距离(见下文)。具体实施方式在本发明中，采用本领域通用表示法表示基因突变和蛋白质突变。在本发明中，c.507G>A表示cDNA第507位核苷酸由G变成A；p.Trp169*和p.Trp169stop都表示编码蛋白质第169位的密码子由编码Trp的密码子变成终止密码子；c.769G>A表示cDNA第769位核苷酸由G变成A；p.Glu257Lys表示编码蛋白质第169位密码子由编码Glu的密码子变成编码Lys的密码子，或者表示蛋白质第169位由Glu变成Lys。因此，在一个实施方案中，本发明的突变NMNAT1基因的编码第169位氨基酸的密码子可以是AAA或AAG。野生型人NMNAT1基因的cDNA序列如SEQIDNO:1所示。野生型人NMNAT1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。野生型人NMNAT1基因的mRNA序列如SEQIDNO:11所示。对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及NMNAT1基因的cDNA序列，实际上包括该序列以及其互补序列。例如，提及SEQIDNO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及NMNAT1基因的cDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。在本发明中，外显子/内含子边界是指从外显子-内含子边界开始1-200，例如10-100，例如20-80，例如30-70，例如40、50、60个内含子核苷酸。为了发现已知LCA相关基因中的突变，发明人对17个已知LCA相关基因的编码区和所有外显子/内含子边界(从外显子-内含子边界开始至少50个内含子核苷酸)进行测序，所述17个基因即AIPL1、CABP4、CEP290、CRB1、CRX、GUCY2D、IQCB1、LCA5、LRAT、RD3、RDH12、RPE65、RPGRIP1、SPATA7、TULP1、IMPDH1和OTX2，这些基因的相关信息可以从孟德尔人类遗传数据库(OMIM)获得。在所研究的220名LCA个体中，在160个病例的两条染色体上发现了突变体等位基因，在10个病例中发现一个突变体等位基因。因为在患者1(临床表型信息见后文表5)中未鉴定到已知LCA基因，对其进行了全外显子组序列分析(参见表1和2和实施例)。总共鉴定了2460个未报道基因变异。发明人优选了10个基因，每个均具有以前未报道的无义变异，预计会截短产物，对这些基因进一步进行分析。GeneCards表明，这10个基因中的5个在视网膜中表达，其中包括NMNAT1，该基因遗传图谱在1p36区。LCA9是唯一在分子上仍不明确的基因座，以前在同族的巴基斯坦家族中的遗传图谱在染色体1p365。基因NMNAT1编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成通路中的一种酶，被认为可抗轴突变性。通过外显子组序列测定在NMNAT1基因中鉴定了无义变异(c.507G>A,p.Trp169*)和错义突变变异(c.769G>A,p.Glu257Lys)，并通过Sanger序列测定(PCR引物在表3中提供)进行了确认。亲本测试确定，父本携带所述无义变异的杂合子，而母本携带所述错义变异的杂合子，因NMNAT1基因突变造成的LCA是常染色体隐性遗传病，因此父母不会致病。但子代同时遗传了这两个变异，因此造成NMNAT1基因功能异常，从而致病的。分析表明，未受影响的胞亲不携带变异。总之，这些结果支持了NMNAT1基因是LCA候选基因。表1.通过外显子组测序筛查L...