本专利涉及乳品乳酸菌活性快速检测方法，属于生物技术领域范畴。
背景技术：
乳酸菌（lactobacillus）是发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、德国酸菜、啤酒、葡萄酒、泡菜、腌渍食品和其他发酵食品。
人类制作发酵乳的历史可追溯到数千年以前，最早的发酵可能是游牧民族偶然实现的。早在公元前2000年左右，埃及和古希腊人已经掌握了发酵乳的手工制作方法，其实质是利用乳中的固有微生物使其定向繁殖后形成所期望的产物。19世纪80年代，主要在农场小批量地生产黄油和干酪，其后随着商业化规模的扩大，生产单位开始合并，导致对发酵剂的需求量增大，因此出现了一些专门生产发酵剂的工厂。在19世纪末20世纪初，已经用组成不确定发酵剂来发酵乳制品，生产高质量的干酪和黄油。多年来，发酵剂经过多次的传代，它们的组成已经发生改变，与最初凝固乳的发酵剂的组成可能明显不同。
乳酸菌的发现分离不仅为研究和利用乳中微生物铺平了道路，还促进了乳品发酵剂工业的崛起。如今乳酸菌及其发酵剂已成为乳制品发酵的核心，对其研究方兴未艾，前景广阔。
乳酸菌发酵剂的发展大致经历了天然型、传统人工型和浓缩直投型3个阶段。1、菌种生理代谢方面。对菌种基因序列分析、功能基因确定、碳氮源代谢途径和所需工业特性基因的改造等进行全面细致地研究，欲从基因角度了解其发酵机制和过程。2、乳酸菌生理活性研究与利用。双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等肠道有益菌分泌的代谢产物对消化道健康、免疫和抑癌的积极作用已引起世界范围的重视，使得研究者跳出单纯利用发酵剂改善产品风味和质构的框架，进一步开发出具有高附加值的功能型乳制品。3、发酵剂生产技术的提高。高密度培养技术，发酵与产物分离偶联技术和冷冻干燥生物技术等工程技术的不断改进，不仅使乳酸菌进行自动化和连续化发酵生产成为可能，还大大降低了机械设备和冷冻干燥对菌体的伤害，提高了发酵剂保藏过程中菌体的存活率。
目前乳品发酵剂生产多采用冷冻干燥的方法，发酵剂菌粉制作过程一般要经过高密度发酵培养、离心菌体、加保护剂、预冷冻、冻干等过程。冷冻干燥浓缩发酵剂可防止菌种失活及复配菌种的比例在保存、扩大培养过程中发生变化，还可防止杂菌污染和省去菌种扩培过程，保证产品质量稳定和可精确控制，但是冷冻干燥对活菌存活率和菌体活力也有较大的影响。
目前乳酸菌活菌计数多采用国标法（gb-4789.35-2010），该方法主要用于含活性乳酸菌食品乳酸菌计数，文献报道辛若竹等人采用直接显微镜计数法测定乳酸菌总数（辛若竹，刘洋来，魏昆民.活性酸乳中乳酸菌的直接镜检计数法[j].中国卫生检验杂志，200717（3）：476-477）。但该方法采用稀释涂片的方式实现了乳酸菌的技术，此方法的缺陷在于笼统的计数不能对乳酸菌死菌进行识别，另外不同的取样和稀释倍数同样存在误差，采用显微镜直接计数，在一定程度上无法正确反映乳酸菌活性菌株数量，这样会给结果的准确性带来一定的影响。
酸乳风味的形成与乳酸菌发酵过程代谢的多种物质有关，而这些物质的产生与发酵速度等活力指标有密切关系。乳酸菌的活力可由多种参数确定，如细胞生长情况，细胞干重和光密度（od值）等。由于乳液不透明，不能直接测od值，可用naoh和edta处理使其澄清后再测。较简便的活力测定包括凝乳时间，产酸和活菌数量等指标的检测。
发酵乳制品质量的好坏主要取决于发酵剂的品质类型及活性。本专利的为乳酸菌发酵剂活性提供了乳酸菌活性快速检验的方法，可有效保证发酵乳制品产品质量均一稳定。
技术实现要素：
本发明的是根据目前乳品生产所用发酵剂缺少快速检验发酵剂菌种活性方法的不足，提供一种快速检测乳品发酵剂活性检测方法。
实现以上目的的技术方案如下：
1、培养基的制备
番茄汁50ml，酵母浸粉5g，牛肉膏10g，乳糖20g葡萄糖2g，k2hpo42g，吐温801g，乙酸钠5g，硫酸锰0.2g，硫酸镁0.5g，水加至.1000ml，用1mol/l的氢氧化钠调节ph至6.8，上述培养基经121℃，20min杀菌。
2、脱脂乳培养基
脱脂乳：将牛乳间接或直接加热煮沸20-30min，冷却过夜，脂肪即可上浮，用吸管或虹吸法将底层乳吸出，弃上层乳脂，即为脱脂乳。于115°c高压蒸汽灭菌20-30min，供菌种保藏、活化与制备发酵剂使用。
脱脂乳培养基：鲜乳煮沸后装入三角烧杯中，100℃，30min，然后自然冷却。待出现脂肪层后，取下层乳液分装于试管中，加量于试管的1/3处，包装好，利用间歇灭菌法（106℃，30min灭菌，每天一次，连续3d）灭菌，冷却，低温保存，备用。
3、发酵剂复水：冻干乳酸菌发酵剂先于10ml葡萄糖水中4℃下复水30min。
4、无菌检验方法：将菌种接种到液体mrs中，每隔一周传代一次。每次使用前，将菌种接入无菌脱脂乳中，于42℃培养至凝乳，记下时间和ph。如果这些指标有明显的变化，则不能使用，表明菌种已退化或污染。
5、检测方法：
①酸度：采用0.1mol/l氢氧化钠溶液中和滴定法；
②乳酸菌计数：用乳品发酵剂菌染液做为稀释液，稀释倍数为25倍，显微镜下计数；
③菌体存活率测定：把干燥菌粉还原为原液浓度后进行测定，菌体存活率（%）=干燥后乳酸菌活菌数/干燥前乳酸菌活菌数×100%；
④乳酸菌发酵剂活性测定：把冻干菌粉以0.01%的比例接入无菌脱脂奶中，37.8℃恒温培养3.5h，测定酸度，如果酸度达到ph4.5，则认定活性较好，并以酸度的数值来表示。
6、一种乳品发酵剂活性快速检测方法，包括以下实施步骤：
①酸度的测定，按照常规方法将乳品发酵剂按照5%的接种量接种灭菌牛奶中，42℃培养5h，测定此时培养基ph。
②乳酸菌计数，将乳品发酵剂按照5%接种量接种到脱脂乳培养基中，42℃培养8h，采用mrs培养基平板计数和显微镜计数方法，对发酵剂乳酸菌菌数进行计数。
③菌体存活率测定，把干燥菌粉还原为原液浓度后进行测定，菌体存活率（%）=干燥后乳酸菌活菌数/干燥前乳酸菌活菌数×100%；
7、与现有的酸菌活性快速检验的方法相比，本发明提供了一种快速检测乳酸菌活性的方法，可以快速准备的判断所用乳品发酵剂的活性，具有周期短、操作简便等优点，特别适合工厂化乳品生产发酵剂活性的检测。
具体实施方式
以下对乳品乳酸菌活性快速检测方法进行进一步描述。
、主要仪器设备：
超净工作台（sw-cj-1fd）、显微镜（xsp-bm12）、灭菌锅（yxq-ls）、厌氧培养箱（dhp-9052）
2、材料与试剂
材料：被检测材料为公司发酵乳生产发酵剂
试剂：
酵母浸粉，电子天平称取5g；
牛肉膏，电子天平称取10g；
乳糖，电子天平称取20g；
葡萄糖，电子天平称取2g；
k2hpo4，电子天平称取2g；
吐温80，电子天平称取1g；
乙酸钠，电子天平称取5g；
硫酸锰，电子天平称取0.2g；
硫酸镁，电子天平称取0.5g；
氢氧化钠，配成浓度为1mol/l氢氧化钠溶液。
香柏油
番茄汁做法：
（1）将番茄洗净，沥干表面水分，去蒂切成块；
（2）用豆浆机将切好的番茄打成浆；
（3）将干净纱布铺在一个1000ml烧杯上，把切好的番茄浆倒进去
（4）将纱布四周提起来，用力将汁水挤到碗里即可。
、培养基的制备
按照培养基准确称取各成分，定容至1000ml，用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至6.8，121℃灭菌20min。
脱脂乳培养基：
脱脂乳培养基：鲜乳煮沸后装入三角烧杯中，100℃，30min，然后自然冷却。待出现脂肪层后，取下层乳液分装于试管中，加量于试管的1/3处，包装好，利用间歇灭菌法（106℃，30min灭菌，每天一次，连续3d）灭菌，冷却，低温保存，备用。
、乳酸菌发酵培养
将生产所用的乳品发酵剂，按照5%接种量接种到改良的mrs培养基和脱脂乳培养基中，42℃，酸度测定培养5h；乳酸菌计数培养8h。
、酸度测定
（1）观察：观察并记录的凝乳时间。
（2）酸度采用naoh滴定法，测定发酵乳液的滴定酸度。
、镜检与计数
（1）编号取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。
（2）稀释将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml，移入含有225ml无菌水的三角瓶中，在漩涡混合器上充分振摇，使样品分散均匀，获得10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当稀释度。
（3）倒平板选用2～3个适宜浓度的稀释液，分别吸取1ml注入平皿内，然后倒入事先溶化并冷却至45℃左右的mrs固体培养基，迅速转动平皿使之混合均匀，待冷却凝固后倒置，于40℃培养48h。
（4）分离无菌操作，从培养好的固体平皿中分别挑取5个单菌落接种于液体mrs培养基中，置40℃培养箱中培养。
（5）镜检通过镜检，确定所分离的乳酸菌是乳杆菌还是链球菌。保加利亚乳杆菌呈杆状，单杆、双杆或长丝状；嗜热链球菌呈球状，成对、短链或长链状。
（6）接种按1%的接种量，将mrs液体培养物接种于已灭菌的复原脱脂乳中，另分别接种具有较高活力的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为对照。培养温度为保加利亚乳杆菌40℃，嗜热链球菌45℃。
、观察与测定
计数：采用倾注平板法，测定活菌数量。
（1）测定视野半径：向镜台测微尺刻度中心滴加香柏油，油镜观察，先使一端与左侧视野圆弧相切，再向右查格数乘以镜台测微尺每格长度0.01mm，即为油镜视野圆的直径，除以2为半径。
（2）制备样品稀释液：1：10
（3）涂片：用微量移液器取上述稀释菌液10µl（0.01ml）滴加于载玻片1cm2方格内，涂均，注意液体不可外流出方格，涂面要薄而均匀。自然干燥后，火焰固定。
（4）染色：革兰氏染色或1％甲苯胺蓝染色1min，水洗后用2％冰醋酸脱色1～2s，牛奶基质无色，乳酸菌或其他菌体蓝色。
（5）镜检与计数：油镜观察，计数任意10个视野中的菌数，求平均值，公式计算。
式中：r为显微镜油镜视野圆的半径（mm），y为稀释倍数，并将1cm2的涂抹面积换算为100mm2，0.01ml折算为每毫升的菌数，故最终还需乘以104。