本发明尤其涉及作为抗炎剂的化合物(例如，通过抑制以下家族的一个或多个成员：p38促分裂原活化蛋白激酶家族(在本文中称为p38map激酶抑制剂)，例如其α激酶亚型；syk激酶；和酪氨酸激酶的src家族)。本发明还涉及该化合物在疗法中的用途，包括在单一疗法和组合疗法中的用途，尤其是在治疗炎性疾病中的用途，所述炎性疾病包括肺(例如哮喘和慢性阻塞性肺病(copd))、眼(例如葡萄膜炎或干燥性角结膜炎(干眼疾病，亦称为干眼症(xerophthalmia)))和胃肠道(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)的炎性疾病。
本说明书中明显在先公布的资料的列表或论述不应必然被认为承认所述资料是现有技术的一部分，或者是公知常识。
已鉴定了四种p38mapk同种型(分别为α、β、γ和δ)，各自显示不同的组织表达模式。发现p38mapkα和β同种型普遍存在于整个身体中，存在于许多不同的细胞类型，和受许多先前描述的小分子量化合物抑制。由于这些同种型的广泛的组织分布(其导致所述化合物的脱靶作用)所致，早期类型的抑制剂是高度毒性的。一些更近期鉴定的抑制剂显示对p38mapkα和β同种型改进的选择性和具有更宽的安全限度。
认为p38map激酶在许多信号转导途径中起关键作用，所述信号转导途径参与引发和维持人类疾病的慢性、持续性炎症，所述疾病例如严重哮喘、copd和炎性肠病(ibd)。目前有大量文献证实，p38map激酶被许多促炎细胞因子活化，并且其活化导致更多促炎细胞因子的募集和释放。事实上，来自一些临床研究的数据证实在用p38map激酶抑制剂治疗期间患者的疾病活动的有益改变。例如，smith描述了p38map激酶抑制剂对tnfα(而不是il-8)从人pbmc释放的抑制作用(smith,s.j.,br.j.pharmacol.,2006,149:393-404)。
还提出了p38map激酶抑制剂在治疗copd和ibd中的用途。靶向p38mapkα/β的小分子抑制剂已证明在以下中有效减少炎症的各种参数：
-获自copd患者的细胞和组织，所述患者通常是皮质类固醇不敏感的(smith,s.j.,br.j.pharmacol.,2006,149:393-404)；
-来自ibd患者的活检(docena,g.等,j.trans.immunol.,2010,162:108-115)；和
-体内动物模型(underwood,d.c.等,am.j.physiol.,2000,279:l895-902;nath,p.等,eur.j.pharmacol.,2006,544:160-167)。
irusen和其同事还提示了p38mapkα/β通过降低细胞核中的糖皮质激素受体(gr)的结合亲和力而参与皮质类固醇不敏感性的可能性(irusen,e.等,j.allergyclin.immunol.,2002,109:649-657)。已描述了用许多p38map激酶抑制剂(包括amg548、birb796、vx702、scio469和scio323)对炎性疾病的临床研究(lee,m.r.和dominguez,c.,currentmed.chem.,2005,12:2979-2994.)。然而，妨碍p38map激酶抑制剂在治疗人类慢性炎性疾病中的效用的主要障碍是在患者中观察到的毒性。其足够严重而导致已进行的许多化合物(包括上文具体提到的那些)从临床开发中撤出。
copd是这样的病况，其中据报道，基础炎症显著抵抗吸入的皮质类固醇的抗-炎性作用。因此，治疗copd的较好的策略是开发同时具有内在抗-炎性作用和增加copd患者的肺组织对吸入的皮质类固醇的敏感性的能力的干预。mercado等的近期出版物(2007;americanthoracicsocietyabstracta56)证实，沉默p38mapkγ具有恢复对皮质类固醇的敏感性的潜力。因此，在使用p38map激酶抑制剂以治疗copd时，可存在对患者的双重益处。
诊断患有哮喘或copd的许多患者持续遭受不受控制的症状和其医学病况的恶化，可能导致住院。尽管使用最先进的目前可用的治疗方案(包括吸入皮质类固醇和长效β-激动剂的组合产品)，但这仍发生。在过去十年中积累的数据表明，未能有效管控肺中疾病的基础炎性组分是发生恶化的最可能的原因。鉴于皮质类固醇和特别是吸入皮质类固醇作为治疗哮喘中的抗炎剂的确立的功效，这些发现引起强烈的研究。得到的研究结果确定，一些环境刺激引起患者的肺中的皮质类固醇-不敏感的炎性改变。实例是自病毒介导的上呼吸道感染(urti)产生的应答，其在增加与哮喘和copd相关的发病率中具有特殊的意义。
先前已经公开了抑制c-src和syk激酶两者的活性的化合物是抗鼻病毒复制的有效试剂(charron,c.e.等,wo2011/158042)，和抑制p59-hck的化合物有效对抗流感病毒复制(charron,c.e.等,wo2011/070369)。与p38mapk的抑制一起，这些是意欲治疗慢性呼吸疾病的患者的化合物所具有的特别有吸引力的性质。
某些p38mapk抑制剂还描述为呼吸道合胞病毒的复制的抑制剂(cassl.等,wo2011/158039)。
ibd的准确病因学是不确定的，但认为受相互作用以促进针对腔内微生物群组分的过度但弱控制的粘膜炎性应答的遗传和环境因素的支配。该应答通过来自外周的炎性嗜中性粒细胞、树突细胞和t-细胞的浸润介导。因为其在炎性细胞中普遍存在的表达，p38已成为ibd模型的明显的研究靶标。在ibd的动物模型和来自ibd患者的人活检中研究p38抑制剂的功效的结果表明，p38可能是用于治疗ibd的靶标(hove,t.ten等,gut,2002,50:507-512,docena,g.等,j.trans.immunol,.2010,162:108-115)。然而，这些发现与报告用p38抑制剂没有作用的其它组不完全一致(malamutg.等,dig.dis.sci,2006,51:1443-1453)。在克罗恩患者中使用p38α抑制剂birb796的临床研究证实具有c-反应蛋白水平改善的潜在临床益处。然而该改善是暂时的，第8周时返回基线(schreiber,s.等,clin.gastro.hepatology,2006,4:325-334)。在严重克罗恩病的患者中研究cni-1493(一种p38和jnk抑制剂)的功效的小型临床研究显示在8周期间临床评分的显著改善(hommes,d.等gastroenterology.2002122:7-14)。
已知t细胞在介导胃肠道的炎症中起重要作用。powrie和其同事的先驱工作证实，幼稚cd4+细胞转移至严重缺乏免疫力的免疫缺陷(scid)动物中导致发生依赖于共生细菌的存在的结肠炎(powrief.等intimmunol.19935:1461-71)。此外，来自ibd患者的粘膜的研究显示cd4+细胞的增量调节，所述细胞为th1(ifng/il-2)或th2(il5/tgfb)偏好的，这取决于患者患有克罗恩病还是溃疡性结肠炎(fussij.等jimmunol.1996157:1261-70.)。类似地，已知t细胞在眼的炎性病症中起重要作用，数个研究结果报告了在贝切特(beçhets)患者的血清中t细胞相关细胞因子(il-17和il-23)的水平增加(chiw.等investophthalmolvissci.200849:3058-64)。支持这些观察结果，direskeneli和其同事证实，在贝切特患者的外周血中th17细胞增加和treg细胞减少(direskenelih.等jallergyclinimmunol.2011128:665-6)。
一种抑制t细胞活化的方法是靶向参与t细胞受体信号转导复合物的活化的激酶。已知syk和src家族激酶在该途径中起重要作用，其中src家族激酶fyn和lck是在t细胞受体下游待活化的第一个信号转导分子(barberek.等pnas1989,86:3277-81)。它们启动t细胞受体的酪氨酸磷酸化，导致syk家族激酶zap-70的募集。动物研究显示，zap-70敲除产生scid表型(chanac.等science.1994,10;264(5165):1599-601)。
用syk抑制剂fostamatinib的类风湿性关节炎患者的临床试验证实syk作为抗炎靶标的潜力，其中患者显示临床结果改善和il-6和mmp-3的血清水平降低(weinblattme.等arthritisrheum.200858:3309-18)。syk激酶在造血系统的细胞中广泛表达，最显著是在b细胞和成熟t细胞中。通过与基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)相互作用，它在调节t细胞和b细胞扩大以及在炎性细胞中介导免疫-受体信号转导中起重要作用。syk活化导致il-6和mmp释放–通常发现在炎性病症包括ibd和类风湿性关节炎中增量调节的炎性介质(wangyd.等worldjgastroenterol2007;13:5926-5932,litinskyi等cytokine.2006jan33:106-10)。
除了在控制促-炎性途径的活性的细胞信号转导事件中起重要作用之外，目前还认识到，激酶调节多种细胞功能的活性，包括dna完整性的保持(shilo,y.naturereviewscancer,2003,3:155-168)和细胞分裂的复杂过程的共协调。事实上，已发现某些激酶抑制剂(所谓的“olaharski激酶”)改变体外微核形成的频率(olaharski,a.j.等,ploscomput.biol.,2009,5(7),e1000446;doi:10.1371/journal.pcbi.1000446)。微核形成涉及有丝分裂过程的中断或与之相关，因此是不合需要的。发现糖原合酶激酶3α(gsk3α)的抑制是特别重要的因素，其增加激酶抑制剂促进微核形成的可能性。此外，已报道用rnai抑制激酶gsk3β促进微核形成(tighe,a.等,bmccellbiology,2007,8:34)。
尽管有可能通过将剂量最优化和/或通过改变分子的给药途径来减弱olaharski激酶例如gsk3α的抑制的不良作用，但鉴定其它在治疗上有用的分子将是有利的，所述分子具有低的或可忽略的olaharski激酶例如gsk3α的抑制和/或具有低的或可忽略的有丝分裂过程的中断(例如，在有丝分裂测定法中所测量)。
公开了抑制一种或多种激酶的多种化合物，包括脲衍生物。这样的化合物的实例可见于wo99/23091,wo00/041698,wo00/043384,wo00/055139,wo01/36403,wo01/4115,wo02/083628,wo02/083642,wo02/092576,wo02/096876,wo2003/005999,wo2003/068223,wo2003/068228,wo2003/072569,wo2004/014870,wo2004/113352,wo2005/005396,wo2005/018624,wo2005/023761,wo2005/044825,wo2006/015775,wo2006/043090,wo2007/004749,wo2007/053394,wo2013/050756,wo2013/050757,wo2014/027209,wo2014/033446,wo2014/033447,wo2014/033448,wo2014/033449,wo2014/076484,wo2014/140582wo2014/162121,wo2014/162122,wo2014/162126和wo2015/092423。其它实例可见于在以下中公开的论文：
-curr.opin.drugdevel.(2004,7(5),600-616)；
-j.med.chem.(2007,50,4016-4026;2009,52,3881-3891；和2010,53,5639-5655)；
-bioorg.med.chem.lett.(2007,17,354–357;2008,18,3251-3255；2009,19,2386-2391；和2010,20,4819-4824)；
-curr.top.med.chem.(2008,8,1452-1467)；
-bioorg.med.chem.(2010,18,5738-5748)；
-eur.j.pharmacol.(2010,632,93-102)；
-j.chem.inf.model.(2011,51,115-129)；和
-br.j.pharmacol.(2015,172,3805–3816)。
尽管如此，对鉴定和开发新的激酶抑制剂仍存在需要，特别是适合治疗炎症的替代的p38map激酶抑制剂。尤其需要这样的抑制剂，其相对于目前可用的治疗具有改进的治疗潜力，或者具体而言，其显示优良的治疗指数(例如，至少同样有效的抑制剂，和在一个或多个方面，与之前的药剂相比在相关治疗剂量下具有更少毒性的抑制剂)。
出人意料的是，目前我们发现，带有苯甲酸苯胺的二芳基脲抑制p38map激酶、syk和src家族激酶中的一种或多种，因此具有良好的抗-炎性质。
因此，根据本发明的第一方面，提供式i的化合物，
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，
所述化合物在下文中可称为"本发明的化合物"。
可提及的药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。这样的盐可通过常规方式形成，例如通过将式i的化合物的游离酸或游离碱形式与一个或多个当量的合适的酸或碱任选地在溶剂中或在介质中(其中所述盐为不溶的)反应，接着使用标准技术(例如在真空中、通过冷冻干燥或通过过滤)除去所述溶剂或所述介质。盐还可通过交换呈盐形式的式i的化合物的反荷离子为另一反荷离子，例如使用合适的离子交换树脂制备。
药学上可接受的盐的实例包括源自无机酸和有机酸的酸加成盐，和源自金属的盐。
为避免疑惑，式i的化合物可含有呈任一种其天然或非天然同位素形式的规定的原子。在该方面，可提及的本发明的实施方案包括这样的实施方案，其中：
(a)关于式i的化合物的任何原子，所述化合物不是同位素富集或标记的；和
(b)关于式i的化合物的一个或多个原子，所述化合物是同位素富集或标记的。
本文对"同位素衍生物"的提及，涉及这两个实施方案的第二个。在本发明的具体的实施方案中，式i的化合物是用一种或多种稳定同位素进行同位素富集或标记的(关于化合物的一个或多个原子)。因此，可提及的本发明的化合物包括，例如用一个或多个原子例如氘等进行同位素富集或标记的式i的化合物。
式i的化合物可显示互变异构现象。所有互变异构形式和其混合物包括在本发明的范围内。
除非另外说明，否则本文定义的烷基和烷氧基可以是直链的，或者当存在足够数量(即，最少3个)的碳原子时，可以是支链的。可提及的具体的烷基包括例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、正丁基和叔丁基。可提及的具体的烷氧基包括例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。
除非另外说明，否则本文定义的亚烷基可以是直链的，或者当存在足够数量(即，最少2个)的碳原子时，可以是支链的。在本发明的具体的实施方案中，亚烷基是指直链亚烷基。
除非另外说明，否则芳基的连接点可以通过环系统的任何原子。然而，当芳基是双环或三环的时，它们通过芳环与分子的剩余部分连接。c6-14芳基包括苯基、萘基等。可提及的本发明的实施方案包括其中芳基是苯基的那些。
除非另外说明，否则术语"卤代"包括提及氟代、氯代、溴代或碘代，特别是氟代、氯代或溴代，尤其是氟代或氯代。
式i的化合物具有名称4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸，但也可称为化学名称4-[[4-[[4-[[5-叔丁基-3-(甲磺酰胺基)-2-甲氧基苯基]-氨基甲酰基氨基]-1-萘基]氧基]-2-吡啶基]氨基]-2-甲氧基-苯甲酸。
式i的化合物的盐的实例包括所有药学上可接受的盐，例如但不限于强无机酸的酸加成盐，例如hcl、h2so4和hbr盐(例如hcl或hbr盐)，和强有机酸例如甲磺酸的加成盐。
可提及的式i的化合物的具体盐包括盐酸盐和钠、铵、钙、镁、n-甲基葡糖胺((2r,3r,4r,5s)-6-(甲基氨基)-己烷-1,2,3,4,5-五醇)或苯乙苄胺(n-苄基-2-苯乙胺)盐(例如，钠或铵盐)。
因此，可提及的本发明的实施方案包括4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸的盐酸盐、钠盐、钙盐、镁盐或铵盐。
可提及的式i的化合物的更具体的盐包括盐酸盐、钠盐和铵盐。
本文对本发明的化合物(式i的化合物)的提及意欲包括提及所述化合物和所述化合物的所有药学上可接受的盐、溶剂合物和/或互变异构体，除非上下文明确另外说明。在该方面，可提及的溶剂合物包括水合物。
本发明的化合物(式i的化合物)是p38map激酶(尤其是α亚型)、syk激酶和src家族激酶，例如src和lck抑制剂，因此可用于药物，特别是用于治疗炎性疾病。因此，可提及的本发明的进一步的方面包括以下内容。
(a)药物制剂，包含与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的前文定义的式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物。
(b)组合产品，包含
(a)前文定义的式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，和
(b)另一治疗剂，
其中组分(a)和(b)各自与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合配制。
在本发明的该方面，组合产品可以是单一(组合)药物制剂或分部药盒(kitofparts)。
因此，本发明的该方面包括药物制剂，其包含与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的前文定义的式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物和另一治疗剂(所述制剂在下文称为“组合制剂”)。
还包括分部药盒，其包含以下组分：
(i)药物制剂，包含与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的前文定义的式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物；和
(ii)药物制剂，包含与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的另一治疗剂，
所述组分(i)和(ii)各自以合适于彼此联合给予的形式提供。
因此，分部药盒的组分(i)是上文与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的组分(a)。类似地，组分(ii)是上文与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的组分(b)。
(c)用于制备上文方面(a)的药物制剂的方法，所述方法包括混合前文定义的式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体的步骤。
可提及的本发明该方面的实施方案包括这样的实施方案，其中药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体是局部可接受的辅剂、稀释剂或载体(和/或其中所述方法用于制备局部药物制剂，即适合于局部给予的药物制剂)。
(d)前文定义的式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，其用于医学用途(或用作药物或药剂)。
(e)前文定义的式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品，其用于治疗或预防炎性疾病。
(f)前文定义的式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或
关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品，
在制备用于治疗或预防炎性疾病的药物中的用途。
(g)治疗或预防炎性疾病的方法，所述方法包括给予受试者有效量的
前文定义的式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或者
关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品。
(h)敏化受试者对皮质类固醇的抗炎性作用的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的
前文定义的式i的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或者
关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品。
可提及的本发明该方面的实施方案包括这样的实施方案，其中所述受试者是已变得对皮质类固醇的抗炎性作用不应的受试者。
本文提及“预防炎性疾病”包括提及在之前患有炎性疾病的受试者(例如，之前已接受所述疾病的治疗，例如根据上文(g)中描述的方法的治疗的受试者)中预防这样的疾病的复发(或降低其可能性)。
因此，可提及的本发明的其它方面包括以下内容。
(i)前文定义的式i的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品，其用于在之前已接受炎性疾病的治疗(例如，用前文定义的式i的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品治疗)的受试者中降低所述疾病的复发的可能性。
(j)前文定义的式i的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或
关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品，
在制备药物中的用途，所述药物用于在之前已接受炎性疾病的治疗(例如，用前文定义的式i的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品治疗)的受试者中降低所述疾病的复发的可能性。
(k)在之前已接受炎性疾病的治疗(例如，用前文定义的式i的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品治疗)的受试者中降低所述疾病的复发的可能性的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的
前文定义的式i的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或
关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品。
制剂
关于上文的方面(a)和(b)，可提及的稀释剂和载体包括合适于胃肠外、口服、局部、粘膜和直肠给药的那些。
上文的方面(a)和(b)的药物制剂和组合产品可经制备用于例如胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、玻璃体内、眼周、眼球后、结膜下、囊下(sub-tenon)、局部眼或关节周围给药，特别是呈液体溶液剂、乳剂或混悬剂的形式；用于口服给药，特别是呈片剂或胶囊剂的形式，和尤其包括目的为提供结肠靶向的药物释放的技术(patel,m.m.expertopin.drugdeliv.2011,8(10),1247–1258)；用于局部例如经肺或鼻内给药，特别是呈粉剂、鼻滴剂或气雾剂的形式，和经皮给药；用于局部眼给药，特别是呈溶液剂、乳剂、混悬剂、软膏剂、植入物/插入物、凝胶剂、胶冻剂或脂质体微粒制剂的形式(ghate,d.;edelhauser,h.f.expertopin.drugdeliv.2006,3(2),275–287)；用于眼给药，特别是呈可生物降解的和不能生物降解的植入物、脂质体和纳米粒的形式(thrimawithana,t.r.等drugdiscov.today2011,16(5/6),270–277)；用于粘膜给药至例如颊、舌下或阴道粘膜，和用于直肠给药，例如呈栓剂或灌肠剂的形式。
上文的方面(a)和(b)的药物制剂和组合产品可合适地以单位剂型给予，并且可通过制药领域众所周知的任何方法制备，例如描述于remington'spharmaceuticalsciences,第17版,mackpublishingcompany,easton,pa.,(1985)。用于胃肠外给予的制剂可包含作为赋形剂的无菌水或盐水、亚烷基二醇例如丙二醇、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等。用于经鼻给予的制剂可以是固体，和可以包含赋形剂，例如乳糖或葡聚糖，或可以是以鼻滴剂或计量喷雾剂的形式使用的水性或油性溶液剂。对于经颊给药，典型的赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等。
合适于口服给予的药物制剂和组合产品可包含一种或多种生理学上相容的载体和/或赋形剂和可以呈固体或液体形式。片剂和胶囊剂可用以下制备：结合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、西黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；和表面活性剂，例如月桂基硫酸钠。液体组合物可包含常规添加剂，例如助悬剂，例如山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、糖浆、明胶、羧甲基-纤维素或食用脂；乳化剂，例如卵磷脂或阿拉伯胶；植物油，例如杏仁油、椰子油、鱼肝油或花生油；防腐剂，例如丁羟基茴香醚(bha)和丁羟基甲苯(bht)。液体组合物可包封在例如明胶中以提供单位剂型。
固体口服剂型包括片剂、双片硬壳胶囊剂和软弹性明胶(seg)胶囊剂。这样的双片硬壳胶囊剂可自例如明胶或羟丙基甲基纤维素(hpmc)制备。
干壳制剂通常包含约40%-60%w/w浓度的明胶、约20%-30%浓度的增塑剂(例如甘油、山梨糖醇或丙二醇)和约30%-40%浓度的水。其它材料例如防腐剂、染料、遮光剂和矫味剂也可存在。液体填充材料包括已经溶解、增溶或分散的固体药物(用助悬剂例如蜂蜡、氢化蓖麻油或聚乙二醇4000)或在载体或载体的组合(例如矿物油、植物油、甘油三酯、二醇、多元醇和表面活性剂)中的液体药物。
本发明的化合物可局部给予(例如至肺、眼或肠)。因此，上文可提及的方面(a)和(b)的实施方案包括适合于局部给予的药物制剂和组合产品。这样的制剂包括其中赋形剂(包括任何辅剂、稀释剂和/或载体)为局部可接受的那些。
局部给予至肺可通过使用气雾剂制剂实现。气雾剂制剂通常包含悬浮或溶解于合适的气雾剂抛射剂(例如氟氯化碳(cfc)或氢氟化碳(hfc))中的活性成分。合适的cfc抛射剂包括三氯一氟甲烷(抛射剂11)、二氯四氟乙烷(抛射剂114)和二氯二氟甲烷(抛射剂12)。合适的hfc抛射剂包括四氟乙烷(hfc-134a)和七氟丙烷(hfc-227)。抛射剂通常包含总吸入组合物重量的40%-99.5%(例如40%-90%)。制剂可包含赋形剂，其包括共-溶剂(例如乙醇)和表面活性剂(例如卵磷脂、去水山梨糖醇三油酸酯等)。其它可能的赋形剂包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等。气雾剂制剂包装在罐中，合适的剂量通过剂量阀(例如由bespak、valois或3m提供或由aptar、coster或vari提供)来递送。
局部给予至肺还可通过使用非增压制剂例如水性溶液剂或混悬剂实现。这可通过喷雾器给予，例如可手持和便携式的喷雾器，或家用或医院用的喷雾器(即非便携式)。制剂可包含赋形剂，例如水、缓冲液、张度调节剂、ph调节剂、表面活性剂和共-溶剂。混悬液体剂和气雾剂制剂(无论是增压还是非增压的)将通常包含呈细粉形式的本发明的化合物，例如d50为0.5-10μm，例如约1-5μm。粒径分布可使用d10、d50和d90值表示。粒径分布的d50中位值定义为以微米计的将分布分成两半的粒径。源自激光衍射的测量更准确地描述为体积分布，因此使用该程序获得的d50值更有意义地称为dv50值(体积分布的中位值)。本文所用的dv值称为使用激光衍射测量的粒径分布。类似地，在激光衍射的情况下使用的d10和d90值意指dv10和dv90值，指的是这样的粒径，其中分别地，10%的分布在d10值之下而90%的分布在d90值之下。
局部给予至肺还可通过使用干粉制剂实现。干粉制剂将含有呈细粉形式的本公开内容的化合物，通常具有1-10µm的总气体动力学中位数直径(mmad)或0.5-10μm例如约1-5μm的d50。呈细粉形式的本发明的化合物的粉剂可通过微粉化过程或类似的尺寸减小过程制备。微粉化可使用气流粉碎机例如由hosokawaalpine制造的那些来进行。得到的粒径分布可使用激光衍射测量(例如用malvernmastersizer2000s仪器)。制剂将通常含有局部可接受的稀释剂，例如乳糖、葡萄糖或甘露醇(优选乳糖)，通常具有大的粒径，例如50µm或更大、例如100µm或更大的mmad，或40-150µm的d50。本文所用的术语“乳糖”是指含乳糖的组分，包括α-乳糖一水合物、β-乳糖一水合物、无水α-乳糖、无水β-乳糖和无定形乳糖。乳糖组分可通过微粉化、筛分、研磨、压制、团聚或喷雾干燥加工。还包括呈各种形式的市售可得形式的乳糖，例如lactohale®(吸入级乳糖；dfepharma)、inhalac®70(用于干粉吸入器的筛分乳糖；meggle)、pharmatose®(dfepharma)和respitose®(筛分吸入级乳糖；dfepharma)产品。在一个实施方案中，乳糖组分选自α-乳糖一水合物、无水α-乳糖和无定形乳糖。优选地，乳糖是α-乳糖一水合物。
干粉制剂还可包含其它赋形剂，例如硬脂酸钠、硬脂酸钙或硬脂酸镁。
干粉制剂通常使用干粉吸入器(dpi)装置来递送。干粉递送系统的实例包括旋转式吸入器(spinhaler)、diskhaler、turbohaler、diskus和clickhaler。干粉递送系统的其它实例包括eclipse、next、rotahaler、handihaler、aeroliser、cyclohaler、breezhaler/neohaler、monodose、flowcaps、twincaps、x-caps、turbospin、elpenhaler、miathaler、twisthaler、novolizer、pressair、ellipta、oriel干粉吸入器、microdose、pulvinal、easyhaler、ultrahaler、taifun、pulmojet、omnihaler、gyrohaler、taper、conix、xcelovair和prohaler。
在一个实施方案中，本发明的化合物以微粉化的干粉制剂提供，例如进一步包含合适级别的乳糖，任选地连同硬脂酸镁一起，填充入单剂量装置例如aeroliser或填充入多剂量装置例如diskus。
本发明的化合物还可经直肠给予，例如呈栓剂或灌肠剂的形式，其包括水性或油性溶液剂以及混悬剂和乳剂。这样的组合物按照本领域技术人员众所周知的标准程序制备。例如，栓剂可通过将活性成分与常规栓剂基质(例如可可脂或其它甘油酯，例如suppocire)混合制备。在该情况下，将药物与合适的非刺激性赋形剂混合，所述赋形剂在常温下是固体，但在直肠温度下是液体，因此将在直肠中熔化以释放药物。这样的材料是可可脂和聚乙二醇。
一般而言，对于意欲局部给予至眼的呈眼滴剂或眼软膏剂形式的组合物，抑制剂的总量将为约0.0001至低于4.0%(w/w)。
优选地，对于局部眼给药，按照本发明给予的组合物将被配制为溶液剂、混悬剂、乳剂和其它剂型。根据配制的容易性以及患者通过将1-2滴溶液滴入受累的眼睛里容易地给予这样的组合物的能力，水性溶液剂通常是优选的。然而，组合物也可以是混悬剂、粘稠或半粘稠凝胶剂或其它类型的固体或半固体组合物。对于难溶于水的化合物，混悬剂可为优选的。
根据本发明给予的组合物还可包括各种其它成分，包括但不限于，张度剂、缓冲剂、表面活性剂、稳定聚合物、防腐剂、共-溶剂和粘度构造剂。本发明的优选的药物组合物包括具有张度剂和缓冲剂的抑制剂。本发明的药物组合物还可任选地包括表面活性剂和/或姑息剂和/或稳定聚合物。
可使用各种张度剂以调节组合物的张度，对于眼用组合物，优选地调节至天然眼泪的张度。例如，氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、单糖例如葡萄糖、果糖、半乳糖和/或简单多元醇例如糖醇甘露醇、山梨醇、木糖醇、拉克替醇、异麦芽糖醇、麦芽糖醇和氢化淀粉水解产物可加入至组合物中以接近生理张度。这样的张度剂的量将根据待加入的具体试剂而改变。然而，一般而言，组合物具有足以导致最终组合物具有眼用可接受的渗透压(通常约150-450mosm，优选地250-350mosm和最优选地大约290mosm)的量的张度剂。一般而言，本发明的张度剂将以2-5%w/w(例如，2-4%w/w)的范围存在。本发明的优选的张度剂包括单糖或糖醇，例如d-甘露醇。
合适的缓冲剂系统(例如，磷酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或硼酸)可加入至组合物中以阻止在贮存条件下ph改变。具体的浓度将根据所用的试剂而改变。然而，优选地，选择缓冲剂以维持靶ph在ph5-8的范围内，和更优选地靶ph为ph5-7，或靶ph为ph6.5-7.6。
表面活性剂可任选地用于递送更高浓度的抑制剂。表面活性剂起增溶抑制剂和稳定胶体分散液(例如胶束溶液、微乳液、乳液和混悬液)的作用。可任选使用的表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯、泊洛沙姆、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚乙二醇蓖麻油、泰洛沙泊、triton和脱水山梨醇单月桂酸酯。用于本发明的优选的表面活性剂具有范围为12.4-13.2的亲水/亲脂/平衡"hlb"和对于眼用是可接受的，例如tritonx114和泰洛沙泊。
例如，用于眼睛局部给药的4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)-苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸或药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物的制剂可包含：
(a)水；
(b)表面活性剂(例如，聚乙二醇40硬脂酸酯)；
(c)张度剂(例如，甘露醇)；和
(d)合适的缓冲剂系统(例如，包含混合物磷酸二氢盐和磷酸一氢盐的磷酸盐缓冲液)，其经选择以保持靶ph在6.5-8的范围内。
在这样的局部眼用制剂中，以下的一项或多项(例如，全部)可适用：
(i)4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)-苯基)脲基)-萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸以0.001-20mg/ml(例如，0.01-10mg/ml，0.1-2mg/ml，或特别是1mg/ml)的浓度范围存在；
(ii)表面活性剂(例如，聚乙二醇40硬脂酸酯)以1-10%w/w(例如，2-5%w/w，例如2.5-4%w/w，或特别是3%w/w)存在；
(iii)张度剂(例如，甘露醇)以1-15%w/w(例如，2-10%w/w，例如3-6%w/w，或特别是4.5%w/w)存在；
(iv)用作制剂的组分的缓冲剂系统是水性磷酸盐缓冲液(例如，10mm水性磷酸盐缓冲液)，其经选择以保持靶ph在6.5-8.0的范围内(例如，在7.0-7.8，或特别是7.2-7.6的范围内)。
可加入本发明的眼用组合物的其它试剂是缓和剂，其起稳定聚合物的作用。稳定聚合物应该是优先用于局部眼用的离子的/带电荷的实例，更特别地，在其表面上带负电荷的聚合物，其可显示(–)10–50mv的ζ-电势而提供物理稳定性并且能够在水中形成分散液(即水溶性的)。本发明的优选的稳定聚合物是0.1–0.5%w/w的一种或多种(如果超过一种)聚电解质，其来自交联聚丙烯酸酯家族，例如卡波姆、聚卡波非和pemulen(r)，特别是卡波姆974p(聚丙烯酸)。
其它化合物也可加入至本发明的眼用组合物以增加载体的粘度。粘度增强剂的实例包括但不限于：多糖例如透明质酸和其盐、硫酸软骨素和其盐、葡聚糖、纤维素家族的各种聚合物、乙烯基聚合物和丙烯酸聚合物。
局部眼用产品通常以多剂量形式包装。因此需要防腐剂以防止在使用时的微生物污染。合适的防腐剂包括：苯扎氯铵、氯丁醇、苯扎溴铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯基乙基醇、乙二胺四乙酸二钠、山梨酸、聚季铵盐-1或本领域技术人员已知的其它防腐剂。这样的防腐剂通常以0.001-1.0%w/v的水平使用。本发明的单位剂量组合物是无菌的，但通常是不防腐的。因此，这样的组合物通常不含防腐剂。
医学从业者或其它技术人员将能够确定本发明的化合物的合适的剂量，因此能够确定应包括在任何特定药物制剂中的本发明的化合物的量(无论是呈单位剂型还是其它形式)。
结合上文(b)中所述的组合产品可提及的本发明的实施方案包括这样的实施方案，其中其它治疗剂是本领域技术人员已知的合适于治疗炎性疾病(例如下文提及的特定疾病)的一种或多种治疗剂。
例如，对于治疗呼吸病症(例如copd或哮喘)，其它治疗剂是选自以下的一种或多种药剂：
-类固醇(例如布地奈德、二丙酸氯地米松、丙酸氟替卡松、糠酸莫米松、糠酸氟替卡松；另一实例是环索奈德)；
-β激动剂，特别是β2激动剂(例如特布他林、沙丁胺醇、沙美特罗、福莫特罗；另一实例是维兰特罗、奥达特罗、瑞普特罗和非诺特罗)；和
-黄嘌呤(例如茶碱)。
例如，对于治疗呼吸病症(例如copd或哮喘)，其它治疗剂是选自以下的一种或多种药剂：
-毒蕈碱拮抗剂(例如tiotropium、umeclidinium、glycopyrronium、aclidinium和daratropium，这些的任何一种例如作为溴化物盐)；和
-磷酸二酯酶抑制剂。
此外，对于治疗胃肠病症(例如克罗恩病或溃疡性结肠炎)，其它治疗剂可以是例如选自以下的一种或多种药剂：
-5-氨基水杨酸或其前药(例如柳氮磺吡啶、奥沙拉嗪或巴柳氮)；
-皮质类固醇(例如泼尼松龙、甲基泼尼松龙或布地奈德)；
-免疫抑制剂(例如环孢菌素、他克莫司、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤)；
-抗-tnfα抗体(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗)；
-抗-il12/il23抗体(例如，ustekinumab)或小分子il12/il23抑制剂(例如，apilimod)；
-抗-α4β7抗体(例如，vedolizumab)；
-toll-样受体(tlr)阻断剂(例如，bl-7040;avecia(cambridge,uk))；
-madcam-1阻断剂(例如，pf-00547659)；
-针对细胞粘连分子α4-整联蛋白的抗体(例如，那他珠单抗)；
-针对il2受体α亚基的抗体(例如，达珠单抗或巴利昔单抗)；
-抗-smad7抗体(例如，mongersen(ged0301;全-p-周(ambo)-2'-脱氧-p-硫代鸟苷酰基-(3'→5')-p-硫代胸苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-5-甲基-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代鸟苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-p-硫代胸苷酰基-(3'→5')-p-硫代胸苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p硫代胞苷酰基-(3'→5')-p-硫代胸苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-5-甲基-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p硫代鸟苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代腺苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧-p-硫代鸟苷酰基-(3'→5')-2'-脱氧胞苷))；
-鞘胺醇1-磷酸受体1(s1p1)调节剂(例如，ozanimod((s)-5-(3-(1-((2-羟乙基)氨基)-2,3-二氢-1h-茚-4-基)-1,2,4-噁二唑-5-基)-2-异丙氧基苄腈)、amiselimod(mt1303;2-氨基-2-{2-[4-(庚基氧基)-3-(三氟甲基)苯基]乙基}丙烷-1,3-二醇)或apd334(2-[7-[4-环戊基-3-(三氟甲基)苄基氧基]-1,2,3,4-四氢环戊[b]吲哚-3(r)-基]乙酸))；
-jak抑制剂(例如，托法替尼、baricitinib(1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]-3-氮杂环丁烷乙腈)、filgotinib(n-[5-[4-[(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)甲基]苯基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]环丙烷甲酰胺)、peficitinib(4-(((1r,2r,3s,5s,7s)-5-羟基金刚烷-2-基)氨基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺)或r348(见例如us2014/0206708))；
-stat3抑制剂(例如，tak-114;(3e)-1-甲基-3-(2-氧代-1h-吲哚-3-亚基)吲哚-2-酮)；
-受体相互作用蛋白-1(rip1)激酶抑制剂(例如gsk2982772)；
-syk抑制剂和其前药(例如，fostamatinib和r-406)；
-磷酸二酯酶-4抑制剂(例如，替托司特)；
-hmpl-004；
-益生菌；
-微生物群(microbiome)调节剂(例如sgm1019)；
-德沙拉嗪(dersalazine)；
-塞马莫德(semapimod)/cpsi-2364；和
-蛋白激酶c抑制剂(例如aeb-071)
(例如，对于治疗胃肠病症(例如克罗恩病或溃疡性结肠炎)，其它治疗剂可以是例如，选自以下的一种或多种药剂：
-5-氨基水杨酸或其前药(例如柳氮磺吡啶、奥沙拉嗪或巴柳氮)；
-皮质类固醇(例如泼尼松龙、甲基泼尼松龙或布地奈德)；
-免疫抑制剂(例如环孢菌素、他克莫司、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤)；
-抗-tnfα抗体(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗)；
-抗-il12/il23抗体(例如，ustekinumab)或小分子il12/il23抑制剂(例如，apilimod)；
-抗-α4β7抗体(例如，vedolizumab)；
-madcam-1阻断剂(例如，pf-00547659)；
-针对细胞粘连分子α4-整联蛋白的抗体(例如，那他珠单抗)；
-针对il2受体α亚基的抗体(例如，达珠单抗或巴利昔单抗)；
-jak3抑制剂(例如托法替尼或r348)；
-syk抑制剂和其前药(例如，fostamatinib和r-406)；
-磷酸二酯酶-4抑制剂(例如，替托司特)；
-hmpl-004；
-益生菌；
-德沙拉嗪(dersalazine)；
-塞马莫德(semapimod)/cpsi-2364；和
-蛋白激酶c抑制剂(例如aeb-071)。
对于治疗眼病症(例如葡萄膜炎和干燥性角结膜炎(干眼))，其它治疗剂可以是例如选自以下的一种或多种药剂：
-皮质类固醇(例如地塞米松、泼尼松龙、曲安奈德、二氟泼尼酯或氟轻松)；
-糖皮质激素激动剂(例如，mapracorat)；
-免疫抑制剂(例如环孢菌素、voclosporin、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酸莫酯或他克莫司)；
-抗-tnfα抗体(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、esba-105或戈利木单抗)；
-抗-il-17a抗体(例如，secukinumab)；
-mtor抑制剂(例如，西罗莫司)；
-vgx-1027；
-腺苷a3受体激动剂(例如，cf-101)；
-lifitegrast；
-il1阻断剂(例如，ebi-005;hou等pnas2013,110(10),3913-3918)；
-rgn-259(胸腺肽β4)；
-si-614；
-otx-101；
-jnk抑制剂(例如，xg-104)；
-map激酶信号传导抑制剂(例如，da-6034;{[2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-甲氧基-4-氧代色烯-7-基]氧基}乙酸)；
-粘蛋白刺激物(例如，雷巴米特;2-[(4-氯苯甲酰基)氨基]-3-(2-氧代-1h-喹啉-4-基)丙酸)；
-mim-d3(tavilermide；参见例如us2013/0345395)；
-jak抑制剂(例如，托法替尼、baricitinib(1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]-3-氮杂环丁烷乙腈)、filgotinib(n-[5-[4-[(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)甲基]苯基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]环丙烷甲酰胺)、peficitinib(4-(((1r,2r,3s,5s,7s)-5-羟基金刚烷-2-基)氨基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺)或r348(见例如us2014/0206708))；和
-蛋白激酶c抑制剂(例如aeb-071)。
(例如，对于治疗眼病症(例如葡萄膜炎和干燥性角结膜炎(干眼))，其它治疗剂可以是例如，选自以下的一种或多种药剂：
-皮质类固醇(例如地塞米松、泼尼松龙、曲安奈德、二氟泼尼酯或氟轻松)；
-糖皮质激素激动剂(例如，mapracorat)；
-免疫抑制剂(例如环孢菌素、voclosporin、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酸莫酯或他克莫司)；
-抗-tnfα抗体(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、esba-105或戈利木单抗)；
-抗-il-17a抗体(例如，secukinumab)；
-mtor抑制剂(例如，西罗莫司)；
-vgx-1027；
-腺苷a3受体激动剂(例如，cf-101)；
-lifitegrast；
-jak3抑制剂(例如托法替尼或r348)；和
-蛋白激酶c抑制剂(例如aeb-071))。
在具体的实施方案中，对于治疗眼病症(例如葡萄膜炎和干燥性角结膜炎(干眼))，其它治疗剂可以是例如选自以下的一种或多种药剂：
-皮质类固醇(例如地塞米松、泼尼松龙、曲安奈德、二氟泼尼酯或氟轻松)；
-免疫抑制剂(例如环孢菌素、voclosporin、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酸莫酯或他克莫司)；
-抗-tnfα抗体(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、esba-105或戈利木单抗)；
-抗-il-17a抗体(例如，secukinumab)；
-mtor抑制剂(例如，西罗莫司)；
-vgx-1027；
-jak抑制剂(例如，托法替尼、baricitinib、filgotinib、peficitinib或r348)(例如jak3抑制剂，例如托法替尼或r348)；和
-蛋白激酶c抑制剂(例如aeb-071)。
医学用途
本发明的化合物可用作炎性疾病的单一疗法，或用于所述疾病的组合疗法。
因此，上文可提及的方面(e)-(g)的实施方案包括这样的实施方案，其中式i的化合物(或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物)是治疗中使用的唯一的药理学活性成分。
然而，在上文方面(e)-(g)的其它实施方案中，将式i的化合物(或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物)给予受试者，还给予所述受试者一种或多种其它治疗剂(例如，其中所述一种或多种其它治疗剂如上文关于组合产品所定义)。
当用于本文时，术语"炎性疾病"特别包括提及以下的任何一种或多种：
(i)具有炎性组分的肺疾病或病症，例如囊性纤维化、肺动脉高压、肺结节病、特发性肺纤维变性，或者特别地，copd(包括慢性支气管炎和肺气肿)、哮喘或儿科哮喘；
(ii)具有炎性组分的皮肤疾病或病症，例如特应性皮炎、变应性皮炎、接触性皮炎或银屑病；
(iii)具有炎性组分的鼻疾病或病症，例如变应性鼻炎、鼻炎或鼻窦炎；
(iv)具有炎性组分的眼疾病或病症，例如结膜炎、过敏性结膜炎、青光眼、糖尿病视网膜病、黄斑水肿(包括糖尿病黄斑水肿)、视网膜中央静脉阻塞(crvo)、干性和/或湿性年龄相关性黄斑变性(amd)、术后白内障炎症，或者特别地，干燥性角结膜炎(干眼，亦称为干眼症)、葡萄膜炎(包括后葡萄膜炎、前葡萄膜炎和泛葡萄膜炎)、角膜移植和缘细胞移植排斥；和
(v)具有炎性组分的胃肠疾病或病症，例如谷蛋白敏感性肠病(腹部疾病)、嗜酸性食管炎、肠移植物对抗宿主病，或者特别地，克罗恩病或溃疡性结肠炎。
本文对具有炎性组分的疾病的提及包括对涉及炎症的疾病的提及，无论是否存在所述疾病的其它(非-炎性)症状或后果。
根据本发明的进一步的方面，提供制备式i的化合物的方法，所述方法包括：
(a)将式ii的化合物，
与式iii的化合物，
其中z1和z2之一是式iv的结构片段
和z1和z2的另一个是式v的结构片段
例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在环境温度(例如15-30℃)至约110℃的温度下，在合适的有机溶剂(例如极性非质子溶剂，例如dmf、thf、1,4-二噁烷或其混合物)的存在下反应；
(b)将式iia的化合物，
其中z1如上文所定义，与合适的叠氮化物形成剂(即离去基团和活化的叠氮化物离子的合适来源，例如叠氮磷酸二苯酯；参见例如，tetrahedron1974,30,2151–2157)在本领域技术人员已知的条件下，例如在亚环境温度至环境温度(例如自约-5至5℃的起始温度至反应后的环境温度)下在胺碱(例如三乙基胺或空间位阻碱例如n,n-二异丙基乙基胺)和合适的有机溶剂(例如极性非质子溶剂，例如dmf、thf、1,4-二噁烷或其混合物)的存在下反应，该反应之后无需分离，接着中间体酰叠氮化物(具有式z1-c(o)-n3)的热重排(例如在加热下)，例如在环境温度(例如15-30℃)下，以原位提供式ii的化合物，该化合物然后与上文定义的式iii的化合物反应，提供式i的化合物；
(c)将式iib的化合物，
其中lg1表示合适的离去基团(例如咪唑基、氯或芳基氧基例如苯氧基)和z1如上文所定义，与如上文定义的式iii的化合物，例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在环境温度(例如自环境温度至80℃，例如在约60℃)下，任选地在胺碱(例如三乙基胺或空间位阻碱例如n,n-二异丙基乙基胺)和合适的有机溶剂(例如非质子溶剂，例如二氯甲烷或酯，例如乙酸异丙酯)的存在下反应；
(d)将式vi的化合物，
其中lg2表示合适的离去基团(例如卤素基团例如氯或溴)，与式vii的化合物，
例如在本领域技术人员已知的条件下(例如描述于j.am.chem.soc.2011,133,15686–15696)，例如在升高的温度(例如50-110℃)下在合适的有机溶剂(例如极性非质子溶剂，例如dmf、thf、1,4-二噁烷或其混合物)和任选酸性催化剂(例如磺酸，例如对甲苯磺酸)的存在下反应；
(e)将式i的化合物的受保护衍生物在本领域技术人员已知的条件下脱保护，其中受保护的衍生物在式i的化合物的o或n原子上带有保护基(并且为避免疑惑，一种式i的化合物的受保护衍生物可以代表或不代表另一种式i的化合物)。
式i的化合物的受保护衍生物的实例包括以下情况的那些衍生物：
-o原子被苄基保护，其中苄基可通过氢化除去，例如在钯催化剂(例如pd/c)的存在下；
-羧酸的o原子被烷基(例如甲基、乙基或叔丁基)保护，所述烷基可通过碱水解(例如对于甲基或乙基，通过使用碱金属氢氧化物例如氢氧化钠的水解反应)或酸水解(例如对于叔丁基，通过使用酸例如三氟乙酸的水解反应)除去。
式i的化合物的受保护衍生物还包括式viia的化合物，
其中qx表示-c(o)or4'，和r4'表示c1-4烷基(例如c4烷基或c1-3烷基，例如甲基)。
式ii的化合物可按照本领域技术人员已知的方法或与其类似的方法制备，例如通过将上文定义的式iia的化合物与叠氮化物形成剂反应，接着将中间体酰叠氮化物重排(如上文(b)中所述；参见例如tetrahedron1974,30,2151–2157)。
式iib的化合物可如下制备：将式viii的化合物，
其中lg1如前文定义，与式ix的化合物反应，
其中z1如前文定义，例如在本领域技术人员已知的条件下。
式ix的胺可自式iia的羧酸通过上文(b)中所述的路线制备，其中中间体异氰酸酯ii用水水解产生氨基甲酸，其失去二氧化碳以得到ix。同理，中间体异氰酸酯ii可与醇例如叔丁醇反应，产生受保护形式的ix。
式iii的化合物(其中z2表示式v的结构片段)或式ix的化合物(其中z1表示式v的结构片段)可使用流程1中概述的路线合成(参见例如：wo2003/072569;和wo2008/046216)，其中lg3和lg4表示离去基团，例如卤素或甲烷磺酰基，和fg表示真实的或潜在的nh2基团，即容易转化成nh2基团的基团，例如硝基或受保护的变体nh–pg2，其中pg2是典型的保护基(参见例如：greene,t.w.;wuts,p.g.m.protectivegroupsinorganicsynthesis;wiley,第四次修订版,2006;isbn-10:0471697540)，例如，氨基甲酸酯或甲酰胺。顺序开始于xi中的lg3经碱介导的snar置换为当x被碱处理以产生醚xii时形成的aroxide。然后，醚xii的剩余的卤素或甲烷磺酰基取代基(lg4)(i)在第二个snar反应中被置换为式vii的胺；或(ii)通过buchwald偶联(参见例如wo2009/017838)被置换为式vii的胺以得到所需的化合物(当fg为nh2时)或xiii(当fg是硝基或nh–pg2时)。当在xiii中fg为硝基时，nh2基团可通过还原反应而显露，通常使用合适的催化剂例如披钯碳或使用溶解金属条件例如用在冰乙酸中的铁，通过氢化进行。或者，当fg是保护基时，nh2基团可通过脱保护反应显露。尽管仅描述为在所述顺序的最后步骤中发生，但应注意，由fg表示的潜在nh2基团的暴露可在流程1所示的合成路线的任何阶段中发生。
流程1
以类似的方式，其中z1表示式iv的结构片段的式ix的胺可通过将在式xiiia的化合物中潜在的nh2基团转化成真实的nh2基团来合成，
其中fg’如上文对fg所定义，不同之处在于其不表示nh2。
式vi的化合物可类似于式i的化合物合成(见例如，上文备选的过程(a)-(c))。例如，式vi的化合物可通过将式iix的化合物与式iiix的化合物反应制备，其中式iix和iiix的化合物采用与式ii和iii的化合物相同的定义，不同之处在于z1和z2之一表示前文定义的式iv的结构片段，和z1和z2的另一个表示式va的结构片段，
式viia的化合物可通过类似于本文所述的用于制备式i的化合物的程序制备(参见例如上文过程(a)-(d)和流程1)。
例如，在以下中-co2h基团可被替换为qx：
-式v的结构片段(得到式vp的结构片段，和相应的式iip、iiap、iibp和iiip的化合物，其中z1和z2分别被替换为z1p和z2p，其中z1p和z2p之一是上文定义的式iv的结构片段，和z1p和z2p的另一个是式vp的结构片段)；或
-式vii的化合物(得到式viip的化合物)。
或者，式viia的化合物可通过将式xiiib的化合物中的基团fg转换为nh2来制备
其中fg和qx如前文所定义(例如，关于流程1按上文所述，通过转换fg为nh2)，接着与例如式iib的化合物反应，其中z1表示式iv的结构片段。
本领域技术人员将理解，式ii、iix和iib表示的化合物通常为反应中间体。这些中间体可原位形成并且无需分离与式iii的化合物直接反应，以提供式i的化合物。此外，本领域技术人员将理解，对于具有化学敏感性官能团例如羟基或氨基官能团的任何基团z1和z2，在上文描述的过程期间使用合适的保护基团可能是需要的。
流程中说明的许多化合物是市售可得的，或可使用引用的程序获得，或可由本领域技术人员通过常规方法容易制备。参见例如regan,j.等;j.med.chem.2003,46,4676–4686、wo2000/043384、wo2007/053346、wo2007/087448、wo2007/089512、wo2009/117080和wo2014/027209。
本文所述的新中间体构成本发明的一个方面。在该方面，本发明的其它方面涉及：
(i)前文所定义的式ii、iia或iib的化合物，其中z1表示式v的结构片段，或其盐或受保护衍生物；
(ii)前文所定义的式iii的化合物，其中z2表示式v的结构片段，或其盐或受保护衍生物；
(iii)前文所定义的式viia的化合物，或其盐或受保护衍生物；和
(v)前文所定义的式xiii或xiiib的化合物，或其盐或受保护衍生物。
式iii、vii、xiii和xiiib的化合物的受保护衍生物包括其中必要的nh2基团(或由fg表示的nh2基团)受保护的那些。在该方面，所述受保护衍生物包括这些化合物的酰胺，或特别是氨基甲酸酯。例如，这些受保护衍生物包括其中nh2基团的h原子被替换为以下基团的化合物：
r’-c(o)-，其中r’是h、c1-8烷基、苯基或苄基，后两个基团任选地被选自卤素、羟基、甲基和甲氧基的一个或多个基团取代；或
r’’-o-c(o)-，其中r’’是叔丁基、苯基、苄基或芴基，后三个基团任选地被选自卤素、羟基、甲基和甲氧基的一个或多个基团取代。
其中r4表示-co2h的式ii、iia、iib、iii、vii和xiii的化合物的受保护衍生物另外地(或备选地)包括其中羧基部分受保护的那些。在这方面，所述受保护的衍生物还包括所述化合物的酯(例如，c1-8烷基酯，例如乙基酯或特别是甲基酯)。
本领域技术人员将理解，其中z2表示式v的结构片段的式iii的化合物可在必要的nh2基团上受保护，和/或当r4表示-co2h时，在羧基部分上受保护。在该方面，例如，可提及的其中z2表示式v的结构片段的式iii的化合物的具体受保护衍生物包括：
4-((4-((4-氨基萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯；和
4-((4-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯。
4-((4-((4-氨基萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯和4-((4-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯两者也是式xiiib的化合物(其中qx表示-co2ch3，和分别地，fg表示nh2或nh-pg2，其中pg2表示叔丁氧基羰基)。
本发明的备选实施方案涉及化合物，其是：
(i)式iii的化合物的受保护衍生物，其中z2表示式v的结构片段；或
(ii)式xiiib的化合物，或其受保护衍生物，
条件是所述化合物不是：
4-((4-((4-氨基萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯；或
4-((4-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯。
本发明的另外的实施方案涉及前文所定义的式viia的化合物，条件是所述化合物
(a)是，或
(b)不是
4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯。
本文描述的本发明的各方面(例如上述化合物、组合、方法和用途)可在治疗本文所述病况中具有优势，与现有技术中已知用于治疗这些病况的类似的化合物、组合、方法(治疗)或用途或其它方面相比，它们可更适合于医师和/或患者，更有效，具有较少毒性，具有更好的选择性，具有更广范围的活性，更有效力，产生较少的副作用，具有更好的药代动力学和/或药效学特征，具有更合适的固态形态学，具有更好的长期稳定性或可具有其它有用的药理学性质。
另外地(或备选地)，本发明的化合物可：
-显示长的作用持续时间和/或作用持久性(例如，与其它之前公开的p38map激酶抑制剂例如birb796相比)；
-显示syk的有效抑制(例如，它们针对syk的ic50可为500nm或更低，例如350nm或更低)；
-不强烈抑制gsk3α(例如，它们针对gsk3α的ic50可为1,000nm或更高；例如1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000nm或更高)；
-靶向激酶(kinome)的较小部分，即具有改进的选择性，如通过降低的kinomescan选择性评分所示；
-在给药之间保持相对高的局部药物浓度(例如，相对于其它之前公开的p38map激酶抑制剂例如birb796，高的局部浓度)；
-显示特别适合于局部给药的性质(例如在局部给药后，产生高的靶组织浓度但低的血浆浓度的式(i)的化合物，和/或从血浆快速清除式(i)的化合物，例如因为高的肾或肝提取)；
-细胞显示很少或没有β-联蛋白诱导和/或有丝分裂抑制；
-在人淋巴细胞体外微核试验中不产生含有微核的双核细胞的增加；
-对细胞色素p450超家族的成员显示很少或没有时间依赖性抑制；
-与之前公开的p38map激酶抑制剂例如birb796相比，在水的存在下显示改进的化学稳定性(例如，在含水混合物中在升高的温度下对水解的稳定性)；
-在给予患者后，产生伴随很少或没有安全性(例如毒性)顾虑的代谢产物；
-在局部给予后在临床前物种和人两者中显示降低的眼睛刺激或毒性；
-显示良好的水溶性和/或细胞渗透性；
-在ph范围7–8的水溶液中用较低量的增溶赋形剂较容易地配制；
-具有高度的结晶性；和/或
-在固态时显示很少或没有吸湿性。
实验方法
通用程序
所有原料和溶剂自市售来源获得，或根据引用的文献制备。除非另外说明，否则所有反应经搅拌。有机溶液经无水硫酸镁常规干燥。氢化在thalesh-cube流动反应器上在所述条件下或在氢气球下进行。微波反应在cemdiscover和smithcreator微波反应器中进行，使用可变功率微波辐射加热至恒定温度。
正相柱色谱在自动化快速色谱系统例如combiflashcompanion或combiflashrf系统上使用预填装的二氧化硅(230-400目，40-63µm)柱常规进行。scx购自supelco，在使用前用1m盐酸处理。除非另外说明，否则待纯化的反应混合物首先用meoh稀释，和用几滴acoh调成酸性。将该溶液直接负载到scx上，用meoh洗涤。然后通过用含1%nh3的meoh洗涤，洗脱所需材料。
分析方法
分析型hplc使用watersxselectcshc18,2.5µm,4.6x30mm柱进行，用含mecn的0.1%甲酸(0.1%甲酸水溶液)的梯度洗脱，或使用watersxbridgebehc18,2.5µm,4.6x30mm柱进行，用含mecn的10mm碳酸氢铵水溶液的梯度洗脱。使用二极管阵列或agilent1100系统上的可变波长检测器测量洗脱峰的uv谱。
分析型lcms使用watersxselectcshc18,2.5µm,4.6x30mm柱进行，用含mecn的0.1%甲酸(0.1%甲酸水溶液)的梯度洗脱，或使用watersxbridgebehc18,2.5µm,4.6x30mm柱进行，用含mecn的10mm碳酸氢铵水溶液的梯度洗脱。洗脱峰的uv和质谱使用agilent1200或agilentinfinity1260lcms上的可变波长检测器与具有正离子和负离子电喷射的6120单个四极质谱仪测量。
制备型hplc使用watersxselectcshc18,5µm,19x50mm柱使用含mecn的0.1%甲酸(0.1%甲酸水溶液)的梯度或含mecn的10mm碳酸氢铵水溶液的梯度进行，或使用watersxbridgebehc18,5µm,19x50mm柱使用含mecn的10mm碳酸氢铵水溶液的梯度进行。在gilson215制备型hplc或varianprepstar制备型hplc上通过可变波长检测器测量的单波长uv而检测后，或通过具有正离子和负离子电喷射的zq单个四极质谱仪和在watersfractionlynxlcms上的双波长检测器测量的质量和单波长uv而检测后，收集流分。
1hnmr波谱：1hnmr波谱在brukeravanceiii波谱仪上以400mhz获得。氯仿-d、二甲基亚砜-d6或四甲基甲硅烷的内部标准的中央峰用作参考。
本发明的化合物的制备
实施例1
4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸
(i)(4-((2-氯吡啶-4-基)氧基)萘-1-基)氨基甲酸叔丁酯
方法1
将4-((2-氯吡啶-4-基)氧基)萘-1-胺(见例如ito,k.等,wo2010/112936,07oct2010;1000mg,3.69mmol)和二碳酸二叔丁酯(750mg,3.44mmol)在t-buoh(10ml)中的混合物在回流下搅拌18h。混合物用水(15ml)稀释，和通过过滤收集固体。固体在乙醚中研磨，得到子标题化合物(1002mg)，为浅灰色固体。
1hnmr(dmso-d6)400mhz,δ:9.37(s,1h),8.28(d,1h),8.16(d,1h),8.82(dd,1h),7.66(d,1h),7.66-7.54(m,2h),7.40(d,1h),7.03(d,1h),6.91(dd,1h),1.52(s,9h).
lcmsm/z371(m+h)+(es+);369(m-h)-(es-)
方法2
将2-氯-4-氟吡啶(33ml,365mmol)加入(4-羟基萘-1-基)氨基甲酸叔丁酯(85g,328mmol)和cs2co3(139g,426mmol)在dmso(600ml)中的混合物，并室温下搅拌24h。加入水(1l)，将混合物搅拌1h，然后滤出沉淀。以另外的85g规模的萘酚重复反应。合并的沉淀用水(2l)、乙醚(4x400ml)洗涤，和在70℃在真空下干燥72h，得到子标题化合物(201.6g)，为浅灰色固体。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.38(s,1h),8.28(d,1h),8.16(d,1h),7.82(d,1h),7.67-7.56(m,3h),7.40(d,1h),7.03(d,1h),6.92(dd,1h),1.52(s,9h).
lcmsm/z371(m+h)+(es+);369(m-h)-(es-)
(ii)4-((4-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯
方法1
来自上文步骤(i)的产物(2.0g,5.39mmol)、4-氨基-2-甲氧基苯甲酸甲酯(1.0g,5.52mmol)、binap(300mg,0.482mmol)和碳酸铯(3.5g,10.74mmol)在1,4-二噁烷(30ml)中的悬浮液用氮气脱气10min。加入pd2dba3(200mg,0.218mmol)，和将混合物加热至90℃过夜。混合物用乙醚(60ml)稀释并过滤。然后滤液用水(2x100ml)和饱和盐水(50ml)洗涤。有机相经干燥(mgso4)、过滤和减压下浓缩，得到粗产物，为红色泡沫。粗产物通过色谱在companion(80g柱,20-50%etoac/己烷)上纯化，得到子标题化合物(2.34g)，为黄色泡沫。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.38(s,1h),9.36(s,1h),8.18(d,1h),8.14(d,1h),7.83(d,1h),7.54-7.66(m,5h),7.37(d,1h),7.22(dd,1h),6.69(dd,1h),6.15(d,1h),3.74(s,3h),3.71(s,3h),1.53(s,9h).
lcmsm/z516(m+h)+(es+)
方法2
4-氨基-2-甲氧基苯甲酸甲酯(10.8g,59.6mmol)、来自上文步骤(i)的产物(20.09g,54.2mmol)和碳酸钾(15g,109mmol)在dmf(300ml)中的混合物用n2脱气10min。加入brettphosg3预催化剂(1g,1.103mmol)，将混合物在85℃加热3h。将混合物冷却，然后在dcm(500ml)和水(800ml)之间分配。有机层用水(500ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤和在减压下蒸发。残余物用乙醚研磨，过滤和干燥，得到子标题化合物(21.7g)，为灰色固体。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.38(s,1h),9.36(s,1h),8.18(d,1h),8.14(d,1h),7.83(d,1h),7.54-7.66(m,5h),7.38(d,1h),7.22(dd,1h),6.69(dd,1h),6.14(d,1h),3.74(s,3h),3.71(s,3h),1.53(s,9h).
lcmsm/z516(m+h)+(es+)
(iii)4-((4-((4-氨基萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯
将tfa(7ml,91mmol)加入来自上文步骤(ii)的产物(2.34g,4.08mmol)在dcm(50ml)中的溶液，并将反应物搅拌2h。蒸发溶剂，将残余物在饱和nahco3溶液(100ml)和dcm(60ml)之间分配。分离有机物，干燥(mgso4)，过滤和蒸发溶剂，得到子标题化合物(1.5g)，为浅棕色泡沫。
lcmsm/z416(m+h)+(es+)
(iv)(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)氨基甲酸苯酯
将氯甲酸苯酯(0.750ml,5.98mmol)加入n-(3-氨基-5-(叔丁基)-2-甲氧基苯基)甲磺酰胺(见例如cirillo,p.f.等wo2002/083628,2002年10月24日;1.5g,5.51mmol)和nahco3(1.0g,11.90mmol)在thf(15ml)和dcm(15ml)中的搅拌溶液，并将混合物搅拌2h。混合物用水(20ml)洗涤，分离有机层，干燥(mgso4)，过滤和蒸发至棕色泡沫，其在环己烷(20ml)中搅拌，得到子标题化合物(2.05g)，为无色固体。
lcmsm/z393(m+h)+(es+);391(m-h)-(es-)
(v)4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)-萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯
方法1
在65℃(加热块温度)下将三乙胺(20µl,0.143mmol)加入来自上文步骤(iv)的产物(300mg,0.764mmol)和来自上文步骤(ii)的产物(300mg,0.722mmol)在iproac(15ml)中的溶液，将混合物搅拌过夜。将反应物冷却至室温，在真空下浓缩，得到浅棕色泡沫。将泡沫在et2o(10ml)中浆化2h，得到的固体通过过滤收集，用另一份et2o洗涤，得到子标题化合物(433mg)，为浅粉色固体。
lcmsm/z358(m+2h)2+(es+)
方法2
在65℃(加热块温度)下将三乙胺(600µl,4.30mmol)加入来自上文步骤(iv)的产物(9.0g,22.93mmol)和来自上文步骤(iii)的产物(9.0g,21.66mmol)在iproac(300ml)中的溶液，并将混合物搅拌24h。将反应物冷却至室温，在真空下浓缩，得到棕色泡沫。粗产物通过色谱在companion(330g柱,1-5%meoh/dcm)上纯化，得到子标题化合物(13.2g)，为浅粉色固体。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.40(s,1h),9.35(s,1h),916(s,1h),8.93(s,1h),8.31(d,1h),8.17-8.20(m,2h),8.13(d,1h),7.87(d,1h),7.69-7.73(m,1h),7.60-7.63(m,2h),7.53(d,1h),7.41(d,1h),7.24(dd,1h),7.03(d,1h),6.69(dd,1h),6.17(d,1h),3.81(s,3h),3.74(s,3h),3.71(s,3h),3.10(s,3h),1.27(s,9h).
lcmsm/z714(m+h)+(es+)
(vi)4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸
方法1
将氢氧化锂一水合物(25mg,0.596mmol)在水(3ml)中的水溶液加入来自上文步骤(v)的产物(433mg,0.540mmol)在thf(2ml)和甲醇(1ml)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌过夜。加入氢氧化锂一水合物(25mg,0.596mmol)，继续搅拌另外3天。将混合物在减压下浓缩，以除去thf和甲醇，然后用水(25ml)稀释。加入柠檬酸一水合物(250mg,1.190mmol)的水溶液(5ml)，和得到的沉淀通过过滤收集，得到标题化合物(360mg)，为浅粉色固体。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.96(brs,1h),9.39(s,1h),9.31(s,1h),9.14(s,1h),8.91(s,1h),8.30(d,1h),8.19(d,1h),8.18(d,1h),8.12(d,1h),7.87(d,1h),7.71(ddd,1h),7.63(d,1h),7.61(ddd,1h),7.51(d,1h),7.40(d,1h),7.22(dd,1h),7.02(d,1h),6.68(dd,1h),6.16(d,1h),3.81(s,3h),3.75(s,3h),3.10(s,3h),1.27(s,9h).90%纯度
lcmsm/z700(m+h)+(es+)
方法2
向来自上文步骤(v)的产物(33.4g,45.9mmol)在thf(300ml)中的搅拌溶液中加入naoh(6maq.)(85.0ml,510mmol)。加入meoh(60ml)并继续搅拌28h。将反应物在真空下浓缩，得到黄色固体。将该物质悬浮在水(200ml)中，和用6mhcl(100ml)酸化，引起白色固体沉淀。通过过滤收集固体，用水洗涤。将得到的固体在玻璃料上干燥1h，然后在40℃在真空下进一步干燥，得到作为盐酸盐的标题化合物，为白色固体。
1hnmr(盐酸盐；400mhz,dmso-d6)δ:9.80(s,1h),9.59(s,1h),9.15(s,1h),9.02(s,1h),8.37(d,1h),8.13-8.18(m,3h),7.86(d,1h),7.70-7.74(m,1h),7.62-7.66(m,2h),7.44(d,1h),7.35(s,1h),7.10(d,1h),7.03(d,1h),6.78(d,1h),6.26(d,1h),3.81(s,3h),3.75(s,3h),3.10(s,3h),1.27(s,9h).
lcmsm/z700(m+h)+(es+)
将盐酸盐以溶于thf的2.0g批次负载至预调制的scx树脂柱上(20g树脂，在mecn中调制)。树脂用mecn洗涤，然后产物释放在1%nh3/meoh中。将nh3流分合并，在真空下浓缩，得到作为游离酸的标题化合物(30g)，为浅粉色固体。
1hnmr(游离酸;400mhz,dmso-d6)δ:9.56(s,1h),9.28(s,1h),9.00(s,1h),8.34(d,1h),8.16-8.17(m,2h),8.11(d,1h),7.86(d,1h),7.69-7.71(m,1h),7.57-7.63(m,2h),7.48(d,1h),7.40(d,1h),7.21(dd,1h),7.03(d,1h),6.66(dd,1h),6.16(d,1h),3.81(s,3h),3.73(s,3h),3.09(s,3h),1.27(s,9h).
lcmsm/z700(m+h)+(es+)
将游离酸(1.0g,1.386mmol)悬浮于naoh(0.057g,1.414mmol)的水溶液(25ml)中。加入meoh(5ml)，将混合物搅拌直至达到均相。得到的溶液用meoh(20ml)稀释和真空浓缩，得到浅灰色固体。将该物质悬浮于mecn(5ml)，向其中加入水(0.5ml)，将悬浮液搅拌过周末。将悬浮液过滤，得到的固体用mecn(2x3ml)洗涤，和在50℃在真空下干燥，得到作为钠盐的标题化合物(940mg)，为白色固体。
1hnmr(钠盐；400mhz,dmso-d6)δ:9.68(s,1h),9.07(s,1h),9.02(s,1h),8.35(d,1h),8.08-8.13(m,2h),8.02(d,1h),7.85(d,1h),7.64-7.68(m,1h),7.57-7.61(m,1h),7.37-7.43(m,2h),7.30(s,1h),7.11(dd,1h),7.03(d,1h),6.61(dd,1h),6.12(d,1h),3.80(s,3h),3.65(s,3h),2.96(s,3h),1.25(s,9h).
lcmsm/z700(m+h)+(es+)
生物试验：实验方法
酶结合测定法(kinomescan)
本文公开的化合物的激酶结合活性可使用专有的测定法测定，其测量与固定化配体的活性位点定向的竞争结合(fabian,m.a.等,naturebiotechnol.,2005,23:329-336)。这些测定法可通过discoverx(以前的ambit;sandiego,ca)进行。通过与试验化合物孵育产生的抑制百分比可相对于非-抑制对照计算。
酶抑制测定法
本文公开的化合物的酶抑制活性通过fret使用用供体和受体荧光团(z-lyte,invitrogenltd.,paisley,uk)标记的合成肽测定。
p38mapkα酶抑制
以下两个测定法变型可用于测定p38mapkα抑制。
方法1
试验化合物针对p38mapkα同种型(mapk14:invitrogen)的抑制活性通过测定下游分子mapkap-k2的活化/磷酸化水平间接评价。将p38mapkα蛋白(80ng/ml,2.5µl)与试验化合物(2.5µl，4µg/ml、0.4µg/ml、0.04µg/ml或0.004µg/ml)在室温下混合2小时。然后加入p38α无活性靶mapkap-k2(invitrogen,600ng/ml)和fret肽(8μm;mapkap-k2的磷酸化靶)的混合溶液(2.5µl)，然后激酶反应通过加入atp(40μm,2.5µl)而开始。将混合物在室温下孵育1小时。加入显色剂(蛋白酶,5µl)后1小时，在荧光微板阅读器(varioskan®flash,thermofisherscientific)上检测。
方法2
该方法按照与上文方法1相同的步骤，但使用更高浓度的p38mapkα蛋白(2.5µl200ng/ml蛋白代替2.5µl80ng/ml蛋白)，与试验化合物(以1µg/ml、0.1µg/ml、0.01µg/ml或0.001µg/ml试验)混合。
p38mapkγ酶抑制
本发明的化合物对p38mapkγ(mapk12:invitrogen)的抑制活性以与上文描述的类似方式评价。将酶(800ng/ml,2.5µl)与试验化合物(2.5µl4µg/ml、0.4µg/ml、0.04µg/ml,或0.004µg/ml)在室温下孵育2小时。然后加入fret肽(8μm,2.5µl)和合适的atp溶液(2.5μl,400μm)至酶/化合物混合物，将全部孵育1小时。加入显色剂(蛋白酶,5µl)后1小时，在荧光微板阅读器(varioskan®flash,thermoscientific)上检测。
c-src和syk酶抑制
本发明的化合物对c-src和syk酶(invitrogen)的抑制活性以与上文描述的类似方式评价。将相关的酶(分别为3000ng/ml或2000ng/ml，2.5µl)与试验化合物(1µg/ml、0.1µg/ml、0.01µg/ml或0.001µg/ml，各自2.5µl)在室温下孵育2小时。然后加入fret肽(8μm,2.5µl)和合适的atp溶液(2.5μl,800μm对于c-src，和60μmatp对于syk)至酶/化合物混合物，将混合物孵育1小时。加入显色剂(蛋白酶,5µl)后1小时，在荧光微板阅读器(varioskan®flash,thermofisherscientific)上检测。
gsk3α酶抑制
以下两个测定法变型可用于测定gsk3α抑制。
方法1
本发明的化合物对gsk3α酶同种型(invitrogen)的抑制活性通过测定靶肽的活化/磷酸化水平来评价。将gsk3-α蛋白(500ng/ml,2.5µl)与试验化合物(2.5µl4µg/ml、0.4µg/ml、0.04µg/ml或0.004µg/ml)在室温下混合2小时。然后加入fret肽(8μm,2.5µl)(其为gsk3α的磷酸化靶)和atp(40μm,2.5µl)至酶/化合物混合物，将得到的混合物孵育1小时。加入显色剂(蛋白酶,5µl)后1小时，在荧光微板阅读器(varioskan®flash,thermofisherscientific)中检测。
在所有情况下，位点特异性蛋白酶仅切割非磷酸化肽和消除fret信号。各反应的磷酸化水平使用香豆素发射(供体)与荧光素发射(受体)的比率来计算，其中高比率表示高磷酸化而低比率表示低磷酸化水平。各反应的抑制百分比相对于非抑制对照计算，然后自浓度反应曲线计算50%抑制浓度(ic50值)。
方法2
该方法按照与上文方法1相同的步骤，但使用试验化合物(105分钟代替2小时)与gsk3-α蛋白的更短的混合时间。此外，使用的试验化合物的浓度为10µg/ml、1µg/ml、0.1µg/ml或0.01µg/ml。
细胞测定法
本发明的化合物使用以下测定法的一个或多个进行研究。
(a)jurkat细胞的p38mapkα和lck的抑制
将jurkatt细胞在饥饿培养基(rpmi1640+5%fbs)中培养24h，然后进行实验。收获细胞，以10x106个细胞/ml再悬浮于饥饿培养基，然后以1x106个细胞/孔置于圆底96孔板。刺激前2h，加入连续稀释的试验化合物(1%最终dmso浓度)。与化合物预孵育后，细胞用h2o2(0.05%最终)刺激5分钟。通过在2000rpm离心(3分钟，4℃)终止反应，然后除去上清液，添加100µl的冷却的固定/透化溶液(bdfix/permkit#554714)。将板在4℃孵育20分钟，然后离心和用提供的1x洗涤培养基(bdfix/permkit#554714)洗涤。细胞针对cellsignallingtechnology(9211s)提供的磷酸-p38α(t180/182)或r&d(mab7500)提供的磷酸-lck(y394)染色。将抗体在洗涤培养基中稀释至5µg/ml(r&d)或以1:200(cellsignallingtechnology)稀释，然后在4℃在暗处孵育1h。用冰冷的洗涤缓冲液3次重复洗涤后，以1:1000的稀释度加入第二抗体(抗-兔-fitc#f1362或抗-小鼠-fitc#f2883，两者都来自sigma)和在4℃在暗处孵育1h。然后将细胞在冷的洗涤缓冲液中洗涤3次，接着最后在冷的pbs中洗涤，重悬于150µl冷的pbs。通过流式细胞术使用bdaccuric6分析细胞。
(aa)在d-u937细胞中lps-诱导的tnfα/il-8释放
u937细胞(人单核细胞细胞系)通过与卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(pma;100ng/ml)孵育48-72小时而分化成巨噬细胞型细胞。将细胞与终浓度的试验化合物预孵育2小时，然后用0.1μg/ml的lps(来自大肠杆菌:0111:b4,sigma)刺激4小时。收集上清液用于通过夹心elisa(duo-set,r&dsystems)测定tnfα和il-8浓度。tnfα产生的抑制计算为在各浓度的试验化合物下通过10μg/ml的birb796实现的抑制与溶媒对照相比的百分比。相对50%有效浓度(rec50)从得到的浓度反应曲线测定。il-8产生的抑制在各浓度的试验化合物下通过与溶媒对照比较而计算。50%抑制浓度(ic50)自得到的浓度反应曲线测定。
(b)在pbmc细胞中lps-诱导的tnfα/il-8释放
使用密度梯度(lymphoprep,axis-shieldhealthcare)从全血分离来自健康受试者的外周血单核细胞(pbmc)。将pbmc接种在96孔板中和用所需浓度的化合物处理2小时，然后在正常组织培养条件(37℃，5%co2)下加入1ng/mllps(大肠杆菌0111:b4，来自sigmaaldrich)达24小时。收获上清液用于通过夹心elisa(duo-set,r&dsystems)测定il-8和tnfα浓度，在荧光微板阅读器(varioskan®flash,thermofisherscientific)上读数。在50%抑制il-8和tnfα产生时的浓度(ic50)从剂量反应曲线计算。
(c)在cd3/cd28刺激的pbmc细胞中il-2和ifnγ释放
来自健康受试者的pbmc自全血使用密度梯度(lymphoprep,axis-shieldhealthcare)分离。将细胞加入用cd3/cd28单克隆抗体的混合物(分别为0.3µg/mlebioscience和3µg/mlbdpharmingen)预包被的96孔板。然后将所需浓度的化合物加入各孔和在正常组织培养条件下将板放置3天。收获上清液，通过夹心elisa(duo-set,r&dsystem)测定il-2和ifnγ释放。ic50从剂量反应曲线测定。
(d)在ht29细胞中il-1β-诱导的il-8释放
将ht29细胞(人结肠腺癌细胞系)放置在96孔板中(24小时)和用所需浓度的化合物预处理2小时，然后加入5ng/ml的il-1β(abcam)达24小时。收获上清液用于通过夹心elisa(duo-set,r&dsystem)定量il-8。ic50从剂量反应曲线测定。
(e)在原代巨噬细胞中lps-诱导的il-8和tnfα释放
来自健康受试者的pbmc从全血使用密度梯度(lymphoprep,axis-shieldhealthcare)分离。将细胞孵育2小时，通过洗涤除去非粘附的细胞。为将细胞分化成巨噬细胞，将它们与5ng/ml的gm-csf(peprotech)一起在正常组织培养条件下孵育7天。然后将所需浓度的化合物加入细胞进行2小时预处理，然后用10ng/mllps刺激24小时。收获上清液，il-8和tnfα释放通过夹心elisa(duo-set,r&dsystem)测定。ic50从剂量反应曲线测定。
(f)在beas2b细胞中多聚i:c-诱导的icam-1表达
多聚i:c作为简单的rna病毒模拟物用于这些研究。将多聚i:c-oligofectamine混合物(1μg/ml多聚i:c,±2%oligofectamine,25μl;分别为invivogenltd.,sandiego,ca和invitrogen,carlsbad,ca)转染至beas2b细胞(人支气管上皮细胞,atcc)。细胞用终浓度的试验化合物预孵育2小时，在细胞表面上的icam1表达水平通过基于细胞的elisa测定。在多聚i:c转染后18小时的时间点，细胞用含4%甲醛的pbs固定，然后内源过氧化物酶通过加入含0.1%叠氮化钠和1%过氧化氢的洗涤缓冲液(100μl,含0.05%tween的pbs:pbs-tween)淬灭。细胞用洗涤缓冲液(3x200μl)洗涤，在用含5%牛奶的pbs-tween(100μl)封闭各孔1小时后，将细胞与含抗-人icam-1抗体(50μl;cellsignallingtechnology,danvers,ma)的1%bsapbs在4℃孵育过夜。
细胞用pbs-tween(3x200μl)洗涤并与第二抗体(100μl;hrp-缀合的抗-兔igg,dakoltd.,glostrup,denmark)一起孵育。然后将细胞与底物(50μl)一起孵育2-20分钟，接着加入终止溶液(50μl,1nh2so4)。使用分光光度计，通过读出相对于655nm的参比波长的450nm的吸光度，检测icam-1信号。然后细胞用pbs-tween(3x200μl)洗涤，在结晶紫染色(50μl含2%的pbs溶液)和通过含1%sds的蒸馏水溶液(100μl)洗脱后，通过读出595nm的吸光度检测各孔中的总细胞数。测量的od450-655读数通过除以各孔中od595读数而针对细胞数校正。在各浓度的试验化合物下通过与溶媒对照比较，计算icam-1表达的抑制。根据得到的浓度反应曲线，测定50%抑制浓度(ic50)。
(g)细胞有丝分裂测定法
来自健康受试者的外周血单核细胞(pbmc)使用密度梯度(histopaque®-1077,sigma-aldrich,poole,uk)从全血(quintiles,london,uk)分离。pbmc(3百万个细胞/样品)随后用2%pha(植物血细胞凝集素,sigma-aldrich,poole,uk)处理48小时，接着暴露于各种浓度的试验化合物20小时。收集前2小时，pbmc用秋水仙胺(0.1µg/ml;invitrogen,paisley,uk)处理以使细胞停止在分裂中期。为观察有丝分裂的细胞，pbmc通过加入intraprep(50µl;beckmancoulter,france)透化和固定，和用抗-磷酸-组蛋白3(0.26ng/l;#9701;cellsignalling,danvers,ma)和碘化丙啶(1mg/ml;sigma-aldrich,poole,uk)染色，如前所述(muehlbauerp.a.和schulerm.j.,mutationresearch,2003,537:117-130)。使用attune流式细胞仪(invitrogen,paisley,uk)，门控淋巴细胞，观察荧光。对各处理，相对于溶媒(0.5%dmso)处理，计算有丝分裂的抑制百分比。
(h)鼻病毒-诱导的il-8释放和icam-1表达
人鼻病毒rv16自美国典型培养物保藏中心(manassas,va)获得。通过用hrv感染hela细胞直到80%的细胞发生细胞病变，产生病毒贮液。
beas2b细胞用hrv以5的moi感染并在33℃孵育2小时，同时轻轻摇动以促进吸收。然后细胞用pbs洗涤，加入新鲜的培养基和细胞孵育另外72小时。收集上清液用于使用duosetelisa显色试剂盒(r&dsystems,minneapolis,mn)测定il-8浓度。
表达icam-1的细胞表面的水平通过基于细胞的elisa测定。在感染后72小时，细胞用含4%甲醛的pbs固定。在通过加入0.1%叠氮化钠和1%过氧化氢淬灭内源过氧化物酶后，各孔用洗涤缓冲液(含0.05%tween的pbs:pbs-tween)洗涤。在用含5%牛奶的pbs-tween封闭孔1小时后，细胞与含抗-人icam-1抗体的5%bsapbs-tween(1:500)孵育过夜。各孔用pbs-tween洗涤，并与第二抗体(hrp-缀合的抗-兔igg,dakoltd.)一起孵育。通过加入底物和使用分光光度计在450nm与参比波长655nm读出，检测icam-1信号。然后各孔用pbs-tween洗涤，在结晶紫染色和用1%sds溶液洗脱后通过读出595nm的吸光度，检测各孔中的总细胞数。测量的od450-655读数通过除以各孔中的od595读数对细胞数进行校正。hrv感染前2小时以及感染后2小时(此时将未感染的hrv洗出)加入化合物。
(i)mrc5细胞中hrv16诱导的细胞病变作用(cpe)的评估
mrc5细胞用hrv16以1的moi在含5%fcs和1.5mmmgcl2的dmem中感染，接着在33℃孵育1小时以促进吸附。吸出上清液，然后加入新鲜的培养基，接着孵育4天。合适时，细胞与化合物或dmso一起预孵育2小时，在洗出病毒后再次加入化合物和dmso。
在室温下，吸出上清液和与亚甲基蓝溶液(100μl,2%甲醛、10%甲醇和0.175%亚甲基蓝)一起孵育2小时。洗涤后，向各孔加入含1%sds的蒸馏水(100μl)，和将板轻轻摇动1-2小时，然后读出660nm的吸光度。计算各孔的抑制百分比。ic50值从通过连续稀释试验化合物产生的浓度反应曲线计算。
(j)原代支气管上皮细胞中的体外rsv病毒负载
生长在96孔板中的正常人支气管上皮细胞(nhbec)用rsva2(毒株a2,hpa,salisbury,uk)以0.001的moi在含15mm氯化镁的lhc8培养基:rpmi-1640(50:50)中感染，和在37℃孵育1小时用于吸附。细胞用pbs(3x200μl)洗涤，然后加入新鲜的培养基(200μl)和继续孵育4天。合适时，细胞与化合物或dmso一起预孵育2小时，然后在病毒洗出后再次加入。
细胞用含4%甲醛的pbs溶液(50μl)一起孵育20分钟，用wb(3x200μl)(洗涤缓冲液，含0.5%bsa和0.05%tween-20的pbs)洗涤，和与封闭溶液(含5%炼乳的pbs)一起孵育1小时。然后细胞用wb(3x200μl)洗涤和在室温下用含抗-rsv(2f7)f-融合蛋白抗体(40μl;小鼠单克隆,lot798760,cat.no.ab43812,abcam)的5%bsa/pbs-tween孵育1小时。洗涤后，细胞与含hrp-缀合的第二抗体溶液(50μl)的5%bsa/pbs-tween(lot00053170,cat.no.p0447,dako)一起孵育，然后加入tmb底物(50μl;底物试剂包,lot269472,cat.no.dy999,r&dsystems,inc.)。该反应通过加入2nh2so4(50µl)终止，将得到的信号在微板阅读器(varioskan®flash,thermofisherscientific)中比色测量(od:450nm与参比波长655nm)。
然后洗涤细胞，加入2.5%结晶紫溶液(50μl;lot8656,cat.no.pl7000,pro-labdiagnostics)达30分钟。用wb洗涤后，向各孔中加入含1%sds的蒸馏水(100μl)，在振荡器上将板轻轻摇动1小时，然后读出595nm的吸光度。测量的od450-655读数通过将od450-655除以od595读数对细胞数进行校正。计算各孔的抑制百分比，ic50值根据自连续稀释的化合物产生的浓度反应曲线计算。
(k)细胞成活力测定法：mtt测定
将分化的u937细胞与各试验化合物(终浓度为1μg/ml或10μg/ml，在200μl下文显示的培养基中)一起以两个方案预孵育：第一个方案为在5%fcsrpmi1640培养基中4小时，第二个方案为在10%fcsrpmi1640培养基中24小时。上清液置换为新鲜的培养基(200μl)，向各孔加入mtt贮液(10μl,5mg/ml)。孵育1小时后，除去培养基，向各孔加入dmso(200μl)，将板轻轻摇动1小时，然后读出550nm的吸光度。相对于溶媒(0.5%dmso)处理，计算各孔的细胞成活力的损失百分比。因此，药物处理相对于溶媒的细胞成活力的明显增加作为负百分比显示。
(l)人活检测定法
肠粘膜活检自ibd患者的结肠的发炎区域获得。将活检材料切成小块(2–3mm)，在器官培养室中在37℃在5%co2/95%o2气氛中在无血清培养基中置于钢网上。向组织加入dmso对照或所需浓度的试验化合物，在器官培养室中孵育24小时。收获上清液用于通过r&delisa测定il-6、il-8、il-1β和tnfα水平。相对于对于dmso对照(100%)测定的细胞因子释放，计算通过试验化合物的细胞因子释放的抑制百分比。
(m)β联蛋白在d-u937细胞中的累积
u937细胞(一种人单核细胞细胞系)通过与pma(100ng/ml)一起孵育48-72小时分化成巨噬细胞型细胞。然后将细胞与终浓度的试验化合物或溶媒一起孵育18小时。通过试验化合物诱导β-联蛋白通过置换培养基为4%甲醛溶液来终止。内源过氧化物活性通过与淬灭缓冲液(100μl,含0.1%叠氮化钠、1%h2o2的pbs，含0.05%tween-20)一起孵育20分钟中和。细胞用洗涤缓冲液(200µl;含0.05%tween-20的pbs)洗涤，与封闭溶液(200µl;含5%牛奶的pbs)一起孵育1小时，用洗涤缓冲液(200µl)再洗涤，然后与在1%bsa/pbs中的抗-β-联蛋白抗体溶液(50μl)(bd,oxford,uk)一起孵育过夜。
用洗涤缓冲液(3x200µl;含0.05%tween-20的pbs)洗涤后，将细胞与含hrp-缀合的第二抗体溶液(100μl)的1%bsa/pbs(dako,cambridge,uk)一起孵育，得到的信号使用tmb底物(50µl;r&dsystems,abingdon,uk)比色测定(od:450nm与参比波长655nm)。该反应通过加入1nh2so4溶液(50μl)终止。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞，加入2%结晶紫溶液(50μl)达30分钟。用洗涤缓冲液(3x200µl)洗涤后，向各孔加入1%sds(100μl)，将板轻轻摇动1小时，然后测量595nm的吸光度(varioskan®flash,thermo-fisherscientific)。
测量的od450-655读数通过将od450-655除以od595读数对细胞数进行校正。相对于溶媒计算各孔的诱导百分比，并且将诱导比率与通过包含作为整体定义的参比化合物n-(4-(4-(3-(3-叔丁基-1-对甲苯基-1h-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基氧基)吡啶-2-基)-2-甲氧基乙酰胺(1μg/ml)的标准对照产生的诱导相比进行标准化。
(n)t细胞增殖
来自健康受试者的pbmc使用密度梯度(lymphoprep,axis-shieldhealthcare)从全血分离。按照制造商的说明书(miltenyibiotec130-091-155)，淋巴细胞级分首先针对cd4+t细胞通过负磁细胞分选进行富集。然后按照制造商的说明书(130-045-901)，幼稚cd4+t细胞使用正磁筛选cd45ra+细胞，使用微珠进行分离。将细胞以2x105个细胞/孔在100μlrpmi/10%fbs中置于96孔平底板(corningcostar)中，将25μl的试验化合物在正常培养基中稀释至合适的浓度(8x终浓度)和加入至板上的一式两份的孔中，得到0.03ng/ml–250ng/ml的剂量反应范围。加入dmso作为阴性对照。将板预孵育2小时，然后用1μg/ml抗-cd3(okt3;ebioscience)刺激。72小时后，各孔中的培养基用150μl含10μmbrdu(roche)的新鲜的培养基置换。16小时后，除去上清液，将板干燥，并且按照制造商的说明书(roche)，通过向各孔中加入100μl的固定/变性溶液达20分钟使细胞固定。用pbs将板洗涤一次，然后加入抗-brdu检测抗体和在室温下孵育90分钟。然后用提供的洗涤缓冲液将板轻轻洗涤3次，通过加入100μl的底物溶液显色。反应通过加入50μl的1mh2so4终止，和在读板仪(varioskan®flash,thermofisherscientific)上读出450nm的吸光度。ic50从剂量反应曲线测定。
(o)在来自ibd患者的cd3/cd28刺激的lpmc细胞中il-2和ifnγ释放
固有层单核细胞(lpmc)从手术样本的发炎的ibd粘膜或从手术样本的正常粘膜如下分离和纯化：
粘膜用解剖刀从手术样本的较深层移出，切成大小3-4mm的碎片。通过用含1mmedta(sigma-aldrich,poole,uk)的hbss(sigma-aldrich)洗涤组织碎片三次同时使用磁力搅拌器搅拌而除去上皮，每次洗涤后弃去上清液。接着在37℃用1a型胶原酶(1mg/ml;sigma-aldrich)处理样品1小时，同时搅拌。然后使用100μm细胞过滤器将得到的细胞混悬液过滤，洗涤两次，再悬浮于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi-1640培养基(sigma-aldrich)，和用于细胞培养。
在dmso对照或合适浓度的化合物的存在下，新分离的lpmc(2x105个细胞/孔)用1µg/mlα-cd3/α-cd28刺激48小时。48小时后，除去上清液和通过r&delisa测定tnfα和ifnγ的存在。相对于对dmso对照(100%)测定的细胞因子释放，计算试验化合物对细胞因子释放的抑制百分比。
(p)自ibd患者分离的成肌纤维细胞的细胞因子释放的抑制
来自发炎的ibd粘膜的成肌纤维细胞如下分离：
将粘膜切下和弃去，将1mm大小的粘膜样品在37℃在潮湿的co2孵育箱中在添加20%fbs、1%非必需氨基酸(invitrogen,paisley,uk)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μg/ml庆大霉素和1μg/ml两性霉素(sigma-aldrich)的dulbecco’s改良的eagle’s培养基(dmem,sigma-aldrich)中培养。将建立的成肌纤维细胞集落接种在25-cm2培养烧瓶中，在添加20%fbs和抗生素的dmem中培养至至少第4代，以提供足够数量用于刺激实验。
以3x105个细胞/孔接种在12孔板中的亚汇合的单层成肌纤维细胞在无血清培养基中在37℃,5%co2中饥饿24h，然后在dmso对照或合适浓度的化合物的存在下培养24h。24小时后，除去上清液和通过r&delisa测定il-8和il-6的存在。相对于对dmso对照(100%)测定的细胞因子释放，计算试验化合物对细胞因子释放的抑制百分比。
(q)人嗜中性粒细胞脱粒
嗜中性粒细胞自人外周血如下分离：
通过静脉刺穿收集血液，并通过加入1:1edta:无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs,无ca+/mg+)而抗凝固。加入葡聚糖(3%w/v)(1份葡聚糖溶液对4份血液)，在室温下将血液放置约20分钟。上清液在密度梯度(lymphoprep,axis-shieldhealthcare)上小心分层和离心(15分钟，2000rpm,无制动)。吸出上清液，将细胞沉淀再悬浮于无菌盐水(0.2%)中不超过60秒(以裂解污染的红细胞)。然后加入10倍体积的pbs，将细胞离心(5分钟,1200rpm)。将细胞再悬浮于hbss+(含细胞松弛素b(5μg/ml)和1mmcacl2的hanks缓冲盐溶液(无酚红))，获得5x106个细胞/ml。
向v-底96孔板的各孔中加入5x104个细胞并与合适浓度的试验化合物(0.3–1000ng/ml)或溶媒(dmso,0.5%终浓度)一起孵育(30分钟,37℃)。通过加入fmlp(终浓度1μm)刺激脱粒。进一步孵育(30分钟,37℃)后，通过离心(5分钟,1500rpm)除去细胞，将上清液转移至平底96孔板。加入等体积的四甲基联苯胺(tmb)，10分钟后，通过加入等体积的硫酸(0.5m)终止反应，读出450nm的吸光度(减去655nm的背景)。50%抑制浓度(ic50)从得到的浓度反应曲线测定。
(r)细胞毒性测定法
将1×105个jurkat细胞(永生化的人t淋巴细胞)在100µl培养基(补充有10%胎牛血清的rpmi)中加入96孔板的合适数量的孔中。向孔中加入1µl的dmso对照(终浓度1.0%v/v)或试验化合物(终浓度20、5或1µg/ml)，并在37℃,5%co2孵育。24小时后，将板以1200rpm离心3分钟，弃去上清液。然后将细胞重悬浮于150µl(终浓度7.5µg/ml)的碘化丙啶(pi)/pbs，并在37℃,5%co2孵育15分钟。15分钟后，通过流式细胞术(bdaccuri)使用fl3窗分析细胞。%存活力计算为标准化至dmso对照的在测试孔中pi阴性的细胞的%。
体内筛选：药效学和抗炎活性
在小鼠中lps诱导的嗜中性粒细胞积聚
向未禁食的balb/c小鼠通过气管内途径以指定的次数(在2-8小时范围内)给予溶媒或试验物质，然后通过施用lps攻击刺激炎性反应。在t=0时，将小鼠置于暴露室中，暴露于lps(7.0ml,0.5mg/ml溶液，在pbs中)30分钟。另外8小时后，将动物麻醉，将它们的气管插管，通过灌注提取balf，然后从它们的肺中经过气管导管抽出1.0ml的pbs。在balf样品中的总白细胞计数和白细胞分类计数使用neubauer血球计测量。balf样品的细胞离心涂片通过在室温下以200rpm离心5分钟制备，并使用diffquik染色系统(dadebehring)染色。使用油浸显微镜将细胞计数。bal中的嗜中性粒细胞数的数据表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。相对于溶媒处理，计算各处理的嗜中性粒细胞积聚的抑制百分比。
(ii)香烟烟雾模型
使用用于小动物的tobaccosmokeinhalationexperimentsystem(modelsis-cs;sibatascientifictechnology,tokyo,japan)，将a/j小鼠(雄性,5周龄)暴露于香烟烟雾(4%香烟烟雾，用空气稀释)30分钟/天达11天。在最后的香烟烟雾暴露后，将试验物质经鼻内给予(35μl的溶液，在50%dmso/pbs中)每天一次达3天。最后给药后12小时，将各动物麻醉，将气管插管，收集支气管肺泡灌洗液(balf)。使用抗-小鼠moma2抗体(巨噬细胞)或抗-小鼠7/4抗体(嗜中性粒细胞)，肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞的数量通过facs分析(epics®altraii,beckmancoulter,inc.,fullerton,ca,usa)测定。
(iii)小鼠中dss诱导的结肠炎
通过用葡聚糖硫酸钠(dss)处理刺激炎性反应前一天(第-1天)，通过口服强饲向未禁食的10-12周龄、雄性bdf1小鼠每日两次给予溶媒、参考物(5-asa)或试验化合物。在研究的第0天，在饮用水中给予dss(5%w/v)，接着bid给予溶媒(5ml/kg)、参考(100mg/kg)或试验化合物(5mg/kg)达7天。含dss的饮用水每3天装满一次。在研究期间，每天对动物称重，进行粪便观察和基于粪便稠度记录作为评分。在第+6天处死时，移出大肠，记录长度和重量。将结肠切片用于mpo分析以测定嗜中性粒细胞浸润，或用于组织病理学评分以确定疾病严重性。
(iv)小鼠中tnbs诱导的结肠炎
通过用2,4,6-三硝基苯磺酸(tnbs)(15mg/ml，在50%乙醇/50%盐水中)处理刺激炎性反应前一天(第-1天)，通过口服强饲向未禁食的10-12周龄、雄性bdf1小鼠每日两次给予溶媒(5ml/kg)、参考物(布地奈德2.5mg/kg)或试验化合物(1或5mg/kg)。在研究的第0天，通过塑料导管结肠内给予tnbs(200µl)，bid给予溶媒、参考或试验化合物持续2或4天。在研究期间，每天对动物称重，进行粪便观察和基于粪便稠度记录作为评分。在第2天(或第4天)处死时，移出大肠，和记录长度和重量。将结肠切片用于组织病理学评分以确定疾病严重性。
(v)小鼠中的过继转移
在研究第0天，处死雌性balb/c小鼠，获得脾用于cd45rb高细胞分离(使用scidibd细胞分离方案)。然后将大约4x105个细胞/mlcd45rb高细胞经腹膜内注射(100µl/小鼠)到雌性scid动物。在研究第14天，对小鼠称重，和基于体重随机分成治疗组。在第14天，化合物以5ml/kg的剂量体积，通过口服强饲bid给予。继续治疗直到研究第42天，在该点在早晨给予后4小时将动物尸检。记录结肠长度和重量，并用作研究的第二终点，作为结肠水肿的测量。然后将结肠分成六个横切片，其中四个用于组织病理学评分(第一终点)，两个经匀浆用于细胞因子分析。显示的数据是在首次用于实验的动物和溶媒动物之间的诱导窗的%抑制，其中越高的抑制意味着越接近于无疾病的首次用于实验的表型。
(vi)在大鼠中内毒素诱导的葡萄膜炎
将雄性lewis大鼠(6-8周龄,charlesriveruklimited)在3个笼中在19-21℃以12小时光/暗周期(07:00/19:00)饲养，饲喂标准的啮齿动物饲料和随意饮用水。对未禁食的大鼠称重，分别在尾部用永久标记鉴别，并接受单次玻璃体内给予100ng/动物的lps(大肠杆菌0111:b4，在pbs中制备,sigmaaldrich,uk)至右玻璃体液(5µl剂量体积)，使用32-规针头。未治疗的大鼠用pbs注射。在lps前1小时，在lps给予时，以及lps给予后1、2和4小时，将试验化合物或溶媒(4%聚乙二醇40硬脂酸酯、4%甘露醇/pbs(ph7.4))通过局部途径给予到动物的右眼上(10µl)。给予前，将待给予的溶液超声处理以确保澄清溶液。在lps给药后6小时，通过过量给予戊巴比妥(经过心脏穿刺)将动物安乐死。安乐死后立刻在手术显微镜下通过使用32规针头，穿刺前房从大鼠的右眼收集10µl的房水。房水在20µl的pbs中稀释，立即使用countess自动化细胞计数器(invitrogen)测量总细胞计数。在房水收集后，将各动物的右眼摘出，围绕晶状体切成前和后切片。将各切片称重和在500µl无菌磷酸盐缓冲盐水中匀浆，接着以12000rpm在4℃离心20分钟。将得到的上清液分成3个等份和贮藏在-80℃直到随后通过r&dduosetelisa进行细胞因子分析。
体外和体内筛选结果概述
表1：使用kinomescantm技术，通过leadhunterdiscoverservices(discoverxcorporation,fremont,ca)测定的对于选择的激酶的离解常数。
使用kinomescantm技术，通过leadhunterdiscoverservices(discoverxcorporation,fremont,ca)进行的研究确定了实施例1的化合物对激酶b-raf和b-raf(v600e)与它们的标准配体的结合不具有任何显著影响。此外，与参比化合物n-(4-(4-(3-(3-叔丁基-1-对甲苯基-1h-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基氧基)吡啶-2-基)-2-甲氧基乙酰胺(wo2010/112936)相比，该化合物显示改进的选择性，如通过较低的选择性评分证明的(表1a)。
表1a：50和500nm的kinomescan选择性评分数据；s(35)=(%ctrl<35的无突变激酶数)/(测试的无突变激酶数)；s(10)=(%ctrl<10的无突变激酶数)/(测试的无突变激酶数)；s(1)=(%ctrl<1的无突变激酶数)/(测试的无突变激酶数)
表1b：来自体外p38mapkα(方法2)、c-src、syk和gsk3α(方法2)抑制测定法的结果
表2：在受刺激的细胞中细胞因子释放的抑制(上文测定法(b)、(c)和(d))。
如下表3中所示，在上文测量对pbmc的细胞分裂(有丝分裂)的影响的测定法(g)中，本发明的实施例的化合物比参比化合物(n-(4-(4-(3-(3-叔丁基-1-对甲苯基-1h-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基氧基)吡啶-2-基)-2-甲氧基乙酰胺;wo2010/112936)具有显著更低的活性。类似地，本发明的实施例的化合物具有比参比化合物显著更低的细胞毒性，显示了在上文细胞毒性测定法(r)中提高的成活力(表3)。
表3：本发明的化合物对pbmc的细胞分裂(nt=未测试)和对jurkat细胞成活力的影响
a参见例如，wo2013/050757中报告的值。
如下表4所示，实施例1的化合物显著地和剂量依赖性地减少细胞侵润，如通过降低的细胞计数和在用玻璃体内的内毒素lps处理的大鼠眼睛的前段和后段两者中细胞因子il-1β水平显示的(见上文测定法(vi))。
表4：实施例1的化合物对在lps刺激的大鼠的眼睛中il-1β水平和细胞计数的剂量依赖性影响。数据报告为均值±sem。
另外的研究概述
禁食状态模拟的结肠液(fasscof)中溶解性的测定
本发明的化合物在ph6.5的fasscof中的溶解性使用之前报道的方法的改进测定(vertzoni,m.等pharm.res.2010,27,2187–2196)。代替在原始方法中使用的胆汁盐提取物(所述提取物不再可用)，改进的方法使用牛磺胆酸钠(0.15g)、甘胆酸(0.15g)、熊脱氧胆酸(0.05g)、胆酸(0.05g)和甘脱氧胆酸(0.05g)的混合物。这五种胆汁酸用研钵和研杵在一起研磨，以产生白色细粉，如下所述将其掺入fasscof。
fasscof介质：将三(羟基甲基)氨基甲烷(tris;0.275g)和马来酸(0.44g)溶于水(35ml)，得到溶液，其ph通过用0.5mnaoh(约12ml)处理调整至6.5。然后溶液用水补足至50ml。将该tris/马来酸盐缓冲溶液的一部分(约25ml)加入0.5l圆底烧瓶，然后用0.00565g的上述胆汁酸混合物处理。加入磷脂酰胆碱(0.0111g)在dcm(0.15ml)中的溶液和棕榈酸(0.0013g)在dcm(0.15ml)中的溶液，然后在减压下在40℃蒸发有机溶剂，直到实现澄清溶液，没有可感知的dcm气味。通过加入tris/马来酸盐缓冲液的剩余部分将蒸发溶液的体积调整至50ml，然后加入bsa(0.115g)，然后通过轻轻搅拌溶解。
溶解度测定：将试验化合物悬浮于ph6.5fasscof介质中，以得到2–10mg/ml的最大终浓度。将悬浮液在25℃下平衡24h，然后通过玻璃纤维c滤器过滤。然后将滤液适当稀释，用于注入，并参照标准品通过hplc定量。将不同体积的标准品、稀释和未稀释的样品溶液注入，并使用通过在与标准品注入的主峰相同的保留时间下存在的峰的积分确定的峰面积，计算溶解度。
fasscof溶解度显示在下表5中，其表明实施例化合物显示在ph6.5的fasscof介质中超过0.01mg/ml的溶解度。对于本发明的实施例的化合物，ph6.5fasscof溶解度优于参比化合物a，3-((4-((4-(3-(3-(叔丁基)-1-(对甲苯基)-1h-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-n-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺{fyfe,m.c.t.,wo2014/140582}的溶解度。
表5：对本发明的实施例的化合物在ph6.5的fasscof中测量的溶解度。
药代动力学参数测定
由sailifesciences(hinjewadi,pune,india)进行研究以调查本发明的化合物的系统药代动力学和总结肠组织分布。具体而言，在单次口服给予化合物后，在雄性c57bl/6小鼠中进行药代动力学研究。
表6中录入的数据显示，本发明的化合物达到显著的结肠浓度，而相比之下，系统血浆或血液暴露极低或可忽略。
表6：以5mg/kg口服给予小鼠本发明的化合物后获得的平均血浆或血液浓度(ng/ml)或总结肠水平(ng/g)。溶媒=在水中制备的0.1%tween80/0.5%甲基纤维素溶液。
表6的略语表
d=给予(给药)的化合物
m=测量的化合物
mx=基质
pl=血浆
bd=血液
tc=总结肠
herg抑制研究
在essenbioscience(welwyngardencity,england)使用ionworkstm膜片钳电生理学测试本发明的化合物对humanetherago-go(herg)通道的抑制。
表7：本发明的化合物的herg抑制数据
急性眼刺激/侵蚀研究
急性眼刺激/侵蚀研究的目的是，在白化病新西兰白兔(开始给药时13–15周龄；2雄性和2雌性/给药组)的眼睛中，通过眼途径(双侧滴注40µl/眼/滴注)，以每日四次给药(4小时间隔)，在一个治疗日(阶段1)或三个连续治疗日(阶段2)后，与溶媒(4%w/v聚氧乙烯40硬脂酸酯/4%w/v甘露醇/磷酸盐缓冲液(ph7.4)溶液)相比，评价两个选择的给药水平(0.1和1.0mg/ml)的实施例1的化合物的可能的刺激或侵蚀潜力。
在研究期间，没有计划外的死亡，也没有试验物相关的临床迹象。此外，对体重没有影响，对食物消耗也没有影响。
在阶段1中，在滴注溶媒或任何给药水平的试验物实施例1制剂后，在所有组中眼睛反应主要限于结膜发红(1或2级)和偶然结膜水肿(1级)和分泌物(discharge)(1级)。这些评分为轻度至中度。在实施例1治疗的动物和溶媒对照之间不存在频率、严重性和发生率方面的差异。结膜发红是最常见的反应，并且在开始给药前仍存在(1级)。在眼睛研究期间已知该局部反应自发发生在白化病兔中，和涉及动物经历的多种眼睛检查。在第一次滴注后和之后3天观察期内在所有组中偶然观察到结膜水肿和分泌物。此外，在两个高剂量组兔(1mg/ml)和一个溶媒组雌性的眼睛中偶然和单侧观察到虹膜充血。在单次治疗日后draize检查证实了角膜的完整性，并且在所有情况下对所有动物而言光动反射是正常的。简言之，因此认为在单次给药日后，制剂的局部耐受性是可接受的。在滴注溶媒或包含实施例1的化合物的制剂后观察到类似的局部反应，指示对眼睛耐受的中等的溶媒相关作用。
在阶段2中，在所有组中在滴注溶媒或任何剂量水平的试验物制剂后，主要眼睛反应限于结膜发红(1级)。该评分是轻度的，并且在整个3天治疗期间在各组之间在发生率和频率方面，观察到没有任何有效差异。在溶媒组中严重性(2级)偶然高于试验物治疗组。这种结膜发红是持续的，在次日的第一次滴注前仍被观察到。此外，在两个高剂量组兔和一个溶媒组雌性的眼睛中偶然观察到虹膜充血。在所有情况下在任何动物中没有观察到分泌物。在3天治疗期间draize检查证实了角膜的完整性。在所有情况下对于所有动物而言，光动反射是正常的。简言之，因此认为制剂的局部耐受性是可接受的，对于3个治疗日没有任何恶化。在仅滴注溶媒或滴注包含实施例1的化合物的制剂后，观察到类似的局部反应，指示对眼睛耐受的中等的溶媒相关作用。
诱变性评价(细菌逆突变筛选)
由sequani(ledbury,herefordshire,uk)进行研究以体外评价实施例1的化合物在鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)的4个组氨酸依赖性营养缺陷型突变体，菌株ta1535、ta1537、ta98和ta100以及大肠杆菌(escherichiacoli)的1个色氨酸依赖性营养缺陷型突变体wp2uvra中诱导突变的能力。
使用板掺入方法进行突变筛选，并且在s-9mix(源自aroclor1254处理的大鼠的肝脏的肝线粒体后部分)的存在和不存在下进行。将细菌暴露于溶于二甲基亚砜的实施例1的化合物，所述溶剂也用作阴性对照。阳性对照化学品是在不存在s-9mix时的叠氮化钠(ta1535和ta100)、9-氨基吖啶(ta1537)、2-硝基芴(ta98)和4-硝基喹啉-n-氧化物(wp2uvra)和在存在s-9mix时的2-氨基蒽(所有菌株)。
在s-9mix的存在和不存在下，在所有菌株中，在板掺入条件下用于突变试验的实施例1的化合物的剂量是15、50、150、500或1500µg/板。
在板掺入条件下在所有菌株中在s-9mix的存在和不存在下，分析实施例1的化合物，直至1500µg/板的溶解度的限制。
在ta1537和ta98中在s-9mix的存在下以500µg/板，和在所有菌株中在s-9mix的存在和不存在下以1500µg/板，观察到沉淀。在s-9mix的存在下，在ta98中在500µg/板和1500µg/板时，和在ta1535中在1500µg/板时，平均菌落计数也有减少，指示试验物对细菌的毒性。
在板掺入条件下在s-9mix的存在和不存在下，以任何剂量水平的实施例1的化合物，在任何菌株中观察到的逆转株数量没有剂量相关或统计学显著的增加。这表明在试验条件下对于实施例1的化合物，不存在任何诱变作用。
水解稳定性研究
可在dmso和水(3:1)的混合物中以1mg/ml的试验化合物浓度评价本发明的化合物的化学稳定性。
通用hplc程序
agilent,watersx-selectc18,2.5μm,4.6x30mm柱,4min方法,5-95%mecn/水(0.1%甲酸)。流速2.5ml/min。柱烘箱温度40℃。检测254nm。
样品制备
将试验化合物的1.0mg样品溶于750μl的dmso。缓慢加入水(250μl)，确保无沉淀出现。
记录稳定性
取出50μl等份的试验溶液和通过5μlhplc注射一式两份分析。根据相应uv迹线的手工积分，记录试验化合物的峰面积。
将试验溶液加热至60℃，同时搅拌，在5和24h时间点取出50μl等份用于hplc分析。在所有情况下，使用5μl注射，并且样品以一式两份分析。
在两个随后的时间点记录试验化合物的峰面积，根据峰面积随时间的%变化计算%分解。
参比化合物b(3-乙炔基-5-((4-((4-(3-(3-异丙基-1-(对甲苯基)-1h-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(2-吗啉代乙基)苯甲酰胺；cariou,c.a.m.等,wo2014/027209)包括在各稳定性研究中，作为对照以验证研究。
药物制剂的稳定性
如下制备20ml1mg/ml的实施例1化合物的钠(na)和盐酸(hcl)盐的储液，一式两份：将合适量的各盐与包含4.5%甘露醇和3%聚乙二醇40硬脂酸酯的10mmph7.2磷酸盐缓冲液混合。超声处理样品，以得到具有以下性质的澄清溶液：重量克分子渗透浓度(mosm/kg):310(na),314(hcl);ph:7.00(na),7.05(hcl)。用20%dmso/水将0.5ml的储液稀释至1ml，并注入用于通过hplc进行纯度分析。然后将剩余的储液在hplc管中分成0.5ml等份，并在各种条件下一式两份贮存。将样品在5和25℃下贮存，然后在1、2和4周时通过hplc进行分析。将单独的样品在40℃下储存，并在4周时进行分析。下表中显示的分析表明，实施例1的化合物在5℃下在溶液中是稳定的。
缩写
前缀n-、s-、i-、t-和tert-具有其常用含义：正、仲、异和叔。