一种酰化高丝氨酸内酯类化合物及其环保应用的制作方法

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及抑制氧化亚铁硫杆菌生物膜形成的化合物及其在减少酸性重金属矿坑水产生方面的应用。

背景技术：

酸性矿坑水(acid mine drainage，AMD)主要是由于金属硫化矿在空气、水和微生物等的作用下，发生溶浸、氧化、水解等一系列物理化学反应而形成。目前，酸性矿坑水的污染已经成为全世界最为严重的环境问题之一，酸性矿坑水具有极低的pH(pH≤2.0)和高浓度的重金属离子，因此会对矿区周围的生态环境造成严重的污染。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，A.ferrooxidans)是酸性重金属矿坑水环境中最为常见的浸矿细菌之一。当A.ferrooxidans以生物膜的形式存在于金属硫化矿表面时，可以极大的促进金属硫化矿的分解和金属离子的溶出，导致大量含有高浓度重金属离子的酸性矿坑水产生，因此A.ferrooxidans形成的生物膜在酸性矿坑水产生的过程中起着非常重要的作用。控制酸性矿坑水的方法大致可分为物理方法、化学方法以及生物方法三大类。其中最常用的是化学方法，即通过投放抑菌剂或杀菌剂抑制浸矿细菌的活性，从而防治酸性矿坑水的污染，但是，这种方法并不能作为一种长期的控制方法。原因在于：细菌的再生使人们必须不断的加入这些杀菌剂或者抑菌剂，这样不仅会导致嗜酸性氧化亚铁硫杆菌耐药性的产生，还会对矿区水体生物产生毒性，造成二次污染。

本发明公开了一种能够抑制嗜酸性氧化亚铁硫杆菌生物膜形成的化合物，该化合物在不影响嗜酸性氧化亚铁硫杆菌正常生长的情况下，可以抑制该菌生物膜的形成，从而降低了嗜酸性氧化亚铁硫杆菌对硫化矿的侵蚀速度，显著降低了硫化矿区酸性重金属矿坑水的产生。

技术实现要素：

本发明的目的之一是克服现有技术中存在的缺点，提供一种酰化高丝氨酸内酯的类似物，该化合物可以作为氧化亚铁硫杆菌生物膜形成的抑制剂。

本发明的另一个目的是提供酰化高丝氨酸内酯的类似物在抑制硫化矿区酸性重金属矿坑水产生中的应用。

为了实现上述目的，本发明公开了一种酰化高丝氨酸内酯类化合物，其化学结构通式为：

其中n＝0或1或2或3或4或5；X＝F或Cl或Br或NO₂或CF₃或CH₃或CH₃O。

进一步地，本发明中用于抑制氧化亚铁硫杆菌生物膜的酰化高丝氨酸内酯类似物是下述化合物：

N-(3-环丁内酯)-4-溴苯甲磺酰胺。

本发明公开的酰化高丝氨酸内酯类化合物可用于抑制嗜酸性氧化亚铁硫杆菌生物膜形成，所述酰化高丝氨酸内酯类化合物的使用量为1-1000μM，优选10-100μM。

本发明公开的酰化高丝氨酸内酯类化合物可用于抑制酸性重金属矿坑水的产生，所述酸性重金属矿坑水来源于金属硫化矿矿区，所述的化合物的使用浓度优选100μM。

本发明的有益效果：

本发明合成的化合物对氧化亚铁硫杆菌生物膜的形成具有较高的抑制活性，并且对于酸性重金属矿坑水的产生同样具有良好的抑制效果。此外，与现有技术相比，本发明是通过抑制氧化亚铁硫杆菌生物膜的形成，减少细菌和矿石之间的相互作用，从而达到抑制酸性重金属矿坑水产生的目的。该化合物与传统的杀菌剂或抑菌剂相比，制备过程简单，抑制作用长效，无二次污染，不会产生由杀菌剂或抑菌剂引起的耐药性。

附图说明

图1为本发明的化合物对氧化亚铁硫杆菌Fe²⁺氧化百分率的影响，其中，细菌处理组；细菌+10μM化合物处理组；细菌+100μM化合物处理组。

图2为本发明的化合物对氧化亚铁硫杆菌生物膜形成的影响，其中，细菌处理组；细菌+10μM化合物处理组；细菌+100μM化合物处理组。

图3为本发明的化合物对浸矿体系中镍离子浓度的影响，其中，(□)无菌处理组；(■)细菌处理组；(◆)细菌+100μM化合物处理组。

图4为本发明的化合物对浸矿体系中铜离子浓度的影响，其中，(□)无菌处理组；(■)细菌处理组；(◆)细菌+100μM化合物处理组。

图5为本发明的化合物对浸矿体系中pH变化的影响，其中，(□)无菌处理组；(■)细菌处理组；(◆)细菌+100μM化合物处理组。

具体实施方式

以下提供具体实施例以实现本发明所述的技术方案，但不限于这些实施例。

实施例1氧化亚铁硫杆菌生物膜抑制剂的合成

具体合成步骤为：

(1)在冰水浴条件下，将169mg(0.93mM)的(R)-(+)-α-氨基-γ-丁内酯盐酸盐和0.93mM的对溴苯甲烷磺酰氯置于10mL干燥的CH₂Cl₂溶液中混合均匀，之后加入267mg(1.5mM)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和68mg(0.6mM)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，搅拌30min之后撤去冰浴，在室温条件下继续搅拌反应20h；

(2)反应后的溶液经CH₂Cl₂稀释至终体积100mL，在分液漏斗中用等体积的10％(v/v)的HCl溶液和饱和NaCl溶液分别洗涤上述溶液3遍。之后收集有机相溶液，加入无水MgSO₄除去有机相中残留的水分，经旋转蒸发仪50℃干燥后得到粗产物。粗产物经SiO₂柱层析，TLC监测，乙酸乙酯：石油醚＝1.5:1洗脱，洗脱液经旋转蒸发仪50℃旋蒸、油泵减压抽滤之 后得到目的产物。

实施例2化合物对氧化亚铁硫杆菌正常生长的影响

实验材料：A.ferrooxidans ATCC23270购自American type culture collection(ATCC)。

嗜酸性氧化亚铁硫杆菌在正常生长的过程中将Fe²⁺氧化为Fe³⁺获取能量进行生长。通过重铬酸钾滴定法检测溶液中Fe³⁺的含量，反映化合物对细菌Fe²⁺氧化能力的影响，从而保证用药浓度不会影响细菌的正常生长。实验方法如下：

(1)在250mL三角瓶中加入100mL pH 1.8的9K培养基(9K培养基配制方法：将3.0g(NH₄)SO₄，0.1g KCl，0.5g K₂HPO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.01g Ca(NO₃)₂，44.67g FeSO₄·7H₂O溶于1000mL蒸馏水中，并用稀硫酸调整pH至2.0，并过滤除菌)，然后将实验分为三组，第一组以不加化合物作为空白对照组；第二组加入已经过滤除菌的终浓度为10μM的化合物；第三组加入终浓度为100μM的化合物。

(2)每个实验组做三个平行，然后按照10％(v/v)的接种量接种连续培养20h的A.ferrooxidans ATCC23270，最后将三角瓶放入恒温摇床中，150r/min，30℃振荡培养；连续培养24h之后，用重铬酸钾滴定法测定培养基中Fe²⁺含量。吸取1mL培养液，用5mL蒸馏水稀释，同时加入3mL混酸溶液(体积比为H₃PO₄：H₂SO₄：H₂O＝15：15：70)来消除Fe³⁺对指示剂显色的影响，再加入50μL二苯胺磺酸钠指示剂，用0.01M的K₂Cr₂O₇滴定样品，样品溶液从无色变为紫色即为滴定终点，记录到达滴定终点消耗K₂Cr₂O₇标准液的体积；

(3)最终通过计算溶液中剩余Fe²⁺的含量，计算Fe²⁺氧化百分率，并用SPSS 13.0软件进行统计学分析。数据采用mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义，结果如图1所示。从图1中可以看出，连续培养24h之后，与空白不加药处理组相比，10μM和100μM浓度的化合物均未对细菌Fe²⁺氧化百分率产生影响，差异不具有统计学意义(P<0.05)，所以两个用药浓度均不会影响细菌的生长。

实施例3生物膜抑制剂抑制活性检测

(1)9000r/min，10℃离心15min收集得到A.ferrooxidans ATCC23270菌体，用pH 2.0的稀硫酸溶液洗涤菌体两遍，最后重悬于含2g/L Fe²⁺，pH 2.0的基础盐溶液(不含FeSO₄的9K培养基)中，并且将细菌悬液的细菌密度调至1.0×10⁸cells/mL；

(2)将上述细菌悬液分为三组，第一组以不加化合物作为空白对照组；第二组加入已经过滤除菌的终浓度为10μM的化合物；第三组加入终浓度为100μM的化合物。将细菌悬液加入96孔细胞培养板中，150μL/孔，每个实验组做8个平行。然后将96孔细胞培养板放入恒温培养箱中，30℃静置培养48h，形成生物膜；

(3)48h之后，倒掉孔内菌液，每孔用无菌去离子水洗涤两遍，洗去游离的细菌。每孔加入0.5％的结晶紫溶液150μL，室温条件下染色15min。之后洗去残留的结晶紫染料，每孔中加入150μL的33％的冰乙酸溶液，溶解生物膜-结晶紫混合物，用多功能酶标仪读取570nm吸光度值；

(4)实验数据用mean±SD表示，以P<0.05认为差异具有统计学意义，如图2所示。从图2中可以看出，与空白不加药处理组相比，10μM和100μM浓度的化合物处理后，对A.ferrooxidans ATCC23270生物膜的形成具有明显的抑制效果，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

实施例4化合物对酸性重金属矿坑水产生的抑制作用

(1)9000r/min，10℃离心15min收集得到A.ferrooxidans ATCC23270菌体，用pH 2.0的稀硫酸溶液洗涤菌体沉淀两遍，最后重悬于pH 2.0的基础盐溶液中，并且将A.ferrooxidans ATCC23270菌悬液的菌体密度调至1.0×10⁸cells/mL。在250mL三角瓶中加入100mL菌悬液中，并且按照5％(w/v)的矿浆浓度，加入粒径为50-100μm的镍黄铁矿颗粒粉末5g；

(2)镍黄铁矿的金属溶出实验分为3个实验组，分别为：细菌处理组、100μM化合物+细菌处理组、以及无菌处理组，每组实验组做三个平行。所有样品于摇床150r/min，30℃培养，溶出过程持续44天，每2天用pH计测定样品中的pH。此外，每隔一段时间取矿石浸 出液1mL，1000r/min低速离心5min后去除矿石残渣，上清用pH 2.0的稀硫酸稀释后，用原子吸收发射光谱测定样品中Ni²⁺，Cu²⁺含量，结果如图3所示。

(3)从图3和4中可以看出，在没有细菌存在的情况下，矿石中Ni和Cu的溶出过程十分缓慢，而在有细菌存在的情况下，溶液中可溶性Ni和Cu的含量要远远大于无菌对照组。而用100μM的化合物处理之后，溶液中可溶性Ni和Cu的含量虽然略高于无菌处理组，但是却远远低于纯细菌处理组。此外，如图5所示，加药处理之后浸矿体系的pH较纯细菌培养组有所升高，说明浸矿体系中的产酸量有所减少，而且这种抑制作用可以持续60天以上。因此，该化合物可以抑制细菌对矿石中金属的溶出作用，并且可以减少酸的产生，所以对AMD的产生具有一定的抑制效果。