一种用于检测前列腺癌的引物和探针的组合及试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种用于前列腺癌诊断的引物和探针。
背景技术：
：前列腺癌多发于老年男性，发病率在全球男性恶性肿瘤中占第二位，因癌症死亡的男性中，前列腺癌排名第五。年龄、性活动、饮食习惯和家族遗传为前列腺癌发病的主要风险因素。2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，且发病率逐年上升，并呈年轻化趋势。由于前列腺癌早期没有特异性症状，我国约70％前列腺癌患者发现时已是晚期。因前列腺癌骨转移率较高，自然进展的前列腺癌在利用有效方法临床检测到时通常已经转移。前列腺癌可以通过手术等切除前列腺、睾丸进行治疗，在切除之后由于没有肿瘤组织，检测体内是否还存在癌细胞的难度较大。血管舒缓素相关肽酶3(kallikrein-relatedpeptidase3，klk3)，也被称作前列腺特异抗原(prostate-specificantigen，psa)，klk3基因是人类组织激肽释放酶基因(klk)家族成员，位于19号染色体上，在前列腺癌组织中呈现高表达，其编码的蛋白是前列腺特异性抗原(psa)。是临床上广泛用于筛选、诊断前列腺癌的肿瘤标志物。klk3基因位于19q13.2-q13.4，基因全长6kb，含有5个外显子和4个内含子，转录后的mrna全长1446bp，转录受雄激素调节。目前，psa检测、盆腔电子计算机断层扫描(ct)检查、盆腔核磁共振(mri)检查、直肠超声(trus)引导下前列腺穿刺活检等检查是前列腺癌筛查的主要检测手段。对于psa检测来说，患者血清中存在异常高水平psa可能是由于癌症、良性前列腺增生或前列腺炎等多种原因导致，在大多数病例中，psa升高是由于良性前列腺增生或前列腺炎而不是由于癌症；mri检查在鉴别前列腺癌及伴钙化的前列腺炎、较大的良性前列腺增生、前列腺瘢痕、结核等病变时常无法明确诊断；盆腔ct对于早期前列腺癌的诊断敏感性低于mri，前列腺癌患者进行ct检查的目的主要是协助临床医师进行肿瘤的临床分期；trus引导下的前列腺穿刺活检是目前公认的安全而准确的方法，已成为临床实践中诊断前列腺癌最可靠的检查，但是穿刺活检除了造成患者的创口疼痛外，其术后多种并发症也会给患者带来很大痛苦。外周血循环肿瘤细胞(ctc)的检测是肿瘤患者液体活检的重要手段。当患者体内发生肿瘤时，或者肿瘤复发和转移产生时，瘤块组织中会有大量脱落的肿瘤细胞进入血液循环系统。利用高度灵敏的检测技术，将循环肿瘤细胞检测出来，可以对肿瘤进行早期诊断、复发和转移进行评估。因此，建立新的前列腺癌诊断技术、能够在灵敏准确的确定患者体内是否存在前列腺癌细胞，以便对于诊断患者是否患有前列腺癌和判断患者手术效果来确定最佳治疗方案以提高患者存活率、降低医疗成本是十分必要的。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测人前列腺癌循环肿瘤细胞的特异性引物和探针的组合及包括该引物和探针组合的试剂盒，以及他们的应用及检测方法。本发明一方面提供一种人前列腺癌循环肿瘤细胞特异性基因检测的real-timepcr引物和探针组合，用于人前列腺癌或其复发和转移的分子诊断，另一方面提供一种用于检测人前列腺癌循环肿瘤细胞的试剂盒，同时提供利用本发明的real-timepcr检测试剂盒诊断前列腺癌的方法。本发明通过在人前列腺癌循环肿瘤细胞基因组中klk3基因的启动子区设计一对特异性的real-timepcr引物和相应的探针，用该引物和探针对待测样本进行rt-qpcr检测，根据扩增结果判定待检样本是否含有人前列腺癌循环肿瘤细胞。本发明提供的用于人前列腺癌循环肿瘤细胞检测的特异性引物和探针的组合，其具有如下序列：引物1：5’atcaggaacaaaagcgtgatct3’(seqidno.1所示)，引物2：5’atatcgtagagcgggtgtgg3’(seqidno.2所示)，探针：5’atttcaggtcagccacagct3’(seqidno.3所示)。本发明提供的用于检测人前列腺癌的real-timepcr检测试剂盒，其特征在于包括以上所述的特异性引物和探针的组合。优选的，在本发明中所述的试剂盒中还包括10×pcr缓冲液，50mmmgcl2，10μmdntp以及5u/μltaq酶。本发明还提供了以上所述的特异性引物和探针的组合在制备检测前列腺癌试剂中的应用，以及所述的试剂盒在制备检测前列腺癌患者循环肿瘤细胞试剂中的应用。本发明另外还提供了利用real-timepcr检测试剂盒诊断人前列腺癌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)血液提取rna：从待测血液(2.5ml)提取rna，用dnasei消化除去基因组dna。用超微量分光光度计评价rna的纯度，-80度待用。(2)引物和探针溶液的配制：取18μl引物1(100μm)，18μl引物2(100μm)，5μl探针(100μm)，59μl去离子水。混匀得100μl20×的引物探针混合液(ppmix)。(3)反转录：取1μl上述rna，加入5×的反应缓冲液2μl，dntps[指datp，dctp，dgtp，dttp钠盐的三蒸水溶液，浓度各10mm，ph7.5，纯度＞99％(hplc)]0.4μl，2×ppmix1μl，反转录酶1μl，双蒸水4.6μl，混匀后反应体系为10μl。(4)预扩增：50℃，30min；95℃，15min；94℃，30s；60℃，2min。最后两步循环14次。(5)荧光定量pcr反应：将上述所得cdna用去离子水1∶1稀释。取1μlcdna，加入2×反应缓冲液5μl，20×ppminx0.5μl，roxdye0.4μl，双蒸水3.1μl。95℃变性2min，95℃，15s；60℃，2min，后两步循环40次。荧光定量检测探针结果，如果在阈值以上出现特异性扩增曲线，结果为阳性；反之，结果为阴性。本发明的有益效果体现在：1)特异性：用本发明的引物、探针和方法检测人外周血液样本，只有前列腺癌患者或者复发和转移的前列腺癌患者的血液样本出现扩增曲线，显示结果为阳性，而正常人或非前列腺癌患者的外周血样本均未出现扩增曲线，显示结果为阴性。这说明本发明有很好的特异性。2)灵敏度：本发明的方法可检测到从人2.5ml外周血中所提取的1pg的rna，说明具有很高的灵敏度。3)高通量：本方法应用荧光定量pcr仪(abiht7900)，一次可以同时检测384例样本，从而大量节省了时间，提高了效率。本发明建立了一种前列腺癌的分子检测技术，弥补了现有技术的不足，与常规的前列腺癌诊断方法相比，本发明的方法具有快速、高通量、灵敏和特异性好等特点，能更好地进行前列腺癌转移和复发的监测。最重要的是，本方法适用于临床液体活检的前列腺癌患者样本，能更好地进行人前列腺癌的早期诊断。附图说明图1为人前列腺癌患者外周血样本(15例)的特异性rt-qpcr检测结果(阈值0.1)；图2为健康人外周血样本(15例)的特异性rt-qpcr检测结果(阈值0.1)。具体实施方式以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，参见《分子克隆》(科学出版社，第二版，2002年)。实施例1用于人前列腺癌复发和转移检测的特异性引物和探针的建立本发明的人前列腺癌循环肿瘤细胞特异性标志物klk3的rt-pcr引物和探针，是根据ncbi(美国国立生物技术信息中心)公开的人类圈基因组序列，使用primerpremier5.0设计，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。引物1：5’atcaggaacaaaagcgtgatct3’；引物2：5’atatcgtagagcgggtgtgg3’；探针：5’atttcaggtcagccacagct3’。实施例2用于检测人前列腺癌复发和转移的real-timepcr检测试剂盒包括以下引物序列和探针序列：引物1：5’atcaggaacaaaagcgtgatct3’；引物2：5’atatcgtagagcgggtgtgg3’；探针：5’atttcaggtcagccacagct3’。所述的试剂盒还包括10×pcr缓冲液，50mmmgcl2，10μmdntps，5u/μltaq酶。实施例3本发明的试剂盒在检测人前列腺癌中的应用本发明采用的taq酶购于英潍捷基(上海)贸易有限公司；rna提取试剂盒为paxgenebloodrnakit(giagen，germany)；其他试剂为国产分析纯试剂。本发明所采用的生物材料均来自江苏省肿瘤医院普外科，所有样本均有患者本人签署的知情同意书及伦理证明。一、血液提取rna流程使用的血液rna提取试剂盒，来自paxgenebloodrnakit(giagene，germany)。1.取2.5ml全血(包括15例前列腺癌患者血液样本和15例健康人血液样本)，用paxgenebloodrna采血管采集。2.离心，将沉淀和蛋白酶k一起溶解在缓冲液中孵育，进行蛋白质酵解。应用paxgeneshredder离心柱再次离心，均浆细胞裂解液，并去除剩余的细胞残骸。3.将流过部分的上清液转移到干净的微型离心管中，加入乙醇调节结合条件，将裂解液装入一个paxgenerna离心柱中。4.使用dnasei酶消化除去微量的基因组dna。洗涤之后，使用洗脱缓冲液洗脱rna并进行热变形。5.提取的rna，分别取1μlrna和9μl去离子水，用超微量分光光度计测rna纯度。最后即得rna模板，-80度保存待用。二、制备100μl的20×引物和探针的混合反应液1.取18μl引物1(100μm)，2.取18μl引物2(100μm)，3.取5μl探针(100μm)，4.将前述的引物1和引物2及探针加入59μl的去离子水中，将上述引物和探针混匀后，即得100μl的20×引物和探针的混合反应液(ppmix)。三、rt-pcr流程实验所使用的荧光定量pcr检测仪为abi公司的ht7900。1.反转录。反转录所用的试剂盒为qiagenone-steprt-pcrkit(giagen，germany)。取1μl上述实施例1所述的rna，加入5×反应缓冲液2μl，dntps0.4μl，20×ppmix1μl，反转录酶1μl，去离子水4.6μl，混匀后反应体系为10μl。rt-pcr体系如表1所示：表1rt-pcr体系组分体积5×反应缓冲液2μldntps0.4μl20×ppmix1μlrna模板1μl反转录酶1μlh2o4.6μl合计10μl2.预扩增。rt-pcr反应条件如表2所示：表2反应条件其中，50℃、30min，循环1次；95℃、15min，循环1次；94℃、30s；60℃、2min，循环14次。即得cdna。四、荧光定量pcr反应荧光定量pcr反应所用试剂盒为pcr(abi，usa)。将上述所得cdna用去离子水1∶1稀释；取1μlcdna，加入2×反应缓冲液5μl，20×ppmix0.5μl，roxdye0.4μl，去离子水3.1μl；95℃变性2min；95℃、15s；60℃、2min，后两步循环40次。real-timepcr反应体系以及反应条件如表3和表4所示：表3real-timepcr体系组分体积2×反应缓冲液5μl20×ppmix0.5μlcdna1μlroxdye0.4μlh2o3.1μl合计10μl表4反应条件五、荧光定量检测探针结果所得结果见图1-2。结果显示15例前列腺癌患者样本中在设定的阈值0.1以上所有样本出现明显的扩增曲线，提示结果阳性(图1)；而15例健康人样本在设定的阈值0.1以上均未出现扩增曲线，提示结果阴性(图2)。说明本发明的试剂盒可用于人前列腺癌的诊断。以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内科对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。当前第1页12