增强和/或预测DNA扩增的组合物和方法与流程

技术特征：

1.一种分离的引物寡核苷酸，从5’到3’包括，

i)第一区，所述第一区包括自身互补序列，所述自身互补序列从5’到3’包括切口酶识别序列的反向互补序列、回文序列以及所述切口酶识别序列，和

ii)第二区，所述第二区的长度至少是16个核苷酸，所述第二区特异性地结合至目标核酸分子上的互补区以形成双链杂合体，所述双链杂合体具有比包括所述第二区的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG，其中所述第二区在3’末端包括一个或多个2’修饰的核苷酸。

2.如权利要求1所述的分离的引物寡核苷酸，其中在所述第一区的所述回文序列的长度是2、4或6个核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述第一区的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸。

4.如权利要求1到3中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述第二区的长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

5.如权利要求1到4中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述第一区完全自身互补。

6.如权利要求1到5中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述交替结构为一个或多个部分双链的杂合体，所述一个或多个部分双链的杂合体能够由所述第二区自身形成、由所述第二区与所述第一区的部分序列形成、由所述第二区与扩增反应中的其他寡核苷酸，引物或探针形成、或由所述第二区与目标序列区外部的部分互补的核酸序列形成。

7.如权利要求1到6中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，所述分离的引物寡核苷酸呈同源二聚体的形式，所述同源二聚体由两个引物寡核苷酸分子的所述自身互补的第一区序列的杂交形成。

8.如权利要求7所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述同源二聚体具有比包括所述引物寡核苷酸的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG。

9.如权利要求1到8中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述一个或多个2’修饰的核苷酸具有2’变体，所述2’变体选自由2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-羟基、2’-烷基、2’-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]、4’-硫代、4’-CH₂-O-2’-桥、4’-(CH₂)₂-O-2’-桥、2’-LNA和2’-O-(N-氨基甲酸甲酯)组成的组或包括碱基类似物的那些结构。

10.如权利要求1到9中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述一个或多个2’修饰的核苷酸位于所述第二区的3’末端。

11.如权利要求9或10所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述两个或更多个2’修饰的核苷酸是相邻的。

12.如权利要求11所述的分离的引物寡核苷酸，其中相邻的2’修饰的核苷酸的数量为4、5或6。

13.如权利要求1到12中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述切口酶是Nt.BspD6I和Nt.BstNBI中的一个或多个。

14.如权利要求13所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述第一区内的所述切口酶识别序列是5’-GAGTC-3’。

15.如权利要求1到14中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，其中放置所述切割剂的识别序列以切割所述第一区和所述第二区之间的磷酸二酯键。

16.如权利要求1到15中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，所述分离的引物寡核苷酸具有包括下述核酸序列的第一区：

5’-GACTCN₁N_1’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₁N_1’GAGTCN-3’；

5’-N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’-3’；

5’-N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N-3’；

5’-N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’-3’；

5’-N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’N-3’；

5’-N₅N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’N_5’-3’；

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN-3’；

5’-N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’-3’；

5’-N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N-3’；

5’-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N-3’；

5’-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’N-3’；和

5’-N₆N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’N_6’-3’,

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNNN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNNNN-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’NN-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’NNN-3’；

5’-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N-3’；

5’-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’-3’；

5’-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’N-3’；以及

5’-N₇N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’N_7’-3’,

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)核碱基)，并且N₁和N_1’互补,N₂和N_2’互补,N₃和N_3’互补,N₄和N_4’互补,N₅和N_5’互补,N₆和N_6’互补，以及N₇和N_7’互补。

17.如权利要求1到16中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述第一区包括序列列表中的序列。

18.一种包括两种寡核苷酸单体的分离的引物-二聚体，所述寡核苷酸单体从5’到3’包括，

i)第一区，所述第一区包括自身互补序列，所述自身互补序列从5’到3’包括切口酶识别序列的反向互补序列、回文序列以及所述切口酶识别序列，和

ii)第二区，所述第二区的长度至少是16个核苷酸，所述第二区特异性地结合至目标核酸分子上的互补区以形成双链杂合体，所述双链杂合体具有比包括所述第二区的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG，其中所述第二区在3’末端包括一个或多个2’修饰的核苷酸。

19.如权利要求18所述的分离的引物-二聚体，其中位于所述第一区的所述回文序列的长度是2、4或6个核苷酸。

20.如权利要求18或19所述的分离的引物-二聚体，其中所述第一区的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸。

21.如权利要求18到20中任一项所述的分离的引物-二聚体，其中所述第二区的长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

22.如权利要求18到21中任一项所述的分离的引物-二聚体，其中所述第一区完全自身互补。

23.如权利要求18到22中任一项所述的分离的引物-二聚体，其中所述交替结构为一个或多个部分双链的杂合体，所述一个或多个部分双链的杂合体能够由所述第二区自身形成、由所述第二区与所述第一区的部分序列形成、由所述第二区与扩增反应中的其他寡核苷酸，引物或探针形成、或由所述第二区与目标序列区外部的部分互补的核酸序列形成。

24.如权利要求18到23中任一项所述的分离的引物-二聚体，所述分离的引物-二聚体呈同源二聚体的形式，所述同源二聚体由两种寡核苷酸单体的所述自身互补的第一区序列的杂交形成。

25.如权利要求24所述的分离的引物-二聚体，其中所述同源二聚体具有比包括所述寡核苷酸单体的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG。

26.如权利要求18到25中任一项所述的分离的引物-二聚体，其中所述一个或多个2’修饰的核苷酸具有2’变体，所述2’变体选自由2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-羟基、2’-烷基、2’-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]、4’-硫代、4’-CH₂-O-2’-桥、4’-(CH₂)₂-O-2’-桥、2’-LNA和2’-O-(N-氨基甲酸甲酯)组成的组或包括碱基类似物的那些结构。

27.如权利要求18到26中任一项所述的分离的引物-二聚体，其中所述一个或多个2’修饰的核苷酸位于所述第二区的3’末端。

28.如权利要求26或27所述的分离的引物-二聚体，其中所述两个或更多个2’修饰的核苷酸是相邻的。

29.如权利要求28所述的分离的引物-二聚体，其中相邻的2’修饰的核苷酸的数量为4、5或6。

30.如权利要求18到29中任一项所述的分离的引物-二聚体，其中所述切口酶是Nt.BspD6I和Nt.BstNBI中的一个或多个。

31.如权利要求30所述的分离的引物-二聚体，其中所述第一区内的所述切口酶识别序列是5’-GAGTC-3’。

32.如权利要求18到31中任一项所述的分离的引物-二聚体，其中放置所述切割剂的识别序列以切割所述第一区和所述第二区之间的磷酸二酯键。

33.如权利要求18到32中任一项所述的分离的引物-二聚体，所述寡核苷酸单体具有包括如下所述核酸序列的第一区：

5’-GACTCN₁N_1’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₁N_1’GAGTCN-3’；

5’-N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’-3’；

5’-N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N-3’；

5’-N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’-3’；

5’-N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’N-3’；

5’-N₅N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’N_5’-3’；

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN-3’；

5’-N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’-3’；

5’-N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N-3’；

5’-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N-3’；

5’-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’N-3’；和

5’-N₆N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’N_6’-3’,

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNNN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNNNN-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’NN-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’NNN-3’；

5’-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N-3’；

5’-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’-3’；

5’-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’N-3’；以及

5’-N₇N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’N_7’-3’,

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)核碱基)，并且N₁和N_1’互补,N₂和N_2’互补,N₃和N_3’互补,N₄和N_4’互补,N₅和N_5’互补,N₆和N_6’互补，以及N₇和N_7’互补。

34.如权利要求18到33中任一项所述的分离的引物-二聚体，其中所述寡核苷酸单体包括第一区，所述第一区包括序列列表中的序列。

35.一种用来检测目标核酸分子的分离的寡核苷酸探针，包括：

i)寡核苷酸；

ii)荧光报道物；以及

iii)淬灭分子，所述淬灭分子能从所述荧光报道物吸收激发能；

其中，所述荧光报道物和所述淬灭分子共价地附接于所述寡核苷酸相对的5’和3’端，

其中，所述寡核苷酸包括第一区，所述第一区具有大体互补于目标核酸序列的核酸序列，和

a)位于所述第一区上游的第二区的5’，以及

b)位于所述第一区下游的第三区的3’，所述第三区的3’具有和所述第二区互补的核酸序列，

其中，当所述寡核苷酸未结合至目标核酸分子时，所述寡核苷酸能通过所述第二区和所述第三区的杂合作用形成茎环结构发夹结构，以及

其中，所述目标序列和所述寡核苷酸探针的所述第一序列之间的双链杂合体的ΔG比包含所述寡核苷酸探针的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol。

36.如权利要求35所述的分离的寡核苷酸探针，其中所述交替结构是一个或多个部分双链的杂合体，所述一个或多个部分双链的杂合体能够由所述第一区自身形成、由所述第一区与所述第一区的部分序列形成、由所述第一区与扩增反应中的其他寡核苷酸，引物或探针形成、或所述第一区与由所述目标序列区外部的部分互补的核酸序列形成。

37.如权利要求35或36所述的分离的寡核苷酸探针，其中所述第二区和所述第三区的长度是4到8个核苷酸。

38.一种在切割和扩展扩增反应中扩增特异性产物的方法，所述方法包括：

(a)在大致等温条件下，将目标核酸分子和聚合酶、两种或更多种引物、切口酶以及可检测的寡核苷酸探针接触，所述两种或更多种引物中的每个特异性地结合至目标核酸分子上的互补序列，其中至少一种引物从5’到3’包括，

i)第一区，所述第一区包括自身互补序列，所述自身互补序列从5’到3’包括切口酶识别序列的反向互补序列、回文序列以及所述切口酶识别序列，和

ii)第二区，所述第二区的长度至少是16个核苷酸，所述第二区特异性地结合至目标核酸分子上的互补区以形成双链杂合体，所述双链杂合体具有比包括所述第二区的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG，其中所述第二区在3’末端包括一个或多个2’修饰的核苷酸；以及

b)生成扩增子，所述扩增子包括至少一部分所述目标核酸分子。

39.一种在切割和扩展扩增反应中检测特异性产物的方法，所述方法包括：

(a)在大致等温条件下，将目标核酸分子和聚合酶、两种或更多种引物、切口酶以及可检测的寡核苷酸探针接触，所述两种或更多种引物中每个特异性地结合至目标核酸分子上的互补序列，其中至少一种引物从5’到3’包括，

i)第一区，所述第一区包括自身互补序列，所述自身互补序列从5’到3’包括切口酶识别序列的反向互补序列、回文序列以及所述切口酶识别序列，和

ii)第二区，所述第二区的长度至少是16个核苷酸，所述第二区特异性地结合至目标核酸分子上的互补区以形成双链杂合体，所述双链杂合体具有比包括所述第二区的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG，其中所述第二区在3’末端包括一个或多个2’修饰的核苷酸；

b)生成扩增子，所述扩增子包括至少一部分所述目标核酸分子；以及

(c)检测将寡核苷酸探针杂合到所述目标核酸分子或其扩增子的特定信号，其中所述信号表明样品或其扩增子中存在所述目标核酸分子。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述寡核苷酸探针包括：

i)寡核苷酸；

ii)荧光报道物；以及

iii)淬灭分子，所述淬灭分子能从所述荧光报道物吸收激发能；

其中，所述荧光报道物和所述淬灭分子共价地附接于所述寡核苷酸相对的5’和3’端，

其中，所述寡核苷酸包括第一区，所述第一区具有大体互补于目标核酸序列的核酸序列，和

a)位于所述第一区上游的第二区的5’，以及

b)位于所述第一区下游的第三区的3’，所述第三区的3’具有和所述第二区互补的核酸序列，

其中，当所述寡核苷酸未结合至目标核酸分子时，所述寡核苷酸能通过所述第二区和所述第三区的杂合作用形成茎环结构发夹结构。

41.如权利要求38到40中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是杆菌属或嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶I或活性片段和其衍生物。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述聚合酶是Bst DNA聚合酶I、Gst DNA聚合酶I或Gka DNA聚合酶I中的一种或多种。

43.如权利要求42所述的方法，其中在所述第一区的所述回文序列的长度是2、4或6个核苷酸。

44.如权利要求38到43中任一项所述的方法，其中所述第一区的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸。

45.如权利要求38到44中任一项所述的方法，其中所述第二区的长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

46.如权利要求38到45中任一项所述的方法，其中所述第一区完全自身互补。

47.如权利要求38到46中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述交替结构为一个或多个部分双链的杂合体，所述一个或多个部分双链的杂合体能够由所述第二区自身形成、由所述第二区与所述第一区的部分序列形成、由所述第二区与扩增反应中的其他寡核苷酸，引物或探针形成、或由所述第二区与目标序列区外部的部分互补的核酸序列形成。

48.如权利要求38到47中任一项所述的分离的引物寡核苷酸，所述分离的引物寡核苷酸呈同源二聚体的形式，所述同源二聚体由两种引物寡核苷酸分子的所述自身互补的第一区序列的杂交形成。

49.如权利要求48所述的分离的引物寡核苷酸，其中所述同源二聚体具有比包括所述引物寡核苷酸的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG。

50.如权利要求38到49中任一项所述的方法，其中所述一个或多个2’修饰的核苷酸具有2’变体，所述2’变体选自由2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-羟基、2’-烷基、2’-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]、4’-硫代、4’-CH₂-O-2’-桥、4’-(CH₂)₂-O-2’-桥、2’-LNA和2’-O-(N-氨基甲酸甲酯)组成的组或包括碱基类似物的那些结构。

51.如权利要求38到50中任一项所述的方法，其中所述一个或多个2’修饰的核苷酸位于所述第二区的3’末端。

52.如权利要求38或51所述的方法，其中所述两个或更多个2’修饰的核苷酸是相邻的。

53.如权利要求52所述的方法，其中相邻的2’修饰的核苷酸的数量为4、5或6。

54.如权利要求38到53中任一项所述的方法，其中所述切口酶是Nt.BspD6I和Nt.BstNBI中的一个或多个。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述第一区里的所述切口酶识别序列是5’-GAGTC-3’。

56.如权利要求38到55中任一项所述的方法，其中放置所述切割剂的识别序列以切割所述第一区和所述第二区之间的磷酸二酯键。

57.如权利要求38到56中任一项所述的方法，其中所述引物具有包括如下所述核酸序列的第一区：

5’-GACTCN₁N_1’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₁N_1’GAGTCN-3’；

5’-N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’-3’；

5’-N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N-3’；

5’-N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’-3’；

5’-N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’N-3’；

5’-N₅N₄N₃N₂GACTCN₁N_1’GAGTCN_2’N_3’N_4’N_5’-3’；

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN-3’；

5’-N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’-3’；

5’-N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N-3’；

5’-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’-3’；

5’-N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N-3’；

5’-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’N-3’；和

5’-N₆N₅N₄N₃GACTCN₂N₁N_1’N_2’GAGTCN_3’N_4’N_5’N_6’-3’,

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTC-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNNN-3’；

5’-GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCNNNN-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’NN-3’；

5’-N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’NNN-3’；

5’-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’-3’；

5’-N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N-3’；

5’-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’-3’；

5’-N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’N-3’；以及

5’-N₇N₆N₅N₄GACTCN₃N₂N₁N_1’N_2’N_3’GAGTCN_4’N_5’N_6’N_7’-3’,

其中，“N”是任意核苷酸(例如，具有腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)核碱基)，并且N₁和N_1’互补,N₂和N_2’互补,N₃和N_3’互补,N₄和N_4’互补,N₅和N_5’互补,N₆和N_6’互补，以及N₇和N_7’互补。

58.如权利要求38到57中任一项所述的方法，其中所述引物包括第一区，所述第一区包括序列列表中的序列。

59.一种在切断扩增反应中扩增目标序列的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种引物寡核苷酸，所述引物寡核苷酸从5’到3’包括，

i)第一区，所述第一区包括自身互补序列，所述自身互补序列从5’到3’包括切口酶识别序列的反向互补序列、回文序列以及所述切口酶识别序列，和

ii)第二区，所述第二区的长度至少是16个核苷酸，所述第二区特异性地结合至目标核酸分子上的互补区以形成双链杂合体，所述双链杂合体具有比包括所述第二区的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol的ΔG，其中所述第二区在3’末端包括一个或多个2’修饰的核苷酸；

以及权利要求38到58任一方法中的所述引物寡核苷酸的使用说明。

60.如权利要求59所述的试剂盒，还包括寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括：

i)寡核苷酸；

ii)荧光报道物；以及

iii)淬灭分子，所述淬灭分子能从所述荧光报道物吸收激发能；

其中，所述荧光报道物和所述淬灭分子共价地附接于所述寡核苷酸相对的5’和3’端，

其中，所述寡核苷酸包括第一区，所述第一区具有大体互补于目标核酸序列的核酸序列，和

a)位于所述第一区上游的第二区的5’，以及

b)位于所述第一区下游的第三区的3’，所述第三区的3’具有和所述第二区互补的核酸序列，

其中，当所述寡核苷酸未结合至目标核酸分子时，所述寡核苷酸能通过所述第二区和所述第三区的杂合作用形成茎环结构发夹结构；

以及权利要求38到58任一方法中的所述引物寡核苷酸的使用说明。

61.一种有形的，永久的计算机可读介质，包括执行挑选引物寡核苷酸的方法的计算机程序指令，所述引物寡核苷酸包括：

i)第一区，所述第一区包括自身互补序列，所述自身互补序列从5’到3’包括切口酶识别序列的反向互补序列、回文序列以及所述切口酶识别序列，和

ii)第二区，所述第二区的长度至少是16个核苷酸，所述第二区特异性地结合至目标核酸分子上的互补区；

所述方法包括：

a)挑选所述引物寡核苷酸的第二区，其中所述第二区和所述目标核酸分子杂合作用形成的双链杂合体的ΔG比包括所述第二区的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol；

b)挑选所述引物寡核苷酸的第一区，其中两种引物寡核苷酸分子的所述自身互补第一区的杂合作用形成的同源二聚体的ΔG比包括所述第二区的任意交替结构的ΔG低至少15kcal/mol。