结合LGR5的人源化抗体的制作方法

本申请要求于2014年11月18日提交的美国临时申请第62/081497号和于2014年4月4日提交的美国临时申请第61/975589号的权益，将其内容通过引用整体并入本文。发明领域本发明总体上涉及癌症生物学领域。更具体地，实施方案涉及针对LGR5的人源化抗体以及此类抗体的用途。若干实施方案涉及针对LGR5的单克隆抗体、人源化抗体或全人抗体，杂交瘤或表达此类抗体的其它细胞系，编码此类抗体的核酸和包含编码此类抗体的核酸的载体，以及用此类抗体阻断癌症干细胞(CSC)生长的方法。序列表的引用将本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以标题为BIONO10WO_SEQLISTING的文件提供，其创建于2015年4月2日，大小约40Kb。将电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。发明背景含有富亮氨酸重复的G-蛋白偶联受体5(LGR5)也被称为GPR49/HG38/FEX，其属于与糖蛋白激素受体结构上类似的含有富亮氨酸重复的G-蛋白偶联受体(LGR)/受体蛋白的G-蛋白偶联受体(GPR)蛋白家族。LGR被分为三个亚组：(1)糖蛋白激素受体，其包括促甲状腺激素(TSH)受体、促卵泡激素(FSH)受体和促黄体生成激素(LH)受体；(2)松弛素受体LGR7和LGR8；以及(3)LGR4、LGR5和LGR6。LGR5在包括肠、骨骼肌、胎盘、脑和脊髓的数种组织中表达。发明概述本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括结合LGR5的人源化单克隆抗体或人单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:23或其保守变异的重链CDR1。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:2或其保守变异的重链CDR2。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:3或其保守变异的重链CDR3。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:4或其保守变异的轻链CDR1。在一些实施方案中，抗体包含具有氨基酸LTS或其保守变异的轻链CDR2。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:33或其保守变异的轻链CDR3。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:19或48的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:21或49的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗体结合LGR5(SEQIDNO:47)的氨基酸T175、E176、Q180、R183、S186、A187、Q189、D247、E248、T251、R254、S257、N258、K260内的表位。在一些实施方案中，抗体结合LGR5(SEQIDNO:47)的富亮氨酸重复6-9内的表位。在一些实施方案中，抗体结合LGR5的凸面上的表位。在一些实施方案中，抗体不结合RSPO-LGR5结合的位点。在一些实施方案中，抗体不破坏LGR5-RSPO结合。在一些实施方案中，抗体不破坏LGR5-RSPO信号转导。在一些实施方案中，RSPO选自RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4。在一些实施方案中，抗体不破坏诸如LGR5-RSPO-RNF43、LGR5-RSPO-ZNRF3、LGR5-RSPO-LRP6、LGR5-NORRIN-RNF43、LGR5-NORRIN-ZNRF3、LGR5-NORRIN-LRP6的复合物的形成。在一些实施方案中，抗体破坏通过Wnt/β-连环蛋白通路的LGR5信号转导。在一些实施方案中，抗体诱导肿瘤中分化标志物的表达。在一些实施方案中，抗体能够诱导肿瘤中的细胞分化。在一些实施方案中，抗体抑制肿瘤的生长。在一些实施方案中，抗体降低了肿瘤中癌症干细胞(CSC)的频率。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码任一前述抗体的多核苷酸。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括含有任一前述多核苷酸的载体。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括含有任一前述载体的宿主细胞。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括产生抗体的方法，所述方法包括培养任一前述宿主细胞以便产生抗体。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括含有任一前述抗体和药学可接受载体的药物组合物。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向对象施用任一前述抗体。一些实施方案还包括将化疗剂与抗体联合施用。在一些实施方案中，化疗剂选自：亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康、吉西他滨和Abraxane。在一些实施方案中，将亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康与抗体联合施用至对象。在一些实施方案中，在治疗之后，相比于未用抗体治疗的对象的存活可能性，所述治疗将对象的存活可能性增加了至少3个月。在一些实施方案中，将对象的存活可能性增加了至少6个月。在一些实施方案中，将对象的存活可能性增加了至少12个月。在一些实施方案中，相比于未用抗体治疗的对象中的癌症复发风险，所述治疗降低了对象中的癌症复发风险。在一些实施方案中，相比于未用抗体治疗的对象的外周血中的肿瘤细胞水平，所述治疗降低了对象的外周血中的肿瘤细胞水平。在一些实施方案中，癌症选自：结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌。在一些实施方案中，癌症选自：包含APC突变的结肠癌、包含KRAS突变的结肠癌、转移性结肠直肠癌、转移性胰腺癌、三阴性乳腺癌和小细胞肺癌。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括用于降低发展癌症的风险、预防癌症的复发或预防易患癌症的对象中癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用任一前述抗体。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括增加患癌症的对象的存活可能性的方法，其包括向对象施用任一前述抗体。在一些实施方案中，在治疗之后，相比于未用抗体治疗的对象的存活可能性，对象的存活可能性增加至少3个月。在一些实施方案中，对象的存活可能性增加至少6个月。在一些实施方案中，对象的存活可能性增加至少12个月。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括降低对象中的癌症复发风险的方法，所述方法包括向所述对象施用任一前述抗体。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案包括，降低对象的外周血中癌症的肿瘤细胞水平的方法，所述方法包括向所述对象施用任一前述抗体。一些实施方案还包括将化疗剂与抗体联合施用。在一些实施方案中，化疗剂选自：亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康、吉西他滨和Abraxane。在一些实施方案中，将亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康与抗体联合施用至所述对象。在一些实施方案中，通过预测性临床测试、遗传分析或家族史分析确定易患癌症的对象。在一些实施方案中，癌症选自：结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌。在一些实施方案中，癌症选自包含APC突变的结肠癌、包含KRAS突变的结肠癌、转移性结肠直肠癌、转移性胰腺癌、三阴性乳腺癌和小细胞肺癌。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括选择患有肿瘤的对象进行治疗的方法，所述方法包括：(a)向对象施用化疗剂；(b)鉴定肿瘤中LGR5多肽或编码LGR5核酸的增加水平；以及(c)向肿瘤中LGR5多肽或编码LGR5的核酸的水平增加的对象施用任一前述抗体。在一些实施方案中，化疗剂选自：亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康、吉西他滨和Abraxane。在一些实施方案中，肿瘤选自：结肠癌肿瘤、结肠直肠癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤和肺癌肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤选自：包含APC突变的结肠癌肿瘤、包含KRAS突变的结肠癌肿瘤、转移性结肠直肠癌肿瘤、转移性胰腺癌肿瘤、三阴性乳腺癌肿瘤和小细胞肺癌肿瘤。本文提供的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案，包括评估用任一前述抗体进行治疗的功效的方法，所述方法包括测量用抗体治疗的肿瘤中的生物标志物水平。在一些实施方案中，生物标志物是核酸或由所述核酸编码的多肽，其中生物标志物选自：WNT6、FZD8、FOSL1、WT11、NFATC1、FZD5、FZD2、FRZB、PRICKLE1、FZDB、FZD7、WNT7B、FBXW11、FZD1、DVL1、CSNK2A1、ANGPT2、AKAP12、ADM、CTNNB1、ALDOC、CDH5、ITGA2、DAB1、MIR655、NKX1-2、ZBTB11、ITPKA、PSMC3IP和BAK1。在一些实施方案中，生物标志物的水平相比于未用抗体治疗的肿瘤中的生物标志物水平的减少指示有效的治疗。在一些实施方案中，生物标志物选自：WNT6、FZD8、FOSL1、WT11、NFATC1、FZD5、FZD2、FRZB、PRICKLE1、FZDB、FZD7、WNT7B、FBXW11、FZD1、DVL1、CSNK2A1、ANGPT2、AKAP12、ADM、CTNNB1、ALDOC、CDH5和ITGA2。在一些实施方案中，生物标志物的水平相比于未用抗体治疗的肿瘤中的生物标志物水平的增加指示有效的治疗。在一些实施方案中，生物标志物选自：DAB1、MIR655、NKX1-2、ZBTB11、ITPKA、PSMC3IP和BAK1。在一些实施方案中，肿瘤选自：结肠癌肿瘤、结肠直肠癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤和肺癌肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤选自：包含APC突变的结肠癌肿瘤、包含KRAS突变的结肠癌肿瘤、转移性结肠直肠癌肿瘤、转移性胰腺癌肿瘤、三阴性乳腺癌肿瘤和小细胞肺癌肿瘤。附图简述图1是显示人源化单克隆抗体18G7H6A3与人LGR5(CHO)结合的直接FACS(荧光激活细胞分选)图。图2是显示FOLFIRI单独以及与18G7H6A3联合，对CT3CRC肿瘤体积的影响的曲线图。图3是显示18G7H6A3处理显著减小MDA-MB-231-LM3原发肿瘤体积的曲线图。图4描述了显示在携带CT1或CT3肿瘤的小鼠中进行FolFiri处理导致LGR5上调的曲线图。图5是显示化疗导致JH109肿瘤中LGR5上调(大于4倍)的柱状图。图6是显示当与化疗(吉西他滨)联合施用时，观察到的18G7H6A3的显著活性的曲线图。图7是显示抗体18G7H6A3减少CT1癌症干细胞群中活事件数的点图。图8是线图，其显示分离自用抗-LGR5抗体18G7H6A3与FOLFIRI联合处理的小鼠的细胞，相比于分离自用FOLFIRI单独处理的小鼠的细胞，大大地降低了致瘤性。图9是线图，其显示来自18G7H6A3FOLFIRI联合的再植入细胞，显著地延长了进展的时间。图10是线图，其显示当与化疗(FOLFIRI)联合预防施用时，观察到人源化抗体18G7H6A3的显著活性。图11是点图，其显示抗体18G7H6A3能够在体内抑制肿瘤细胞中的Wnt信号转导，如通过磷酸化-Thr41/Ser45-β-连环蛋白免疫分析所示。图12是柱状图，其显示将可溶性抗体18G7H6A3的浓度增加，不影响通过Wnt3a加RSPO2的联合来诱导TCF/LEF启动子驱动的GFP表达，其表明，抗-LGR5抗体18G7H6A3不能阻断RSPO驱动的TCF/LEF启动子激活。阳性对照抗体C12显示抑制Wnt3a/RSPO2驱动的TCF/LEF启动子激活。图13是显示R-脊椎蛋白不能阻断抗体18G7H6A3与LGR5结合的线图。图14是显示抗体18G7H6A3与LGR5结合抑制三元复合物形成的柱状图。图15描述了处理的样本中LGR5表达的水平。图16描述了处理的样本中CTNNB1表达以及p-β-连环蛋白表达的水平。图17描述了不同的处理样本中差异表达的转录物。图18描述了18G7H6A3-(BNC101)处理的肿瘤中差异表达的基因。图19描述了FOLFIRI处理的肿瘤中差异表达的基因。图20描述了联合处理的肿瘤中差异表达的基因。图21描述了循环HLA+细胞中LGR5的水平。图22A和图22B描述了循环HLA+细胞中LGR5的水平。图23是显示用吉西他滨/Abraxane、或用吉西他滨/Abraxane和18G7H6A3处理的小鼠的动物存活曲线图。发明详述本申请的若干实施方案涉及与LRG5特异性结合的人源化抗体，以及用此类抗体抑制癌症干细胞(CSC)生长的方法。在一些实施方案中，抗体特异性结合LGR5但不抑制R-Spo与LGR5结合。其它实施方案包括结合LGR5而不抑制通过LGR5的R-Spo信号转导的抗体。而其它实施方案包括结合LGR5但不抑制通过LGR5的R-Spo结合或信号转导的抗体。另一实施方案是结合LGR5且还抑制通过Wnt通路的LGR5信号转导的抗体。在一些实施方案中，这些抗体可以抑制通过Wnt通路的LGR5信号转导，且独立于RSpo信号转导。其它实施方案包括使用上文描述的抗体抑制细胞或组织中LGR5或R-Spo信号转导的方法。LGR5通过谱系示踪研究被鉴定为肠中正常干细胞和肿瘤起始细胞的高度特异性标志物。之前鉴定了约150个基因，Wnt的表达废除之后淬灭了所述基因的表达。这些‘Wnt靶基因’的综合特性发现，LGR5在隐窝底部10-14种增殖的楔形细胞群体上选择性地表达。这些隐窝底部的柱状细胞之前被提议为候选的干细胞群体。使用可遗传的lacZ-LGR5报告基因进行体内谱系示踪，已证实了LGR5肠干细胞是多能的、自我更新的成体肠干细胞群体，其引起lacZ+后代细胞的不间断带状物，从隐窝底部开始并延伸至绒毛尖端。LGR5在CSC上的特异性表达，提供了选择性地且有效地靶向CSC的机会。相比于正常组织，LGR5在CRC肿瘤、胰腺肿瘤和大多数其它实体肿瘤中高度过表达，从而提供了靶向CRC癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和肝癌中CSC的广泛治疗窗口。LGR5本身是Wnt-Fzd-LRP受体复合物的兼性组分，其结合分泌的R-脊椎蛋白配体以选择性地放大并增强LGR5阳性细胞上的Wnt信号。还存在这样的证据：LGR5可以以Wnt非依赖性方式发信号。此外，相关的跨膜环形E3泛素连接酶ZNRF3(锌指和环指3)或RNF43(环指43)在LGR5+干细胞中独特地表达，并且通过选择性泛素化卷曲受体减弱Wnt信号，从而靶向这些Wnt受体用于降解。R-脊椎蛋白配体与LGR5相互作用，与跨膜ZNRF3或RNF43一起形成三元复合物。这些三元复合物的形成将ZNRF3或RNF43与Wnt-Fzd-LRP复合物隔绝，并且使经典和非经典的Wnt信号转导稳定。最后，Norrin被鉴定为LGR家族的另外配体，其相关的生物学未知。CRC的看门基因突变(gatekeepingmutation)是腺瘤样结肠息肉(APC)基因的丧失，导致Wnt信号转导的异常激活，所述APC通常调节结肠隐窝中干细胞自我更新和分化之间的平衡。肠干细胞中失调的Wnt信号转导，导致在结肠中形成腺瘤性息肉，所述腺瘤性息肉是恶性CRC的前体。采用将可诱导的APC基因敲除小鼠与LGR5干细胞被四种(GFP/YFP/ECFP/RFP)荧光遗传标志物之一特异性且随机地标记的小鼠杂交的策略，证实LGR5干细胞为这些小鼠肠道肿瘤的来源或根源。诱导APC缺失之后4周，单色肿瘤的出现(即，全部为GFP或全部为RFP)证实了这些肿瘤由单一LGR5干细胞引起。而且，该模型还允许LGR5干细胞中的荧光基因标签翻转为不同的颜色，以便产生红色肿瘤的RFP+LGR5癌症干细胞(CSC)可以在中途被转化为ECFP+LGR5癌症干细胞，仍接种肿瘤，但是此刻产生侵入先前均为红色的GFP+肿瘤团块的蓝色肿瘤细胞。该翻转实验不仅提供了进一步的证实：LGR5CSC是肠肿瘤的起源、能够启动并接种肠肿瘤的生长，而且它们连续地维持肿瘤形成(即，具有长期再生能力)。已通过核糖核酸干扰(RNAi)敲低研究，验证了LGR5在癌症中的功能作用。一组CRC肿瘤细胞系中LGR5的敲低，明显抑制了软琼脂集落体外的生长，还抑制了HCT116结肠肿瘤异种移植物在体内的生长。LGR5RNAi的敲低，随后显示还减弱了来自患者来源的CRC肿瘤细胞的CSC集落在体外的生长(数据未示出)。最后发现，分选的LGR5+患者来源的异种移植CRC肿瘤细胞，相比于对照LGR5-细胞在体内高度致瘤。CSC被认为是造成用外科手术和标准护理化疗进行治疗的许多癌症患者中肿瘤复发的发生率高的原因。例如，发现来自乳腺癌患者的CD44+CSC在化疗之后富集，且高水平的CSC与对化疗的不良临床应答相关。类似地，在转移性CRC中，LGR5表达在化疗后的受损肝脏中被上调，其暗示了响应化疗的LGR5CSC增加启动和/或恶化了转移性疾病。的确，已发现，相比于原发CRC肿瘤，LGR5表达在转移性位点明显更高。抗-LGR5抗体如本文所用，术语“抗体”包括但不限于，合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链Fv(scFv)、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)(包括双特异性sdFv)和抗-独特型(抗-Id)抗体、以及上述任一个的表位结合片段。本文提供的若干实施方案的抗体，可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或更大的多重特异性。多重特异性抗体可以对多肽的不同表位具有特异性，或者可以对多肽以及异源表位(如异源多肽或固体支持材料)具有特异性。参见，例如，PCT公开WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt,etal.,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利第4,474,893号；第4,714,681号；第4,925,648号；第5,573,920号；第5,601,819号；Kostelnyetal.,J.Immunol.148:1547-1553(1992)；将其各自通过引用整体并入本文。如本文所用，LGR5包括但不限于，人LGR5，所述人LGR5包括NCBI登录号NP_003658.1的多肽或其片段，其被NM_003667.2内的编码核苷酸序列或其片段编码。将NCBI登录号NP_003658.1的氨基酸序列和整个条目，以及NM_003667.2的核苷酸序列和整个条目通过引用整体完全并入。本文考虑的LGR5片段的实例，包括LGR5的胞外域、跨膜结构域或胞内结构域以及以上的一部分。若干实施方案涉及产生抗-LGR5抗体的轻链和/或重链的杂交瘤，所述抗-LGR5抗体包括在下文的实施例中产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的抗-LGR5抗体。在一个方面，杂交瘤产生人源化单克隆抗体或全人单克隆抗体的轻链和/或重链，如在下文的实施例中产生和描述的18G7H6A3和18G7H6A1的轻链和/或重链。一些实施方案涉及编码抗-LGR5抗体的轻链或重链的核酸分子，所述抗-LGR5抗体包括在下文的实施例中产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的抗-LGR5抗体中的任一种。在一些方面，核酸分子编码人源化或全人单克隆的轻链或重链，如在下文的实施例中产生和描述的抗体18G7H6A3和18G7H6A1。多种实施方案涉及包含编码抗-LGR5抗体的轻链和/或重链的核酸分子的载体，所述抗-LGR5抗体包括在下文的实施例中产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的抗-LGR5抗体中的任一种。在多种实施方案中，可以修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以，例如，增加抗体对靶抗原的亲和力。此类碳水化合物的修饰，例如可以通过改变抗体序列内一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸的置换，其导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除所述位点处的糖基化。这样的无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这样的方法进一步详细描述于美国专利第5,714,350号和第6,350,861号；将其各自通过引用整体并入本文。在若干实施方案中，抗体特异性结合包含下述LGR5多肽或由下述LGR5多肽组成的多肽，该LGR5多肽与NCBI登录号NP_003658.1(SEQIDNO:47)的人LGR5多肽或其片段具有至少60％同一性、或至少70％同一性、或至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或至少至少97％同一性、或至少99％同一性、或100％同一性。这样的片段可以是，例如，所述LGR5多肽的至少约5个、10个、15个、20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个或900个连续或非连续的氨基酸，或者任意前述长度之间任意数量的连续或非连续氨基酸。在若干实施方案中，抗体是抗体18G7H6A3，并且包含重链氨基酸序列SEQIDNO:13和DNA序列SEQIDNO:11。在一些实施方案中，抗体是抗体18G7H6A3，并且具有包含SEQIDNO:19的重链可变结构域。在若干实施方案中，抗体是抗体18G7H6A3，并且包含轻链序列SEQIDNO:14。在其它实施方案中，抗体是抗体18G7H6A3，并且包含轻链可变结构域SEQIDNO:21。在一些实施方案中，抗体包含这样的序列，其与上述序列中的序列具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，抗体包含这样的序列，其与上述序列的重链、轻链或可变结构域的29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117或118个残基范围的抗体序列具有100％同一性。在一些实施方案中，抗体包含这样的序列，其与抗体序列具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，抗体包含这样的序列，其与抗体序列具有84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，抗体包含这样的序列，其与33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110或111个残基范围的抗体序列具有100％同一性。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体包含含有GYSFTAYW(SEQIDNO:23)的重链CDRl、含有ILPGSDST(SEQIDNO:2)的重链CDR2以及含有ARSGYYGSSQY(SEQIDNO:3)的重链CDR3。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体包含含有ESVDSYGNSF(SEQIDNO:4)的轻链CDRl、含有LTS的轻链CDR2以及含有QQNAEDPRT(SEQIDNO:33)的轻链CDR3。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体包含：(a)包括含1个、2个、3个或4个氨基酸置换的上述序列变体的重链CDRl。抗体还可以包含这样的重链CDR2，其具有含1个、2个、3个或4个氨基酸置换的变体。抗体还可以包含这样的重链CDR3，其具有含1个、2个、3个或4个氨基酸置换的变体。除重链的这些修饰之外，抗体还可以包含这样的轻链CDRl，其具有含1个、2个、3个或4个氨基酸的变体。抗体还可以包含这样的轻链CDR2，其具有含1个、2个、3个或4个氨基酸置换的变体。抗体还可以包含这样的轻链CDR3，其具有1个、2个、3个或4个氨基酸置换。在一些实施方案中，所述氨基酸的置换是保守的氨基酸置换。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体包括含有与所附序列表中本文所描述的序列具有至少80％或90％序列同一性的重链可变区的抗体。所述抗体还可以包括与本文所描述的抗体序列具有至少80％或90％序列同一性的轻链可变区。例如，通过以最佳比较为目的进行序列比对，可以测定两条氨基酸序列(或两条核酸序列)的百分比同一性(例如，可将空位引入第一序列的序列中)。然后比较对应位置处的氨基酸或核苷酸，以及两条序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同位置的#/位置的总#×100)。通过熟知的方法，例如，利用数学算法可以实现两条序列的实际比较。这样的数学算法的具体非限制性实例描述于Karlinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993)，将其通过引用整体并入本文。如Schafferetal.,NucleicAcidsRes.,29:2994-3005(2001)中所描述将这样的算法并入BLASTN和BLASTX程序(版本2.2)，将其通过引用整体并入本文。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各程序(例如，BLASTN)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov，提供于2002年4月10日。在一个实施方案中，搜索的数据库是非冗余(NR)数据库，以及用于序列比较的参数可被设置在：无滤过；预期值为10；字大小为3；矩阵为BLOSUM62；以及空位存在罚分为11和空位延伸罚分为1。若干实施方案还涵盖了上述抗体的变体，所述抗体包括在下文的实施例中产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的抗-LGR5抗体中的任一种，所述变体在可变轻链(VL)结构域和/或可变重链(VH)结构域中包含一个或多个氨基酸残基的置换。若干实施方案还涵盖了在一个或多个VLCDR和/或一个或多个VHCDR中具有一个或多个另外的氨基酸残基置换的上述抗体的变体。通过在上述抗体的VH结构域、VHCDR、VL结构域和/或VLCDR中引入置换所产生的抗体，可以在体外或体内进行测试，例如，关于其结合LGR5的能力(通过，例如，包括但不限于ELISA和BIAcore的免疫分析)。多种实施方案包括与LGR5特异性结合的抗体，其包含与LGR5特异性结合的抗-LGR5抗体的VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR的衍生物，如在下文的实施例中产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的抗-LGR5抗体的任一种。可以使用本领域技术人员已知的标准技术，在编码抗体的核苷酸序列中引入突变(例如，添加、缺失和/或置换)，包括例如，通常将定点诱变和PCR介导的诱变用来产生氨基酸置换。在一个实施方案中，相对于最初的VH和/或VLCDR，所述VH和/或VLCDR衍生物包含少于25个氨基酸的置换、少于20个氨基酸的置换、少于15个氨基酸的置换、少于10个氨基酸的置换、少于5个氨基酸的置换、少于4个氨基酸的置换、少于3个氨基酸的置换、或少于2个氨基酸的置换。在另一实施方案中，所述VH和/或VLCDR衍生物具有保守的氨基酸置换(例如同上)，所述置换在一个或多个预测的非必需氨基酸残基(即，对抗体与LGR5的特异性结合不关键的氨基酸残基)处进行。可选地，诸如通过饱和诱变，可以将突变随机地引入全部或部分VH和/或VLCDR编码序列内，以及可针对生物学活性对得到的突变体进行筛选以鉴定保留活性的突变体。诱变之后，即可表达编码的抗体，并且可以测定该抗体的活性。若干实施方案还涵盖了与LGR5或其片段特异性结合的抗体，所述抗体包含这样的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列，其与本文所描述的任意抗体中任一种的可变重链和/或轻链具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性，本文所描述的抗体包括抗-LGR5抗体(包括在下文的实施例中产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的那些)。另一实施方案包括在抗-LGR5抗体(如在下文的实施例中产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的抗-LGR5抗体中的任一种)的任意部分引入保守的氨基酸置换。本领域熟知的是，“保守的氨基酸置换”指这样的氨基酸置换：其置换了功能等同的氨基酸。保守的氨基酸变化导致所得肽的氨基酸序列的沉默变化。例如，具有相似极性的一个或多个氨基酸作为功能等同物，并且导致肽的氨基酸序列内的沉默改变。电荷中性且残基被较小的残基替代的置换，也可以被认为是“保守的置换”，即使残基在不同的分组中(例如，用较小的异亮氨酸替代苯丙氨酸)。本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。表1中显示了保守的氨基酸置换的若干家族。表1家族氨基酸非极性Trp、Phe、Met、Leu、Ile、Val、Ala、Pro不带电荷的极性Gly、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys酸性/负电荷Asp、Glu碱性/正电荷Arg、Lys、Hisβ-分枝Thr、Val、Ile影响链取向的残基Gly、Pro芳香族Trp、Tyr、Phe、His用抗-LGR5抗体阻断癌症干细胞生长若干实施方案涉及在体外和体内用抗-LGR5抗体阻断癌症干细胞生长。在一些实施方案中，阻断癌症干细胞生长的方法包括向癌症干细胞施用有效量的抗-LGR5抗体，其中该有效量的抗-LGR5抗体足以减少癌症干细胞的生长。在一些实施方案中，阻断癌症干细胞生长的方法包括向癌症干细胞施用有效量的抗-LGR5抗体，其中该有效量的抗-LGR5抗体足以减少或阻断癌症干细胞的增殖，或者减少或阻断癌症干细胞的生长。在一些方面，向体外的癌症干细胞施用有效量的抗-LGR5抗体。在其它方面，在体内，向需要此治疗的患者中的癌症干细胞施用有效量的抗-LGR5抗体。在若干实施方案中，将针对LGR5的抗体用于抑制LGR5信号转导而不抑制R-Spo与LGR5结合的方法中。在若干实施方案中，将针对LGR5的抗体用于抑制LGR5信号转导而不抑制通过LGR5的R-Spo信号转导的方法中。在若干实施方案中，将针对LGR5的抗体用于抑制LGR5信号转导而不抑制通过LGR5的R-Spo与LGR5结合或R-Spo信号转导的方法中。在若干实施方案中，将针对LGR5的抗体用于抑制通过Wnt的LGR5信号转导的方法中。在若干实施方案中，将针对LGR5的抗体用于抑制独立于RSpo信号转导的通过Wnt的LGR5信号转导的方法中。如本文所用，术语“癌症干细胞”指可以广泛或无限地增殖并引起癌症中大比例的癌细胞的细胞。在一些方面，大比例的癌细胞代表给定癌症中癌细胞的大多数。出于示例但不限制的目的，癌症干细胞可以是肿瘤的创建者或者癌细胞的祖细胞，所述癌细胞包括大部分癌肿块。在一些方面，癌症干细胞指这样的细胞：当其被植入免疫功能低下个体时，在细胞无任何另外突变或未引入外源细胞增殖诱导剂或致癌剂的情况下，能分裂形成一个或多个肿瘤的细胞。在一些方面，癌症干细胞分裂产生另外的癌症干细胞以及最终分化的癌细胞或癌组织。在一些实施方案中，癌症干细胞的生长、增殖或活力受阻，而不干扰LGR5-RSpo结合或信号转导。在一些实施方案中，癌症干细胞的生长、增殖或活力受阻，而不通过阻断或抑制通过Wnt的LGR5信号转导来干扰LGR5-RSpo结合或信号转导。如关于阻断癌症干细胞的生长所使用的，术语“有效量”指足以将癌症干细胞的生长降低任何程度的抗-LGR5抗体的量。本领域已知的任何分析可被用来测量癌症干细胞的生长。例如，可以通过集落数、总细胞数或细胞群体或集落的体积/大小来测量癌症干细胞的生长。在若干实施方案中，可以通过下文实施例1中所描述的肿瘤球生长分析来测量癌症干细胞生长。在某些实施方案中，有效量的抗-LGR5抗体可以阻断癌症干细胞的生长，如所测量的，癌症干细胞群或肿瘤球的生长减少至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或者任意前述数目之间的任意百分比。在一些方面，抗-LGR5抗体是在下文实施例中产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的抗-LGR5抗体中的任一种或组合。例如，在一些实施方案中，有效量的抗-LGR5抗体可以阻断癌症干细胞的生长，如所测量的，癌症干细胞群或肿瘤球的生长减少至少约5％-99％、5％-80％、5％至40％、10％至99％、10％至80％、10％-60％、10％-40％、20％至99％、20％-80％、20％-60％、20％-40％、50％-98％、50％-80％或60％-99％。在一些方面，抗-LGR5抗体是在下文实施例中产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的抗-LGR5抗体中的任一种或组合。在其它实施方案中，有效量的抗-LGR5抗体可以阻断癌症干细胞生长，如所测量的，癌症干细胞群或肿瘤球的生长减少至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、200倍或1000倍，或者任意前述数目之间的任意倍数。在一些方面，抗-LGR5抗体是在下文实施例中所产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的抗-LGR5抗体中的任一种或组合。在一些实施方案中，足以将癌症干细胞的生长阻断至上述任意程度的有效量的抗-LGR5抗体，其浓度是约1nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、500nM、550nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、50μM、75μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、500μM、550μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、75mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM、1M、5M、10M、15M、20M、25M、30M、35M、40M、45M、50M、75M、100M，或前述任意两个浓度之间的任意数。在一些方面，抗-LGR5抗体组合物可以包含在下文实施例中所产生和描述的被定名为18G7H6A3和18G7H6A1的抗体二者。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体结合人LGR5所具有的KD为：小于约200nM、小于约100nM、小于约80nM、小于约50nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约1nM，以及任意前述值之间的范围内。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体结合LGR5所具有的亲和力为：小于约10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM，以及任意前述值的范围内。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体结合LGR5所具有的亲和力为：大于约0.0001nM、0.001nM、0.01nM，以及任意前述值的范围内。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体与这样的表位结合，所述表位包含下述氨基酸或由下述氨基酸组成、或者在下述氨基酸以内：SEQIDNO:47的氨基酸T175、E176、Q180、R183、S186、A187、Q189、D247、E248、T251、R254、S257、N258、K260。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体与这样的表位结合，所述表位包含富亮氨酸重复6-9，或者由富亮氨酸重复6-9组成，或者在富亮氨酸重复6-9内(参见例如，Chenetal.genesDev.27(12):1345-50，将其通过引用整体并入)。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体与这样的表位结合，所述表位包含LGR5胞外结构域的凸面，或者由LGR5胞外结构域的凸面组成，或者在LGR5胞外结构域的凸面内(参见例如，Chenetal.genesDev.27(12):1345-50，将其通过引用整体并入)。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体不明显破坏R-脊椎蛋白(RSPO)蛋白与LGR5结合。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体不结合RSPO-LGR5结合的位点。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体不与RSPO竞争结合LGR5。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体不明显地破坏RSPO激活Wnt信号转导。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体能破坏LGR5-RSPO-RNF43复合物的形成。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体能破坏LGR5-RSPO-ZNRF3复合物的形成。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体能破坏LGR5-RSPO-LRP6复合物的形成。在一些实施方案中，RSPO可以包括R-脊椎蛋白-1(RSPO1)、R-脊椎蛋白-2(RSPO2)、R-脊椎蛋白-3(RSPO3)和R-脊椎蛋白-4(RSPO4)。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体能破坏LGR5-NORRIN-RNF43复合物的形成。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体能破坏LGR5-NORRIN-ZNRF3复合物的形成。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体能破坏LGR5-NORRIN-LRP6复合物的形成。一些实施方案包括抑制细胞中Wnt/β-连环蛋白信号转导的方法。更多的实施方案包括抑制细胞中NF-κB信号转导的方法。前述方法中的一些可包括使细胞与本文提供的有效量的抗-LGR5抗体接触。在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以包括结肠直肠肿瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或胰腺肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞可以表达升高水平的LGR5蛋白。在一些实施方案中，本文提供的抗-LGR5抗体，例如，通过减少癌症干细胞的数目和/或频率来抑制肿瘤细胞的生长。一些实施方案包括治疗癌症的方法，所述方法包括对有此需要的对象施用治疗有效量的本文提供的抗-LGR5抗体。在一些实施方案中，所述癌症选自：胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌和乳腺癌(如三阴性乳腺癌)。在一些实施方案中，结肠直肠癌包含腺瘤样结肠息肉(APC)基因中的失活突变、不包含APC基因中的失活突变、或者包含野生型APC基因。在一些实施方案中，癌症是。在一些实施方案中，癌症包含LGR5蛋白的水平升高。在一些实施方案中，癌症是表达LGR5水平升高的结肠癌。在一些实施方案中，癌症是表达LGR5水平升高的胰腺癌，在一些实施方案中，癌症是表达LGR5水平升高的乳腺癌。一些实施方案包括治疗对象中的疾病的方法，其中所述疾病与β-连环蛋白的激活和/或异常的β-连环蛋白信号转导相关。一些实施方案包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本文提供的抗-LGR5抗体。一些实施方案包括治疗疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文提供的抗-LGR5抗体与至少一种另外的治疗剂联合施用至有此需要的对象。在一些实施方案中，另外的治疗剂包含化疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂包含生物剂。一些实施方案包括将本文提供的抗-LGR5抗体与化疗剂和生物剂联合施用。在一些实施方案中，将本文提供的抗-LGR5抗体与化疗剂联合施用，可以增加癌症如肿瘤中LGR5的表达水平。本文提供的方法的一些实施方案包括测定肿瘤或癌症中的LGR5蛋白表达的水平。本文提供的方法的一些实施方案包括鉴定用本文提供的抗-LGR5抗体进行治疗的对象。一些实施方案包括确定对象是否具有这样的肿瘤：相比于正常组织中相同LGR5蛋白的表达，所述肿瘤包含升高表达水平的LGR5。一些实施方案包括：如果肿瘤具有升高的LGR5表达水平，则选择对象用于进行治疗。一些实施方案还包括确定对象是否具有包含APC基因失活突变的肿瘤。一些实施方案还包括：如果肿瘤包含APC基因的失活突变，则选择对象用于进行治疗。与上文相关的方法、组合物和相关公开提供于，例如，2013年5月10日出版的PCT公开第WO2013/067055号(将其内容通过引用整体在此并入)，以及例如2013年5月10日出版的PCT公开第WO2013/067054号(将其内容通过引用整体在此并入)，以及例如2013年5月10日出版的PCT公开第WO2013/067057号(将其内容通过引用整体在此并入)，以及例如2013年5月10日出版的PCT公开第WO2013/067060号(将其内容通过引用整体在此并入)。试剂盒本文提供的一些实施方案包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以包括本文提供的人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是冻干的。在一些实施方案中，抗体是水溶液。在一些实施方案中，试剂盒包含用于施用抗体的药学载体。在一些实施方案中，试剂盒还包含化疗剂。在一些实施方案中，化疗剂选自：亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康、吉西他滨和Abraxane。虽然出于阐述和理解的目的已详细描述了本发明的实施方案，但是本领域技术人员将了解，在不脱离本发明的真实范围的情况下，可以在形式和细节上做出各种改变。实施例已大体描述的实施方案涉及针对LGR5的抗体，表达此类抗体的杂交瘤或其它细胞系，编码此类抗体的核酸以及包含编码此类抗体的核酸的载体，以及用此类抗体阻断癌症干细胞生长的方法，通过参照仅出于示例性目的提供的且不是旨在限制的某些具体实施例，可以获得进一步理解。实施例1-LGR5抗体的人源化将人种系序列用作受体框，用于使鼠源抗体18G7.1人源化。为了找到最接近的种系序列，通过NCIIgBLAST(ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)在种系序列数据库中鉴定最类似表达的轻链和最类似的重链。在该搜索中，将18G7.1的CDR序列掩蔽。最合适表达的序列的选择，包括核对经典残基和界面残基的序列同一性，以及核对CDR环长度的类似性。为了鉴定候选人源化序列和亲代鼠源单克隆抗体18G7.1之间关键结构框残基中潜在的结构冲突，生成三维模型。抗体结构的合成用来产生具有移植的候选人源化序列的同源模型，之后进行分子能量最小化。利用计算机软件Pymol进行的结构分析，被用来鉴定可能潜在地负面影响正确折叠的残基。从该分析，构建了六条候选VH链，其包括：i)功能性人框架，基于对折叠的可能影响的分析，所述人框架在候选的人源化框架区内含有所选择的置换，和ii)亲代的18G7.1鼠源抗体CDR(SEQIDNO:1、2和3)。人IgG1恒定区的框内融合是化学合成的。类似地，构建了两条候选VL链，其包括：1)功能性人框架，基于对折叠的可能影响的分析，所述人框架在候选的人源化框架区内含有所选择的置换，和ii)亲代的18G7.1鼠源抗体CDR(SEQIDNO:4、5和6)。候选VL链和候选VH链与人IgG1恒定区的框内融合是化学合成。通过共转染进哺乳动物细胞，测试所选择的候选变体人源化重链和轻链组合的功能性。将上文描述的六条候选的人源化18G7.1重链，各自与候选的18G7.1轻链之一一起共转染进HEK293细胞，以及针对LGR5抗原结合活性，通过流式细胞术来分析条件培养物。此外，将上文描述的三条候选的人源化18G7.1重链，与第二候选18G7.1轻链一起共转染进HEK293细胞，以及针对LGR5抗原结合活性，通过流式细胞术来分析条件培养物。针对亲和力成熟，选择被称为18G7H6且呈现最稳健结合的18G7.1候选重链/轻链的组合(人源化变体)。实施例2-人源化LGR5抗体的亲和力成熟为了增加选择的人源化变体18G7H6的亲和力，采用丙氨酸扫描诱变和饱和诱变的组合。将重链CDR1和轻链CDR1和CDR3中的残基突变为丙氨酸，将其转染进HEK293细胞，以及针对LGR5抗原结合活性，通过流式细胞术来分析合成的条件培养物。对重链CDR3进行饱和诱变，其中除了在所述位置处最初相同的氨基酸之外，CDR3中的每一残基被突变为19种天然氨基酸中的每一种。将各种突变体转染进HEK293细胞，以及针对LGR5抗原结合活性，通过流式细胞术来分析合成的条件培养物。将这些突变以渐增的数量并入3种构建体。然后将这三种构建体转染进HEK293细胞，以及针对LGR5抗原结合活性，通过流式细胞术来分析合成的条件培养物。选择两种构建体18G7H6A1和18G7H6A3用于进一步表征。表1A列出了抗体的某些序列。表1A实施例3-人源化LGR5抗体的产生构建了用于18G7H6A1、18G7H6A3和嵌合18G7.1(来自18G7.1的鼠源Fab与人IgG1Fc的融合)的名为18G7Ch的GS单基因载体，扩增并利用用于表达评价的瞬时转染以200ml体积来瞬时共转染进中国仓鼠卵巢细胞(CHOK1SVGS-KO)。然后针对18G7CH启动5升最终体积以及针对18G7H6A1和18G7H6A3为2.5升最终体积的CHOK1SVGS-KO细胞大规模瞬时转染。利用一步法蛋白A层析纯化透明的培养上清液。使用浓度1mg/ml的纯化材料(包括作为对照样本的自身人抗体)，进行SE-HPLC、SDS-PAGE和内毒素测量形式的产物质量分析。结果显示高纯度的回收产物(>95.7％)。实施例4-构建人源化LGR5抗体的细胞系通过用表达载体p18G7H6A3/DGV转染CHOK1SVGS-KO宿主细胞，来产生表达18G7H6A3抗体的稳定GS-CHO转染子库。构建含有编码抗体的基因的DGV，进行转染以及随后利用FACS方法通过对转染子库进行单细胞分选来产生合成的克隆细胞系。针对存在的单集落，对克隆期间产生的96孔板进行一周一次筛选。大约2周之后，利用System方法，针对抗体的产生，对来自1000个以上集落的上清液进行筛选。在筛选的1000个集落中，991个产生可检测的抗体水平。将Octet数据排列，并选择最高的生产集落用于后续研究。将排位最高的集落进一步在96深孔板中于CDCHO培养基悬浮培养，随后使其适应传代培养基。使用尽可能接近模拟生物反应器过程的给料方案，进行所选择细胞系的生产力测定。在第12天收获培养物，并利用System方法分析抗体浓度。收获的抗体浓度范围从<20mg/L至3000mg/L。基于生产力筛选的排位、该细胞系所源自的亲代库以及各细胞系由单克隆产生的证据，选择20个细胞系用于进一步评价。通过连续的传代，将20个所选择细胞系的培养物从96深孔板扩增至摇瓶。基于在‘简化的’分批补料悬浮培养中生产力筛选的排位，以及在摇瓶培养中常规传代期间具有可接受的生长性质(常规传代培养每mL始终≥1x106个活细胞)，在两个10L实验室规模的搅拌釜生物反应器中，选择排前头的细胞系用于进行评价。在常规传代期间，该排前头的细胞系表现出一致的高生长和活力，并且在收获时具有>2000mg/L的滴度。该细胞系被用于产生原始细胞库(MCB)，并且用于在10L实验室规模的生物反应器中进行评价。实施例5-人源化LGR5抗体与人LGR5结合使用基于FACS的分析来测量纯化的18G7H6A1和18G7H6A3与CHO细胞表面上过表达的重组人LGR5的结合。于4℃，用连续稀释的18G7H6A1或18G7H6A3对CHO和CHO-LGR5细胞进行染色，用缀合有PE的抗人IgG二抗检测表面染色，并在FACScalibur上进行分析。18G7H6A1和18G7H6A3对人LGR5结合的EC50<10nM。将抗体对照(MOPC)以及无LGR5的野生型CHO，用作该实验中的阴性对照。18G7H6A3显示不与野生型CHO结合，以及同种型对照未显示与人LGR5的任何可测量结合。为了鉴定用于研究18G7H6A3的疗效和安全性的潜在动物模式物种，在一系列体外结合研究中，测定18G7H6A3与由同源物种表达的LGR5的交叉反应。参见图1，如所示，发现抗体18G7H6A3(BNC101)与人LGR5和猕猴LGR5强烈地结合，但不与大鼠或小鼠LGR5结合。实施例6-人源化LGR5抗体与包被板的重组体人LGR5胞外域的结合使用基于ELISA的板结合分析，体外评估18G7H6A1和18G7H6A3与人LGR5的结合。该分析测量了抗体与包被ELISA板的纯化重组体LGR5胞外域-IgG-Fc融合体的结合，用缀合有辣根过氧化酶的抗人IgG-CH1二抗检测结合LGR5的抗体。发现18G7H6A3对人LGR5-Fc的EC50是300pM。实施例7-人源化LGR5抗体对肿瘤细胞的结合性质通过流式细胞术分析18G7H6A3与表达不同水平LGR5的人癌细胞系的结合性质，以明确18G7H6A3对异源肿瘤群的潜在靶向特性。通过流式细胞术定量多种肿瘤细胞系中LGR5的表达水平。在这些研究中分析的人肿瘤细胞系，包括结肠癌癌细胞系(CT1(Bionomics)、CT3(Bionomics)、DLD1(ATCC)、Ls174T(ATCC)、LoVo(ATCC)、SW48(ATCC)、SW480(ATCC)、SW620(ATCC)和HCT116(ATCC))，三阴性乳腺癌细胞系(Hs578T(ATCC)和MDA-MB-231(ATCC))，胰腺癌细胞系(AsPC-1(ATCC)、BxPC3(ATCC)、Capan2(ATCC)、HPAFII(ATCC)、SW1990(ATCC)、CFPAC(ATCC)、Panc10.05(ATCC)和PANC-1(ATCC))，顺铂敏感的卵巢癌细胞系(OVCAR3(ATCC)和SK-OV-3(ATCC))，耐顺铂的卵巢癌细胞系(SK-OV-3/CP、OVCAR8/CP、Igrov1/CP和A2780/CP(TGEN))，以及肺腺癌细胞系HOP62(ATCC)。用TrypLE细胞解离缓冲液(LifeTechnologies)消化生长接近汇合的细胞，计数并以每孔1x105个细胞接种在V形底的96孔板上。测试18G7H6A3，以100nM起始浓度在染色缓冲液(PBS/0.8％牛血清白蛋白)中连续稀释。将样本在冰上孵育30分钟，然后于4℃、1800rpm离心2分钟，并用染色缓冲液洗涤3次。向含染色缓冲液的各对应孔添加50μl以1:250稀释的二抗山羊抗人IgG-PE缀合物(SouthernBiotech)。将样本在冰上孵育另外15分钟，然后如上所述进行洗涤，并悬浮于含有碘化丙啶(PI)(LifeTechnologies)的100μl染色缓冲液，用于排除死细胞。使用CellQuest(BectonDickinson)和FlowJo(TreeStar,Inc)软件，在FACScalibur流式细胞仪上分析样本。通过流式细胞术来定量多种肿瘤细胞系中LGR5的细胞表面表达水平。CT1结肠直肠肿瘤细胞和胰腺癌细胞系Panc-1、Capan2和CFPAC是最高的LGR5表达子。在胰腺癌细胞系(AsPC-1、SW1990、HPAFII)、耐顺铂的卵巢癌细胞系(OVCAR8/CP、A2780/CP和Igrov1/CP)，以及结肠、乳腺和卵巢癌细胞系(SW48、Hs578T和OVCAR3)中观察到中度表达水平。在结肠(SW480、LoVo)和乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)中观察到低但可检测的LGR5细胞表面表达水平。表2总结了18G7H6A3FACS与肿瘤细胞系结合的数据。表2实施例8-通过人源化抗-LGR5抗体在体内抑制恶病结肠直肠肿瘤的生长CT1原发CRC异种移植模型，源自IV期转移性结肠癌患者。对该肿瘤进行的DNA测序鉴定了常见的结肠癌多种基因的突变，包括K-Ras、PI3K、PTEN、p53和APC。在第0天，将在无血清条件的培养基中维持的低传代CT1肿瘤球，在基质胶(Matrigel)中皮下注射SCID/Bg小鼠，并且每周两次监测肿瘤的大小和体重。在第25天，当肿瘤达到120mm3时，将CT1皮下肿瘤随机分配为10只小鼠的组。用PBS、抗体对照MOPC、18G7H6A1、18G7H6A3或人/鼠嵌合18G7Ch处理小鼠。以15mg/kg的剂量将BIW给予小鼠，持续2.5周(总共5次剂量)。4次剂量(15mg/kg，每周两次)的过程中，相比于PBS和MOPC抗体对照，抗体18G7H6A3显示显著的体内抗肿瘤活性。尽管抗体18G7H6A1显示抗肿瘤活性，但单克隆18G7H6A3显示优于18G7H6A1和亲代鼠源嵌合18G7Ch抗体二者的活性。表3显示了1-4次剂量的Lgr5+Ab之后，CT1肿瘤体积减小的百分比(相对MOPC的组)。表3剂量#:123418G7Ch9.2％30.6％19.5％29.0％18G7H6A117.5％19.1％14.2％19.0％18G7H6A338.8％42.0％28.9％35.4％实施例9-通过人源化抗-LGR5抗体在体内抑制结肠直肠肿瘤的生长CT3原发CRC异种移植模型源自III期mCRC患者，在K-Ras、H-Ras、APC、PI3K、PTEN、STK11、RB1、TP53、FGFR2、VANGL2和ISCO有突变。将低传代冷藏保存的CT3原发异种移植肿瘤片段植入5只SCID/Bg小鼠内。在植入后41天，从五只携带CT3原发异种移植物的SCID小鼠移出平均合并为～1150mm3的肿瘤，进行解离并在基质胶中皮下再植入CB.17SCID小鼠，每周两次监测肿瘤的大小和体重。当肿瘤达到130mm3的平均值时，将小鼠随机分配(植入后34天)。用PBS、抗体对照MOPC、18G7H6A3、18G7H6A1或人/鼠嵌合18G7Ch处理小鼠。以15mg/kg的剂量将BIW给予小鼠，持续2.5周(5次剂量)，其开始于第34天。每周两次，监测所有小鼠的体重和肿瘤大小，以及整体健康和外观，直到结束。在4次剂量(15mg/kg，每周两次)之后，相比于PBS和MOPC抗体对照，尽管抗体18G7H6A1显示抗肿瘤活性，但单克隆18G7H6A3显示显著的抗肿瘤活性。18G7H6A3显示优于亲代鼠源嵌合18G7Ch抗体的活性，以及与18G7H6A1等同的活性。表4显示了在n次剂量的测试Ab之后，CT3肿瘤体积减小的百分比(相对MOPC的组)。表4Ab剂量#:123418G7Ch22.6％8.9％17.0％13.8％18G7H6A118.3％12.6％28.8％28.7％18G7H6A334.2％38.1％23.4％28.2％实施例10-通过人源化抗-LGR5抗体与FOLFIRI联合在体内抑制结肠直肠肿瘤的生长用在CSC条件下生长的CT3细胞植入CB.17SCID小鼠。在植入后40天，当肿瘤达到～160mm3时，将小鼠随机分配进治疗组，所述治疗组包括：i)PBS；ii)FolFiri(5FU30mg/kg、甲酰四氢叶酸90mg/kg和伊立替康24mg/kg)，每5天给药一次，持续15天(总共3次剂量)；以及iii)FolFiri(如在ii中)和18G7H6A3的组合(15mg/kg，每周两次)。肿瘤体积的分析显示，相比于FolFiri方案，18G7H6A3和FolFiri的组合减弱了CT3肿瘤的生长。在61天、65天、68天、71天和75天，组合治疗将肿瘤体积分别减小了约58％、53％、45％、33％和37％(图2)。实施例11-通过人源化抗-LGR5抗体在体内抑制胰腺癌肿瘤的生长为了评估18G7H6A3作为单一药剂或与标准护理联合的功效，测试了胰腺癌异种移植模型。用AsPC-1细胞(在1:1比例的基质胶+RPMI中)植入CB17.SCID小鼠。在植入后20天，将肿瘤随机分为5组：i)PBS；ii)MOPC(15mg/kg，每周两次，ip)；iii)18G7H6A3(15mg/kg，每周两次，ip)；iv)吉西他滨(90mg/kg，每周两次，ip)；以及v)吉西他滨和18G7H6A3以上述剂量并行联合。据发现，在植入后第41天，相比于盐水和/或对照IgG，作为单一药剂的18G7H6A3抑制肿瘤的生长多至近40％。此外，相比于单独的吉西他滨，18G7H6A3和吉西他滨的组合显著地抑制AsPC-1模型中的肿瘤生长(植入后第61天，多至36％)。直到第65天，相比于PBS和对照IgG，作为单一药剂的18G7H6A3还提供肿瘤生长的一些抑制。实施例12-通过人源化抗-LGR5抗体在体内抑制三阴性乳腺癌肿瘤的生长使用低传代三阴性乳腺癌细胞(ER-、PR-、无HER2过表达)进行该体内研究。将MDA-MB-231-LM3细胞在具有DMEM/10％FBS/抗-抗培养基的贴壁培养物中维持。在第0天，用在RPMI:基质胶(1:1)中的MDA-MB-231-LM3细胞注射CB.17SCID小鼠，进入第4乳腺脂肪垫，并且每周两次监测肿瘤大小和体重。在第27天，当肿瘤达到～155mm3时，将MDA-MB-231-LM3肿瘤随机分为4组10只小鼠的组。用PBS、抗体对照MOPC或18G7H6A3处理小鼠。以15mg/kg的剂量将BIW给予小鼠，持续3.5周(7次剂量)。据发现，相比于PBS(60.7％肿瘤生长抑制)或MOPC抗体(49.3％肿瘤生长抑制)对照，抗体18G7H6A3显示显著的抗肿瘤活性(图3)。实施例13-在用SN38或PI3K/mTOR抑制剂处理的结肠直肠癌细胞中诱导LGR5表达用PI3K/mTOR双重抑制剂(NVP)或2种不同的细胞毒素剂(包括SN38(伊立替康的活性代谢物)或5FU(5氟尿嘧啶))处理一组CRC细胞系(包括DLD1、HCT116、LS174t、LoVo、SW48、SW480和SW620)。用1μM的上述药剂处理细胞，并且在72小时后收获。然后用与AlexaFluor647缀合的抗-LGR5Mab对细胞进行染色，并利用FACScalibur通过流式细胞术分析数据。对CRC细胞系进行的流式细胞术分析表明，当用PI3K/mTOR抑制剂处理时，在LoVo、HCT116、LS174t、SW48、SW480和SW620细胞中LGR5的表达较多。另外，用SN38进行的处理促进HCT116、LS174t、SW48、SW480以及特别是SW620细胞中LGR5的表达。然而，5FU的处理不诱导任意这些细胞系中LGR5的表达，其暗示了调控LGR5表达的背后机制在这些细胞系中不同。这些数据表示，LGR5+细胞对用上述药剂进行的处理具有更大的抗性，因为处理主要地靶向LGR5阴性的非癌症干细胞群体。为了理解用这些药剂进行的处理是否上调了这些细胞上LGR5的表达，我们通过流式细胞术分析了所有细胞系中LGR5的细胞表面表达。当用PI3K/mTOR抑制剂进行处理时，LGR5表达在LoVo中明显地上调。这些数据表明，用小分子抑制剂或细胞毒素剂进行的处理靶向LGR5阴性细胞，并且引起这些细胞中LGR5的表达增加。实施例14-在用小分子抑制剂或细胞毒素剂处理的胰腺癌细胞系中LGR5的表达被促进除进一步延伸上述发现的CRC细胞系之外，在用以下处理的一系列胰腺细胞系中研究了LGR5的表达：相关的标准护理(包括白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、吉西他滨和紫杉酚)和靶向胰腺癌中大部分相关通路的小分子抑制剂(如PI3K、MEK和GSK3β的抑制剂)。测试的胰腺细胞系包括：AsPc1、HPAFII、PANC1、BxPC3、CFPAC、PANC10.05、Capan2和SW1990。如通过流式细胞术所评估，用白蛋白结合型紫杉醇进行的处理，导致PANC1、BxPc3和PANC10.05中LGR5的上调。吉西他滨的处理上调了PANC1中的LGR5，以及紫杉酚的处理导致HPAFII中LGR5的表达增加。PI3K/mTOR的处理导致CFPAC中LGR5的上调，以及MEK抑制剂上调了HPAFII和SW1990中的LGR5。实施例15-在用FOLFIRI方案(5FU、甲酰四氢叶酸和伊立替康)处理的结肠直肠癌肿瘤中LGR5被上调为了研究化疗处理是否改变了结肠直肠肿瘤中LGR5的表达，每5天用5FU(30mg/kg，i.p)、甲酰四氢叶酸(90mg/kg)和两种不同剂量的伊立替康(24mg/kg或8mg/kg)处理小鼠。这些研究的结果显示，虽然CT3肿瘤对化疗方案敏感，但是CT1肿瘤未能完全消退，且显示对方案的一些抗性(图4)。为了检查FOLFIRI处理对LGR5表达的影响，从CT1和CT3患者来源的肿瘤提取总mRNA，并且通过qRT-PCR测定LGR5的表达，以及通过将来自对应GAPDH转录物的各样本中LGR5的Ct值(循环阈值)减去以产生DCT(ΔCt)值进行分析。数据被呈现为2的DCT次方。LGR5丰度的分析显示，相比于对应的盐水处理肿瘤，LGR5转录物在CT1(约2倍)和CT3肿瘤(大约3.5倍)中增加。实施例16-在用吉西他滨单独和与白蛋白结合型紫杉醇联合处理的胰腺癌肿瘤中LGR5被上调为了研究标准护理的胰腺癌化疗处理是否改变了胰腺肿瘤中LGR5的表达，每周两次用吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的联合处理小鼠(在JH109原发异种移植物中)。在终点分析时，利用肿瘤cDNA的qRT-PCR数据显示，相比于对应的盐水处理肿瘤，化疗处理的肿瘤中LGR5的表达显著增加，其表示用标准护理进行的处理导致肿瘤细胞中LGR5的上调。JH109模型中LGR5的表达，所述JH109模型是患者来源的胰腺肿瘤的异种移植模型。小鼠被植入在接受者中连续传代且从未暴露于体外培养条件的肿瘤块。用化疗方案(吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的联合)处理荷瘤小鼠，导致肿瘤生长的明显抑制。与结肠癌模型一致，化疗导致JH109肿瘤中LGR5的上调(大于4倍)，其进一步暗示当化疗处理时癌症干细胞群的富集。参见，例如，图5。实施例17-通过人源化抗-LGR5抗体在体内抑制胰腺肿瘤的生长还在胰腺癌异种移植模型中研究了18G7H6A3的功效。CB.17SCID小鼠被植入PANC1细胞(在1:1比值的基质胶+RPMI中皮下植入1E6/小鼠)，并且在植入后第41天随机分为以下处理组：i)PBS；ii)IgG对照(15mg/kg，每周两次，ip)；iii)18G7H6A3(15mg/kg，每周两次，ip)；iv)吉西他滨(90mg/kg，每周两次，ip)；以及v)吉西他滨和18G7H6A3的并行联合(15mg/kg，每周两次，ip)。将吉西他滨在分配组中施用3周以抑制肿瘤的生长。每周两次监测所有小鼠的体重和肿瘤大小，以及整体健康和外观。肿瘤体积的分析显示，虽然单一药剂的18G7H6A3存在有利于抑制肿瘤生长的趋势(植入后第70天多至30％)，但是相比于吉西他滨单独组，18G7H6A3和吉西他滨的组合显著抑制PANC1肿瘤的生长(植入后第80天多至52％)。参见图6。在该实施例中，当与化疗(吉西他滨)联合施用时，观察到的18G7H6A3的显著活性，可以归因于响应吉西他滨处理的靶抗原LGR5的表达增加。实施例18-通过人源化抗-LGR5抗体在体内抑制预处理的胰腺肿瘤生长除细胞系之外，我们还研究了18G7H6A3作为单一药剂或与标准护理的联合，在JH109原发患者来源的胰腺癌异种移植模型中的功效。JH109异种移植模型来自已接受四种治疗方案(包括5-FU、吉西他滨、Erbitux和放射疗法)的患者。最初的患者肿瘤已在免疫缺陷小鼠中连续地传代，而对体外培养无任何暴露。为了测试18G7H6A3在JH109模型中的功效，用对照IgG(15mg/kg，i.p两次/一周)、18G7H6A3(15mg/kgi.p两次/一周)单一药剂、标准护理化疗(吉西他滨(50mg/kgi.p一周一次)和白蛋白结合型紫杉醇(30mg/kg，i.v一周一次)的联合)、化疗和对照IgG的联合，以及化疗和18G7H6A3的联合处理荷瘤小鼠(n＝7)。虽然单一的18G7H6A3mAb不能影响肿瘤的生长，但是相比于单独的化疗，18G7H6A3与白蛋白结合型紫杉醇和吉西他滨化疗的组合导致明显较大程度的肿瘤抑制。相比于单独的化疗，18G7H6A3与化疗的联合导致77％的较大肿瘤生长抑制。用18G7H7A3化疗联合处理的三只小鼠，完全根除了肿瘤(未检测到可测量的肿瘤)。甚至在中止处理之后，18G7H6A3化疗联合组持续抑制肿瘤生长，以及在中断化疗之后三个月，一只小鼠仍无任何可测量的肿瘤。在该实施例中，当与化疗联合施用(吉西他滨加白蛋白结合型紫杉醇)时，观察到18G7H6A3的显著活性可归因于响应吉西他滨白蛋白结合型紫杉醇处理的靶抗原LGR5表达的增加，并且证明在化疗处理以根除原发肿瘤块之后，在体内预防原发肿瘤再生长或复发。实施例19-人源化LGR5抗体的处理减少了癌症干细胞群对于流式细胞分析，用针对干细胞特异性标志物CD44和CD166的多种抗体，对来自5个单独肿瘤的细胞进行染色。将肿瘤解离，耗尽小鼠细胞，然后对活细胞进行计数。将解离的细胞用于通过流式细胞术来分析细胞表面干细胞标志物的表达。癌症干细胞群存在减少了，如通过CD166+/CD44+、LGR5+/CD166+或LGR5+/CD166+/CD44+亚群所确定的(图7)。实施例20-人源化LGR5抗体的处理降低了体内结肠癌肿瘤的复发和癌症干细胞的频率在结肠癌CT3模型中测试了18G7H6A3与FolFiri联合的效果(实施例10)。该原发肿瘤功效研究的结果显示，18G7H6A3与3轮FOLFIRI方案的联合，在降低肿瘤生长方面比单独的FolFiri更有效。为了确定18G7H6A3FOLFIRI的联合方案在降低癌症干细胞(CSC)频率方面是否也有效，将来自第78天的肿瘤收获、解离、合并并在有限稀释分析中以10个、30个、100个细胞/侧翼再植入肿瘤初始CB17.Scid小鼠的新组群。然后每周2次监测小鼠的肿瘤生长，以及在无进一步处理的情况下允许肿瘤生长。相比于分离自用FOLFIRI单独处理的小鼠的细胞，分离自用抗-LGR5抗体18G7H6A3与FOLFIRI联合处理的小鼠的细胞大大地降低了致瘤性(图8)。此外，相比于单独的FOLFIRI，来自18G7H6A3FOLFIRI联合的再植入细胞具有显著较慢的肿瘤生长特性且延迟进展的时间(图9)。最后，在第40天，通过因素6的线性回归分析，18G7H6A3的处理降低了癌症干细胞的频率(1/856.318G7H6A3/FOLFIRI相对1/138.6FolFiri)。这些数据表示，18G7H6A3与FOLFIRI的联合有效地靶向肿瘤起始或癌症干细胞群。对于30个细胞/动物的数据而言，第68天是最后一天。数据是显著的，p＝0.0039。实施例21-人源化LGR5抗体的处理降低了体内胰腺癌肿瘤的复发和癌症干细胞的频率在胰腺癌PANC1模型中测试了18G7H6A3与吉西他滨联合的效果。该研究显示，相比于单独的吉西他滨，18G7H6A3与吉西他滨的联合显著地抑制了PANC1模型中肿瘤的生长。将来自这些处理组的肿瘤细胞收获、解离、合并并在有限稀释分析(500个、1500个、4500个或13500个细胞/动物)中再植入CB.17SCID小鼠的新组群，以及在无处理的情况下允许生长。在有限稀释分析的再植入中，相比于分离自用吉西他滨单独处理的小鼠的细胞，分离自用抗-LGR5抗体18G7H6A3与吉西他滨联合处理的小鼠的细胞大大降低了致瘤性。用吉西他滨和18G7H6A3联合处理的再植入PANC1肿瘤，在移植有4500个细胞的小鼠中(吉西他滨40％相对联合的20％)，以及在移植有13500个细胞的小鼠中(吉西他滨100％相对联合的70％)，显示移植频率的降低。使用线性回归，在与联合组相比的吉西他滨中，吉西他滨植入肿瘤中的癌症干细胞的频率更高为约1.5倍(14883分之1相对于21336分之1)。这些数据表示，18G7H6A3与吉西他滨的联合有效地靶向肿瘤起始或癌症干细胞群。除PANC1肿瘤之外，在有限稀释的实验中(使用500个、1500个、4500个和13500个细胞)，我们还分析了在吉西他滨作为单一药剂或与18G7H6A3联合处理的携带AsPC-1肿瘤的小鼠中的移植百分比和癌症干细胞频率。在处理后第40天的肿瘤体积测量显示，在植有4500个或13500个细胞的小鼠中，在吉西他滨相对于联合组中，荷瘤小鼠的百分比降低(分别是40％和80％相对于30％和50％)。在相对于联合组的吉西他滨中，癌症干细胞的频率也较大，大于1.5倍，其进一步表明18G7H6A3与吉西他滨的联合正靶向胰腺癌中的癌症干细胞群。实施例22-人源化LGR5抗体的处理降低了体内三阴性乳腺癌肿瘤的复发和癌症干细胞的频率在三阴性乳腺癌MDA-MB-231-LM3模型(实施例12)中测试了18G7H6A3与紫杉醇联合的效果。该研究显示，相比于单独的紫杉醇，18G7H6A3与紫杉醇的联合在肿瘤生长方面具有最低的附加抑制作用。将这些肿瘤收获、解离、合并并在有限稀释分析中以10个、30个、100个细胞/侧翼再植入CB.17SCID小鼠的新组群，并且在无处理的情况下允许生长。相比于分离自用紫杉醇单独处理的小鼠的细胞，分离自用抗-LGR5抗体18G7H6A3与紫杉醇联合处理的小鼠的细胞大大降低了致瘤性。此外，相比于单独的紫杉醇，来自18G7H6A3加紫杉醇肿瘤的再植入细胞，具有显著缓慢的肿瘤生长特性并且延迟进展时间。最后，通过线性回归分析，18G7H6A3加紫杉醇的处理降低了癌症干细胞的频率。这些数据显示，18G7H6A3与紫杉醇的联合有效地靶向肿瘤起始或癌症干细胞群。实施例23-用人源化抗-LGR5抗体和化疗进行的预防性处理在体内抑制转移性结肠直肠癌的生长使用源自结肠直肠癌患者的肝脏转移的低传代结肠直肠癌细胞(BMCRC086)进行体内研究。在第0天，将BMCRC086细胞解冻，悬浮于RPMI:基质胶(1:1)中，并且皮下注入CB.17SCID小鼠的后侧。每周两次监测动物的肿瘤大小和体重。在第7天，用PBS、18G7H6A3、FOLFIRI、或FOLFIRI与18G7H6A3联合处理小鼠。以15mg/kg剂量将PBS和18G7H6A3、BIW给予小鼠，持续7.5周(16次剂量)。给予小鼠FOLFIRI(第7天、12天、17天、22天、27天和32天，30mg/kg氟尿嘧啶和90mg/kg甲酰四氢叶酸；第8天、13天、18天、23天、28天和33天，24mg/kg伊立替康)，持续4周(6次剂量)。相比于单独的FOLFIRI，18G7H6A3与FOLFIRI的联合显示显著的抗肿瘤活性(图10)。实施例24-人源化LGR5抗体的处理抑制了Wnt信号转导通路在体内肿瘤功效的研究中，通过蛋白印迹分析表征18G7H6A3处理的来自结肠癌CT1(实施例8)和CT3(实施例9)的肿瘤。在处死之后，切除来自各处理小鼠的肿瘤样本(每组n＝5至10只小鼠)，在液氮冷却的研钵中立即冰冻，用研杵碾碎(深冷粉碎)，在液氮中速冻并储存于-80℃备用。将深冷粉碎的肿瘤用冰冷的裂解缓冲液(含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的还原RIPA缓冲液)，在进行偶尔涡流的冰上裂解30分钟。针对多种Wnt-信号蛋白(以及其磷酸化形式)，将含有肿瘤裂解物蛋白的上清液在SDS-PAGE凝胶上运行，随后进行蛋白印迹法。在CT1和CT3肿瘤的蛋白印迹中，观察到处理组之间的大量显著差异。在图11中，磷酸化-Thr41/Ser45-β-连环蛋白(Wnt信号蛋白)是无效的标志物，且随后被降解形成蛋白，其表明18G7H6A3能够体内抑制肿瘤细胞中的LGR5信号转导。实施例25-人源化LGR5抗体处理未能在体外抑制Wnt-信号转导通路用含有TCF-LEF报告载体的慢病毒(GFPCignal，QIAGEN)转导亲代HEK-293T细胞和稳定表达LGR5的HEK-293T细胞，并且针对稳定表达的报告基因进行选择。将亲代系和表达LGR5的稳定报告系以25,000/孔在96孔板中接种，过夜贴壁，血清饥饿并用抗体或媒介物处理6小时，然后用重组人Wnt3a(3nM)和重组人R-脊椎蛋白处理18小时。基于不同R-脊椎蛋白在激活TCF/LEF报告细胞系中的活性分析，测试了各R-脊椎蛋白1-3的两种浓度以及一种浓度的R-spo4(100pM、300pM、1nM、3nM或10nM)。在酶标仪上测量报告基因驱动的GFP信号。对于测试的R-脊椎蛋白，显示的所有实验是来自三个独立实验(各实验以一式两份进行)的汇总数据(数据为平均值+SD)。如图12中所示，增加浓度的可溶性18G7H6A3，通过与Wnt3a加RSPO1、RSPO2或RSPO3的联合，不影响TCF/LEF启动子驱动的GFP表达的诱导。还显示了阳性对照抗体76C12，所述抗体76C12显示在RSPO和Wnt的存在下通过LGR4和LGR5抑制信号转导活性的诱导。该数据证明，抗-LGR5抗体18G7H6A3未能阻断RSPO驱动的TCF/LEF启动子的激活。实施例26-人源化LGR5抗体经由ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)机制靶向肿瘤细胞使CHO-LGR5细胞生长至汇合，并向下旋转，重悬于PBS中并进行计数。将等份细胞(大约100k)添加至另一个含有100μM预热(37℃)CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)的管，并且将混合物在细胞培养箱中孵育15分钟。最终CFSE的浓度是约1μM。其次，对细胞进行洗涤并重悬于预热的培养基，并且将其在培养箱中放置另外30分钟，随后用PBS进行洗涤。然后用18G7H6A3(100μM)对染色细胞进行染色。为了确保抗体与CHO-LGR5细胞结合，在一些研究中，还用缀合有第二山羊抗-人PE的抗体对等份细胞进行染色，然后在实验室的Calibur机器上进行分析。在实验室避光的地方，用DDAO-SE(DDAO琥珀酰亚胺酯；2μM染料用于100K细胞)于室温将U937细胞染色15分钟。然后，将细胞与1mlFBS(胎牛血清)随后在避光的地方孵育5分钟。其次，将细胞用补充有FBS(10％)的PBS洗涤，并重悬于补充有FBS(2.5％)的RPMI中。将CHO-LGR5-18G7H6A3和U937-DDAO-SE标记的细胞在细胞培养箱中共孵育5小时，并且在实验室的Calibur机器中进行分析。作为阴性对照，还将等份CHO-LGR5-CFSE细胞(无18G7H6A3的染色)与U937共孵育，并且在Calibur机器上进行分析。流式细胞术数据的分析表明，用CFSE和18G7H6A3染色的大多数CHO-LGR5细胞是活的，并且在Calibur机器上可检测。另外，当被染色时，U937(U937(人单核细胞细胞系；效应细胞)和CHO-LGR5细胞是可检测的，并且单独地获得。最后，U937-DDAO-SE和CHO-LGR5-CFSE-18G7H6A3的共同孵育鉴定了双阳性细胞群体，然而，U937和缺乏18G7H6A3的CHO-LGR5-CFSE的共同孵育没有产生双阳性群体。双阳性群体的存在表示U937(其表达FcR)与CHO-LGR5-18G7H6A3(其表达Fc部分)的交叉结合，并且还暗示了ADCC是18G7H6A3的抗肿瘤活性机制之一。实施例27-人源化LGR5抗体内化LGR5在过表达LGR5的CHO细胞上检查18G7H6A3的内化。用100nM抗体于4℃将细胞染色30分钟至2小时，将过量的抗体洗涤掉，并且于4℃或37℃孵育染色的细胞。在不同的时间点下，将细胞用缀合有AlexaFluor488的二抗进行染色，以监测细胞表面结合抗体的内化。当于37℃孵育时，内化率具有6.703±1.282分钟表面定位的测量t1/2值。于4℃的孵育大大阻断了内化，尽管观察到表面结合抗体的一些减少。实施例28-人源化LGR5抗体未能竞争性地阻断可溶性RSPO与LGR5结合利用竞争ELISA模式，检查在人R-脊椎蛋白1/2/3/4蛋白的存在下生物素-18G7H6A3与hLGR5-Fc的相互作用。将LGR5-Fc以2μg/mL包被在96孔高结合的ELISA板上，并于4℃过夜孵育。将板用PBS+1％BSA封闭。将生物素-18G7H6A3在结合缓冲液中稀释至1μg/mL。所述浓度选自LGR5-Fc和生物素-18G7H6A3之间的直接结合ELISA，以产生高于EC50浓度的强信号。将竞争者蛋白以不同的浓度与生物素-18G7H6A3同时添加至ELISA板。将1:1,000稀释度的链霉亲和素-HRP(R&DSystems,cat#890803)用于检测。用TMB(Thermo)使板显影，以及在SpectraMaxPlus384酶标仪上于450nm处收集数据。使用GraphPadPrism6程序进行数据分析。随着对生物素-mAb和竞争者浓度的一些修改，将ELISA重复三次。作为阳性对照，LGR5-Fc在板上与生物素-18G7H6A3和hLGR5-Fc的结合竞争。测试了R-脊椎蛋白1/2/3/4用于阻断生物素-18G7H6A3与板上包被的LGR5-Fc结合的能力。所述蛋白购自R&DSystems，并且是哺乳动物细胞中表达的全长构建体。在R-脊椎蛋白的最高浓度处，未观察到抗体与LGR5结合的完全阻断(图13)。实施例29-人源化LGR5抗体未竞争性地阻断可溶性RSPO与LGR5结合单独配体(RSPO或Norrin)与LGR5的结合不足以诱导LGR5信号转导。相反，LGR5与多种共受体形成三元复合物来驱动信号转导。为了检查18G7H6A3对LGR5三元复合物形成的影响，使用ELISA模式检查在R-脊椎蛋白1/2/3/4和Norrin的存在下LGR5与RNF43、ZNRF3和LRP6的结合。将RNF43-Fc、ZNRF3-Fc和LRP6-Fc以4μg/mL(在1xPBS中)包被在96孔高结合板上。将板于4℃过夜孵育，并且用PBS+1％BSA封闭。将LGR5-Fc在最初的缓冲液中稀释至1μg/mL，全部在1μg/mLR-脊椎蛋白1/2/3/4或0.5μg/mLNorrin存在或缺乏的情况下。在添加至ELISA板之前，将R-脊椎蛋白1/2/3/4或Norrin与hLGR5-Fc一起预孵育。对于各条件，使用一式三份的孔以一式三份进行测试。将1:2,000的抗-FLAGmAb(细胞信号转导)用于检测结合的hLGR5-Fc。将1:10,000稀释的抗-小鼠IgGHRP(JIR)用于检测。用TMB(Thermo)将板显影，并且在SpectraMaxPlus384酶标仪上于450nm处收集数据。使用GraphPadPrism6程序进行数据分析。观察到用LGR5、配体RSPO或Norrin、以及共受体(RNF43-Fc、ZNRF3-Fc和LRP6-Fc)形成的三元复合物。其次，此外，在LGR5-Fc和RSPO或Norrin的存在下，向ELISA板添加18G7H6A3。18G7H6A3显著地减少了用RSPO和Norrin配体二者以及所有三种共受体(RNF43、ZNRF3和LRP6)形成的LGR5三元复合物。参见图14。因为18G7H6A3不能直接或竞争性地与配体的结合竞争，所以该数据是抑制作用变构模型的证据。实施例30-抗-LGR5抗体18G7H6A3的表位定位为了进一步表征抗体18G7H6A3结合的LGR5的特异性区域，利用氢氘交换质谱进行表位定位实验。在进行氢氘交换实验之前，将在不同浓度盐酸胍(GdnHCl)中用未氘化的缓冲液制备的测试消化物用来优化得到单独LGR5的最佳肽覆盖的蛋白酶解条件。对于DXMS的胃蛋白酶消化，将样本于5℃解冻，然后立即在装载猪胃蛋白酶(Sigma)的蛋白酶柱上用0.05％三氟乙酸以100μl/min的流速进行消化。在C18捕集柱上收集消化的片段，并且在C18反相柱(Vydac)上用6％至38％的线性乙腈梯度进行分离。将柱的洗脱液直接电喷雾进LCQClassic质谱仪(ThermoFinnigan,Inc.)或Q-TOF质谱仪(Micromass)。通过使用SEQUEST(ThermoFinnigan,Inc.)，帮助从MS/MS数据集确定胃蛋白酶产生的肽。然后通过DXMSExplorer(SierraAnalyticsInc.,Modesto,CA)进一步验证该肽的集合。比较不同浓度GdnHCl的肽覆盖图，以及将各单独蛋白或蛋白复合物的最佳覆盖图的条件，用于随后的氘交换实验。如前所述，所有步骤于0℃进行。通过将蛋白缓冲液中的LGR5-Fc或者与18G7H6A3预孵育的LGR5-Fc，与D2O缓冲液混合至50％D2O最终浓度来起始交换实验。将混合物于0℃孵育10秒、30秒、100秒、300秒、1,000秒、3,000秒或10,000秒，以及然后通过添加冰冷的淬灭溶液(0.96％甲酸，0～0.8M盐酸胍)将交换反应淬灭，导致样本具有0.58％甲酸和0～0.5M盐酸胍的最终浓度，pH2.5。然后将样本在干冰上立即冻结，并储存于-80℃。如前所述，DXMS实验的数据处理采用专门的软件(DXMSExplorer,SierraAnalyticsInc.)。由于18G7H6A3的结合以及当抗体与抗原结合时封埋了表面暴露的残基，氢/氘(H/D)-交换数据提供了关于在溶剂暴露中变化的细节。HD交换数据分析指示，18G7H6A3在R-脊椎蛋白结合位点表面对面上，与富亮氨酸重复6-9凸面内的SEQIDNO:47的氨基酸T175、E176、Q180、R183、S186、A187、Q189、D247、E248、T251、R254、S257、N258、K260结合，如通过X射线结晶研究所确定的(参见例如，Chenetal.GenesDev.27(12):1345-50，将其通过引用整体并入)。这些数据显示，LGR5与R-脊椎蛋白结合所涉及的残基不涉及结合18G7H6A3。这些初步的结果并不能排除这样的事实：LGR5中的其它结构元件可能涉及18G7H6A3的结合位点。实施例31-向结肠癌患者施用18G7H6A3化疗治疗结肠癌患者群体，并监测肿瘤的体积。观察到，当开始化疗时，平均的肿瘤体积停止扩大且事实上减小。在延长的时间段之后，肿瘤体积稳定并最后开始增大。用化疗与18G7H6A3共同施用来治疗结肠癌患者的第二群体。再一次，监测平均的肿瘤体积。观察到，当开始化疗时，肿瘤体积停止扩大且事实上减小。观察到，肿瘤体积减小至最小体积，其大大小于第一群体的肿瘤体积。还发现，对于大量延长的时间段而言，相对于第一群体，肿瘤大小保持较小。实施例32-向结肠癌患者施用18G7H6A1化疗治疗结肠癌患者的群体，并监测肿瘤的体积。观察到，当开始化疗时，平均的肿瘤体积停止扩大且事实上减小。在延长的时间段之后，肿瘤体积稳定并最后开始增大。用化疗与18G7H6A1共同施用来治疗结肠癌患者的第二群体。再一次，监测平均的肿瘤体积。观察到，当开始化疗时，肿瘤体积停止扩大且事实上减小。观察到，肿瘤体积减小至最小体积，其大大小于第一群体的肿瘤体积。还发现，对于大量延长的时间段而言，相对于第一群体，肿瘤大小保持较小。实施例33-向结肠癌患者施用18G7H6A3对结肠癌患者的第一群体施用单独化疗。对结肠癌患者的第二群体施用化疗与18G7H6A3的联合。第一群体表现出肿瘤大小和生长的暂时减小，之后，肿瘤生长重新开始且症状恢复。化疗治疗之后的肿瘤生长对随后的化疗治疗有抗性。第二群体表现出肿瘤大小降低至基底水平且肿瘤生长停止。在完成治疗方案期间或者当完成治疗方案时，肿瘤生长未重新开始。在完成所述方案之后，生长未恢复且癌症的症状不再存在于第二群体。实施例34-向结肠癌患者施用18G7H6A1对结肠癌患者的第一群体施用单独的化疗。对结肠癌患者的第二群体施用化疗与18G7H6A1的联合。第一群体表现出肿瘤大小和生长的暂时减小，之后，肿瘤生长重新开始且症状恢复。化疗治疗之后的肿瘤生长对随后的化疗治疗有抗性。第二群体表现出肿瘤大小降低至基底水平且肿瘤生长停止。在完成治疗方案期间或者当完成治疗方案时，肿瘤生长未重新开始。在完成所述方案之后，生长未恢复且癌症的症状不再存在于第二群体。实施例35-向结肠癌患者施用18G7H6A3增加了存活对结肠癌患者的第一群体施用单独的化疗。对结肠癌患者的第二群体施用化疗与18G7H6A3的联合。监测治疗之后固定持续时间(1年)的患者存活。观察到，第二群体中的患者存活大大高于第一群体中的患者存活。即，相比于第一群体的存活率，显著更高比例的第二群体活过治疗之后第一年。在后来的间隔时进行类似的观察，并且观察到，在第一间隔的存活者中，第二组的成员比治疗后1年活着的第一组成员明显更可能存活至第二间隔(治疗之后2年)。实施例36-向结肠癌患者施用18G7H6A1增加了存活对结肠癌患者的第一群体施用单独的化疗。对结肠癌患者的第二群体施用化疗与18G7H6A1的联合。监测治疗之后固定持续时间(1年)的患者存活。观察到，第二群体中的患者存活大大高于第一群体中的患者存活。即，相比于第一群体的存活率，显著更高比例的第二群体活过治疗之后第一年。在后面的间隔进行类似的观察，并且观察到，在第一间隔的存活者中，第二组的成员比治疗后1年活着的第一组的成员明显更可能存活至第二间隔(治疗之后2年)。实施例37-向乳腺癌患者施用18G7H6A3化疗治疗乳腺癌患者群体，并监测肿瘤的体积。观察到，当开始化疗时，平均的肿瘤体积停止扩大且事实上减小。在延长的时间段之后，肿瘤体积稳定并最后开始增大。用化疗与18G7H6A3共同施用来治疗乳腺癌患者的第二群体。再一次，监测平均的肿瘤体积。观察到，当开始化疗时，肿瘤体积停止扩大且事实上减小。观察到，肿瘤体积减小至最小体积，其大大小于第一群体的肿瘤体积。还发现，对于大量延长的时间段而言，相对于第一群体，肿瘤大小保持较小。实施例38-向乳腺癌患者施用18G7H6A1化疗治疗乳腺癌患者群体，并监测肿瘤的体积。观察到，当开始化疗时，平均的肿瘤体积停止扩大且事实上减小。延长的时间段之后，肿瘤体积稳定并且最后开始增大。用化疗与18G7H6A1共同施用来治疗乳腺癌患者的第二群体。再一次，监测平均的肿瘤体积。观察到，当开始化疗时，肿瘤体积停止扩大且事实上减小。观察到，肿瘤体积减小至最小体积，其大大小于第一群体的肿瘤体积。还发现，对于大量延长的时间段而言，相对于第一群体，肿瘤大小保持较小。实施例39-向乳腺癌患者施用18G7H6A3对乳腺癌患者的第一群体施用单独的化疗。对乳腺癌患者的第二群体施用化疗与18G7H6A3的联合。第一群体表现出肿瘤大小和生长的暂时减小，之后，肿瘤生长重新开始且症状恢复。化疗治疗之后的肿瘤生长对随后的化疗治疗有抗性。第二群体表现出肿瘤大小降低至基底水平且肿瘤生长停止。在完成治疗方案期间或者当完成治疗方案时，肿瘤生长未重新开始。在完成所述方案之后，生长未恢复且癌症的症状不再存在于第二群体。实施例40-向乳腺癌患者施用18G7H6A1对乳腺癌患者的第一群体施用单独的化疗。对乳腺癌患者的第二群体施用化疗与18G7H6A1的联合。第一群体表现出肿瘤大小和生长的暂时减小，之后，肿瘤生长重新开始且症状恢复。化疗治疗之后的肿瘤生长对随后的化疗治疗有抗性。第二群体表现出肿瘤大小降低至基底水平且肿瘤生长停止。在完成治疗方案期间或者当完成治疗方案时，肿瘤生长未重新开始。在完成所述方案之后，生长未恢复且癌症的症状不再存在于第二群体。实施例41-向乳腺癌患者施用18G7H6A3增加了存活对乳腺癌患者的第一群体施用单独的化疗。对乳腺癌患者的第二群体施用化疗与18G7H6A3的联合。监测治疗之后固定持续时间(1年)的患者存活。观察到，第二群体中的患者存活大大高于第一群体中的患者存活。即，相比于第一群体的存活率，显著更高比例的第二群体存活过治疗之后第一年。在后面的间隔进行类似的观察，并且观察到，在第一间隔的存活者中，第二组的成员比治疗后1年活着的第一组成员明显更可能存活至第二间隔(治疗之后2年)。实施例42-向乳腺癌患者施用18G7H6A1增加了存活对乳腺癌患者的第一群体施用单独的化疗。对乳腺癌患者的第二群体施用化疗与18G7H6A1的联合。监测治疗之后固定持续时间(1年)的患者存活。观察到，第二群体中的患者存活大大高于第一群体中的患者存活。即，相比于第一群体的存活率，显著更高比例的第二群体活过治疗之后第一年。在后面的间隔进行类似的观察，并且观察到，在第一间隔的存活者中，第二组的成员比治疗后1年活着的第一组成员明显更可能存活至第二间隔(治疗之后2年)。实施例43-向结肠癌患者施用18G7H6A3降低了副作用对结肠癌患者的第一群体施用化疗和抗-LGR5抗体，所述抗-LGR5抗体阻断LGR5-RSPO的结合和信号转导。对结肠癌患者的第二群体施用化疗和18G7H6A3。第一群体表现出与干扰通过LGR5的RSPO1信号转导相关的非治疗副作用。这些副作用不利于患者健康。18G7H6A3与化疗联合施用的第二群体没有表现出与干扰通过LGR5的RSPO1信号转导相关的非治疗副作用。实施例44-晚期CRC肿瘤中LGR5的表达利用RNAscope技术，用LGR5特异性探针研究了LGR5转录物的表达。LGR5转录物在包括结肠、肠、小脑和胰腺的组织中可检测到。LGR5转录物还在患者来源的异种移植(PDX)组织包括CT1CRC和JH109胰腺肿瘤中可检测到。在肿瘤发生的不同阶段(包括早期(I级)与晚期(转移性)损伤)分离的CRC患者样本中研究了LGR5的表达。LGR5转录物在CRCI级、II级和II级损伤中有表达，且在CRC转移性损伤中高度表达。实施例45-转移性胰腺患者来源的异种移植物中LGR5的表达利用定量聚合酶链式反应(QPCR)研究了转移性胰腺患者来源的异种移植物中LGR5的表达。将肿瘤组织样本速冻或添加至含有RNAlater的冷冻管(Qiagen,CA)，并在4℃孵育若干小时后转移至-70℃。使用QiagenRNeasy提取试剂盒(Qiagen，CA)提取总RNA，并且使用SuperScriptIII试剂盒(LifeTechnologies,CA)以及由生产商提供的方案合成cDNA。使用人特异性LGR5和GAPDH引物以及在StepOne热循环仪(LifeTechnologies,CA)中使用下述热条件测量人LGR5的转录物丰度：50℃(2分钟)；90℃(2分钟)；40个循环的90℃(15秒)和60℃(1分钟)；以及熔解曲线评估(65℃-95℃)。使用2^δCt方程式定量LGR5丰度。LGR5在转移性胰腺患者来源的异种移植物中高度表达。用化疗进行的治疗导致胰腺肿瘤中LGR5的表达增加。使用人特异性引物，利用QPCR可在一系列胰腺患者来源的异种移植物中测量LGR5转录物。虽然LGR5在大部分肿瘤中可检测，但是在转移性肿瘤中LGR5的表达存在增加的趋势，其进一步暗示了LGR5在晚期肿瘤发生中的作用。在一系列胰腺肿瘤包括JH109、ASPC1和PANC1中研究了LGR5的表达。标准护理治疗(SOC)进行的治疗(在JH109中Gemzar和Abraxane，以及在PANC1和ASPC1中单独的Gemzar)，导致各前述肿瘤中LGR5表达的诱导(图15)。显著地，在用18G7H6A3和SOC联合治疗的肿瘤中，LGR5的表达降低至与对照(盐水或MOPC)相当的水平。这些数据还指示，LGR5的表达可以作为PANC肿瘤中响应联合疗法(18G7H6A3+SOC)的生物标志物。实施例46-CTNNB1是CRC和胰腺肿瘤中18G7H6A3的靶基因之一研究了Wnt通路中18G7H6A3的潜在靶标。制备WntQPCR板(Qiagen，CA)，在96孔PCR板中具有约80个Wnt通路基因的引物。将来自18G7H6A3或MOPC(对照)处理的肿瘤的cDNA合并，并且在Wnt板中进行QPCR。将各板中的数据针对对应的GAPDH进行标准化，并使用2^δCt方程式测量各基因的丰度。为了测量倍数差异，将各18G7H6A3处理的肿瘤中的数据除以来自MOPC处理组的对应值。高于1或低于1的值分别指示18G7H6A3处理组中的上调或下调。被上调或下调的基因数量的初步评估显示，在两种肿瘤模型(CT1和CT3)中，下调的基因比上调的基因多，其暗示了18G7H6A3对基因表达具有抑制效果。详细的分析鉴定了若干差异表达的基因，包括FZDB、FZD7、WNT7B、FBXW11、FZD1、DVL1、CSNK2A1和CTNNB1。在宫颈癌中，LGR5的表达和CTNNB1之间可能存在紧密相关性。在其它研究中，LGR5过表达(使用LGR5重组载体)或下调(使用shRNA)分别导致CTNNB1的上调或下调(ChenQ,CaoHZ,ZhengPS.2014.Oncotarget5:9092-105)。另外，来自宫颈癌患者的免疫组织化学切片的分析显示了LGR5和CTNNB1的表达之间的显著相关性。在该研究中，还使用QPCR(以测量转录物水平)和蛋白印迹(以评估蛋白表达)研究了CTNNB1的表达。使用人特异性引物，在胰腺肿瘤和CRC肿瘤中研究了CTNNB1的表达。与实施例45中解释的LGR5表达类似，用SOC进行的治疗增加了CTNNB1的表达，以及18G7H6A3和SOC的联合导致CTNNB1表达的降低。另外，在用18G7H6A3治疗的CT1肿瘤中，CTNNB1的表达降低约35％。因此，用18G7H6A3进行的处理抑制了CTNNB1。通过蛋白印迹分析研究了β-连环蛋白和磷酸化-β-连环蛋白的表达(指示Wnt通路中活性的缺乏)。ASPC1肿瘤的蛋白印迹数据证实了QPCR数据，其中18G7H6A3作为单一药剂或与SOC联合上调了pβ-连环蛋白，其暗示这些肿瘤中Wnt通路活性的抑制(图16)。在一系列CRC、胰腺和乳腺肿瘤中研究了Wnt通路的其它组分，包括p-β-连环蛋白、GSK-3β(总的以及磷酸化的)和LRP6。蛋白印迹数据的定量显示ASPC1和PANC1肿瘤中Wnt通路信号转导的显著抑制，而且在其它模型中也揭示了有利于Wnt通路下调的一些趋势。对18G7H6A3的处理无响应的BMCRC086肿瘤，对LGR5的表达和Wnt信号转导通路的组分也是阴性的，其支持18G7H6A3的作用机制为特异性地靶向LGR5且抑制Wnt信号转导。研究了胰腺肿瘤包括ASPC1、PANC1和JH109中Wnt通路基因的表达。基于体内数据，在PANC1和ASPC1二者中，18G7H6A3处理的肿瘤与PBS处理的肿瘤之间的肿瘤体积存在差异。相反，JH109肿瘤不响应用18G7H6A3单一药剂或SOC化疗组合进行的标准治疗方案。研究了在响应细胞(PANC1和ASPC1)和无响应细胞(JH109)中Wnt基因表达的差异。在联合处理组中，Wnt6、FZD8、FOSL1、Wnt11、NFATC和FZD5在ASPC1和PANC1联合处理的肿瘤中被下调，而在JH109肿瘤中被上调。在胰腺和CRC的数据中，包括WNT11、WNT6、FRZB和PRICKEL的基因在PANC1、ASPC1、CT1和CT3细胞中被下调，但是在JH109细胞中未被下调。基因树分析鉴定了在用18G7H6A3处理的胰腺肿瘤中被共同调节的潜在基因，其包括Wnt11、FRAT1、LEF1、GSK3B、FZD8和LRP6。在各处理中差异表达的转录物的分析，还鉴定了在胰腺肿瘤中被上调/下调超过2倍的基因(图17)。18G7H6A3处理相对于对照处理的肿瘤，诸如Wnt7A的一些基因在所有肿瘤中是常见的。实施例47-18G7H6A3抑制CT1肿瘤中的转录在早期与晚期肿瘤发生中，研究了被18G7H6A3靶向的基因的表达。小鼠植入CT1，并且在第3天、10天和17天，从对照、18G7H6A3、FOLFIRI或联合组收获肿瘤。在第3天从各肿瘤收获并制备总RNA，用于采用Illumina人芯片进行基因阵列杂交。差异表达基因(大于1.5倍或2倍，p<0.05)的整体分析显示，在用18G7H6A3(以单一药剂或与FOLFIRI联合)处理的肿瘤中，下调的基因比上调的基因多。这暗示了，用18G7H6A3处理对整个细胞转录机构可能具有更强的抑制作用。PCA(主成分分析)还显示，在18G7H6A3处理和对照处理的肿瘤中，整体基因表达的接近性。然而，当将18G7H6A3添加至FOLFIRI(即联合组)时，联合组与FOLFIRI组之间存在明显区别，其暗示了，靶向LGR5可能明显地改变了FOLFIRI处理的肿瘤中的基因表达。在相对于媒介物的18G7H6A3中差异表达基因的分析，鉴定了在18G7H6A3处理的肿瘤中被下调的若干肿瘤启动子(如ANGPT2、AKAP12和ADM)，以及在18G7H6A3处理的肿瘤中被上调的若干肿瘤抑制子(如DAB1、MIR655、NKX1-2)(图18)。相反地，FOLFIRI的处理显出上调了肿瘤启动子(FBN2、HKDC1、ABCB1、FGF2)以及一些肿瘤抑制子(如TRIB3、ATF3和TIMP3)(图19)。FOLFIRI和18G7H6A3的联合导致更多肿瘤启动子(如ALDOC、CDH5、ITGA2)的下调以及更多肿瘤抑制子(如ZBTB11、ITPKA、PSMC3IP和BAK1)的上调(图20)。实施例48-在胰腺患者来源的异种移植原位模型中，18G7H6A3的处理显著地减少了外周血中的人CTC为了研究18G7H6A3在抑制原发肿瘤生长和转移中的作用，在一系列胰腺患者来源的异种移植样本，以及PANC1424细胞和PANC1427细胞中检查了LGR5的表达。将肿瘤样本皮下植入NOD/SCID(非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷)小鼠，以及随后植入指定用于体内研究的接受者的胰腺中。经超声一周一次测量肿瘤体积，以及使具有～100mm3肿瘤的小鼠入选功效研究，并且用下述进行处理：1-MOPC同种型(15mg/kg，两次/一周；ip)；2-18G7H6A3(15mg/kg两次/一周；ip)；3-SOC(Gemzar50mg/kg，ip，每周两次；和Abraxane30mg/kg，iv，每周两次)；4-上述剂量18G7H6A3和SOC的联合。在研究结束时，收集来自各荷瘤小鼠的外周血，用于CTC(使用流式细胞术)和循环DNA的评估。为了进行流式细胞术，使用生产商的方案，用RBC裂解缓冲液(ACK缓冲液，LifeTech,CA)处理血液样本，并且于4℃用人HLA-FITC(eBiosciences,CA)和人LGR5-AF647(BDPharmingen,CA)染色30分钟。将细胞用染色缓冲液(PBS-FBS3％)洗涤两次，用7AAD(7-氨基放线菌素)洗涤，然后在实验室的FACScalibur机器上进行获取，并且使用FCSExpress软件(DeNovo,CA)分析数据。LGR5在不同的胰腺患者来源的异种移植样本中表达。在外周血中检测到人CTC。虽然HLA+细胞的百分比在相对于18G7H6A3的MOPC中没有显著地改变，但是循环HLA+LGR5+细胞的百分比在18G7H6A3处理小鼠中显著地降低(图21)。相对于联合处理小鼠，在化疗处理小鼠中HLA+细胞的百分比没有显著地变化，然而，18G7H6A3和SOC的联合几乎完全地消融了并行(concurrent)和消减(debulk)设置中的HLA+LGR5+细胞(图22A和图22B)。在胰腺患者来源的异种移植原位模型中，18G7H6A3的处理(以单一药剂或与SOC联合)显著地降低了外周血中的人CTC。实施例49-其它模型中的LGR5表达利用流式细胞术和RNAscope，在来自猕猴(Cynomolgusmacaques(Cynos))的皮肤样本中研究了LGF5的表达。在第0天，第7天，第14天和第21天，用媒介物或不同剂量的18G7H6A3(G2:10mg/kg；G3:50mg/kg；和G4:150mg/kg)处理来自猕猴的皮肤样本。在研究结束时，将皮肤样本置于补充有抗生素(青霉素和链霉素)和抗真菌溶液(抗-抗100X,LifeTechnologies,CA)的DMEM中。使用胶原酶和嗜热菌蛋白酶的混合物(Liberase,RochInc,CA)消化皮肤样本。在与释放酶过夜孵育且机械破坏之后，分离皮肤祖细胞(SP)。用鼠抗人LGR5(AF647,BDPharmingen,CA)对SP进行染色，并在实验室的calibur机器上进行分析。使用FCSExpress(DenovoSoftware,CA)进行的数据分析显示，在猕猴SP中可检测到LGR5，然而，18G7H6A3(不同的剂量)与媒介物处理组之间LGR5的频率不存在显著差异。使用RNAscope，LGR5在皮肤区域尤其在毛囊中可检测到，以及在皮肤上皮细胞中较小程度地检测到。在相对于18G7H6A3处理样本的媒介物处理样本中，LGR5阳性区域不存在显著差异。研究了分离自猕猴的基因表达外周血单核细胞。使用QiagenRNeasy试剂盒提取总RNA，并且使用SuperscriptcDNA合成试剂盒(LifeTechnologies,CA)合成cDNA。将来自各处理的cDNA合并，并添加至RT2SybergreenqPCRmaster混合物(SABiosciences,MA)。将最终的混合物添加至含有用于趋化因子或炎性细胞因子的猕猴QPCR引物的96孔板各孔。PCR的热特性包括：95℃10分钟，以及40个循环的95℃15秒和60℃1分钟，随后是熔解曲线阶段。通过从对应的GAPDH减去将各板中的数据(Ct值)标准化，并且使用2^DCT方程式计算各转录物的丰度。18G7H6A3组与媒介物处理组之间差异表达(大于2倍)的转录物数量的分析显示，与基因阵列数据一致，下调的基因比上调的基因更多。随着剂量的增加，存在更少的上调基因以及更多的下调基因。其中最后剂量的18G7H6A3之后，猕猴持续4周未接受任何处理的G4恢复(G4R)组，显示几乎类似数目的上调和下调基因。详细的分析鉴定了差异表达的基因(CCL11、IL3、SPP1、CCL13、CXCL6和TNFRSF11b)，所述基因的表达与18G7H6A3的剂量逆相关，即在10mg/kg最高，在150mg/kg最低。在处理之间通常被下调的基因包括CCL1、IFNγ、CCR8、IL2、IL3和IL4，其中的一些在M1或M2巨噬细胞中富集。实施例50-通过人源化抗-LGR5抗体在体内抑制小细胞肺癌肿瘤的生长患者来源的小细胞肺癌异种移植模型。将来自BLG293肿瘤的解离肿瘤细胞在基质胶中皮下植入CB.17SCID小鼠，并且每周两次监测肿瘤的大小和体重。当肿瘤达到130mm3的平均值时，将小鼠随机分配。将小鼠用PBS、抗体对照MOPC或18G7H6A3处理。以15mg/kg将BIW给予小鼠。每周两次监测所有小鼠的体重和肿瘤大小，以及整体健康和外观，直到结束。与PBS(24.9％肿瘤生长抑制)和MOPC抗体(24.7％肿瘤生长抑制)对照相比，18G7H6A3显示显著的抗肿瘤活性。实施例51-18G7H6A3增加了消减化疗疗法后胰腺肿瘤复发的小鼠的存活通过化疗(吉西他滨/Abraxane)和18G7H6A3处理完全地消减(消退)了Panc1427(UCSD1427)肿瘤。当肿瘤被消退时，移除化疗，并且用18G7H6A3处理小鼠或不进行处理。相比于对照动物，用18G7H6A3处理的动物明显更健康，其中，由于严重的健康观察如跛行或体重减轻，若干小鼠必须被安乐死。在第150天，相对于用化疗单独处理导致的4/8小鼠活着，用18G7H6A3和化疗处理导致7/8的小鼠活着。图23总结了结果。本文所用的术语“包含(comprising)”与“包括(including)”、“含有(containing)”或“通过…表征(characterizedby)”同义，并且是包含式或开放式的，且不排除另外未列举的元素或方法步骤。上述描述公开了本发明的若干方法和材料。本发明容许对方法和材料进行修改，以及对制造方法和设备进行更改。根据本公开的考虑或本文所公开的发明的实践，此类修饰对本领域技术人员而言将更明显。因此，并不意味着本发明限于本文所公开的具体实施方案，而是涵盖了在本发明的真实范围和精神内发生的全部修改和替代性方案。将本文引用的所有参考文献包括但不限于公开和未公开的申请、专利和文献参考，通过引用整体并入本文并且在此作为本说明书的一部分。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容一定程度上矛盾的情况下，本说明书旨在取代和/或优先于任何此矛盾材料。序列表<110>生态学有限公司；克里斯多佛·L·里耶斯；彼得·朱；克里斯汀·M·史密斯；柳德米拉·A·坎贝尔；法波·舒贾埃；约翰·托马斯·诺顿<120>结合LGR5的人源化抗体<130>BIONO.010WO<150>61/975589<151>2014-04-04<150>62081497<151>2014-11-18<160>49<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>8<212>PRT<213>小鼠<220><223>18G7.1重链CDR1氨基酸<400>1GlyTyrThrPheSerGlyTyrTrp15<210>2<211>8<212>PRT<213>小鼠<220><223>18G7.1重链CDR2氨基酸<400>2IleLeuProGlySerAspSerThr15<210>3<211>11<212>PRT<213>小鼠<220><223>18G7.1重链CDR3氨基酸<400>3AlaArgSerGlyTyrTyrGlySerSerGlnTyr1510<210>4<211>10<212>PRT<213>小鼠<220><223>18G7.1轻链CDR1氨基酸<400>4GluSerValAspSerTyrGlyAsnSerPhe1510<210>5<211>3<212>PRT<213>小鼠<220><223>18G7.1轻链CDR2氨基酸<400>5LeuThrSer1<210>6<211>10<212>PRT<213>小鼠<220><223>18G7.1轻链CDR3氨基酸<400>6MetGlnGlnAsnAsnGluAspProArgThr1510<210>7<211>354<212>DNA<213>人工序列<220><223>18G7H6A1重链DNA<400>7gaggtgcagctggtgcagagcggagccgaggtgaagaagcccggcgagagcctgaggatc60agctgcaagggcagcggctacagcttcaccgcgtactggatcgagtgggtgaggcaggct120cccggcaagggcctggagtggatcggcgagatcctgcccggcagcgacagcaccaactac180aacgagaagttcaagggccacgtgaccatcagcgccgacaagagcatcagcaccgcctac240ctgcagtggagcagcctgaaggccagcgacaccgccgtgtactactgcgcccgcagcggc300tactacggcagcagccagtactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc354<210>8<211>333<212>DNA<213>人工序列<220><223>18G7H6A1轻链DNA<400>8gacatcgtgctgacccagagccccgccagcctggccgtgagccccggccagagggcca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