猪蓝耳病QYYZ株的荧光定量检测引物、探针及试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种猪蓝耳病QYYZ株的荧光定量检测引物、探针及试剂盒。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又称蓝耳病，是一种以妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为特征的病毒性传染病,该病已成为危害全球养猪业的主要疫病之一。近年来，PRRSV的变异现象引起了人们的关注，国外的研究表明，同一基因型的分离毒株之间存在明显的序列差异，PRRSV的变异是造成本病难以控制的重要原因之一。2006年我国爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征，给中国养猪业造成很大损失，其病原就是PRRSV变异毒株，该毒株在NSP2基因组出现缺失变异，而原经典株疫苗对变异毒株保护性差，是该病爆发的主要原因。近年，很多猪场发生以妊娠母猪流产为主要症状的蓝耳病，目前免疫的疫苗对该蓝耳病保护性较差。通过核苷酸序列分析发现，病原为蓝耳变异毒株QYYZ株(清远株)。目前的疫苗对该病毒防控效果有限，因此必须摸索针对该病原的防控方法。

检测和流行病学调查是防控方法研究的基础，目前常用的方法是测序法，是以核苷酸的克隆和序列检测技术为基础，具体操作步骤是先用特异性引物扩增样品核酸的特异片段基因，将目的基因片段纯化后克隆入PMD-18T载体，再将克隆好的载体送往测序公司进行测序，最后将测得序列与高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒QYYZ株进行比对，与QYYZ毒株序列同源性较高，并有特殊插入序列，则判定为QYYZ株，一般需要7～10天时间。

测序法的主要缺点是检测周期较长，成本较高、敏感性低。检测周期长的原因是实验步骤较多，测序本身就需要较长时间；成本高是因为需要较多试剂和仪器，一般测序都是送往外公司付费检测；敏感性低是因为测序首先是要用一对引物对该毒株序列进行扩增，而是否能扩增出序列，受引物设计和PCR方法本身效率决定，一般PCR方法较荧光定量PCR方法敏感性低。

由此可见，现有技术在检测和鉴定QYYZ毒株上还有待改进。

技术实现要素：

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种猪蓝耳病QYYZ株的荧光定量检测引物、探针及试剂盒，本发明提供的引物、探针及试剂盒灵敏度高、反应快捷、操作简便。

本发明采用以下技术方案：

猪蓝耳病QYYZ株的荧光定量检测引物，所述引物的基因序列为：

上游引物：5’-TCACATGAGATTGGCCTTGCT-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物：5’-CGCAGGTGCCGTCGTTC-3’(SEQ ID NO:2)。

猪蓝耳病QYYZ株的荧光定量检测探针，所述探针基因序列为：

探针：5’-AAGGAGATGAGCAGCCCTTCGTG-3’(SEQ ID NO:3)。

进一步的，所述探针的5’端标记荧光报告基团；所述探针的3’端标记荧光淬灭基团。

进一步的，所述探针的5’端标记的基团为FAM；所述探针的3’端标记的基团为BQ1。

进一步的，猪蓝耳病QYYZ株的荧光定量检测试剂盒，主要包含有所述引物和探针；引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，所述猪蓝耳病QYYZ株的荧光定量检测试剂盒，具体包括：

(1)反转录部分：

RT预混液1：随机引物和dNTP mix；

RT预混液2：5倍反转录缓冲液，RNA酶抑制剂，反转录酶，不含RNA酶的双蒸水；

(2)定量PCR部分：

定量PCR预混液：定量PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探针SEQ ID NO:3，双蒸水。

进一步的，猪蓝耳病QYYZ株的荧光定量检测引物、探针应用于荧光定量检测方法，具体操作是：提取待检测样品中的RNA，经反转录后使用引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探针SEQ ID NO:3进行实时荧光定量PCR扩增；

反应条件：其中反转录的程序为42℃、15分钟；95℃、2分钟。荧光定量PCR程序为95℃、5秒；60℃、30秒，按此反应条件做40个循环。

结果及判读：

报告基团FAM有扩增曲线出现的即是繁殖与呼吸综合征变异毒株QYYZ株，若是无扩增曲线产生，则说明样品中不含繁殖与呼吸综合征变异毒株QYYZ株。其中扩增曲线CT值≤35的判为阳性；CT值＞35而≤37的判为可疑，需重复试验，第二次CT值仍在这个范围的判为阳性；若CT值＞37，超出本方法的检测范围，判定为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一组荧光定量PCR的引物和探针，该引物特异性和灵敏度都较高，且能够检测出变异的繁殖与呼吸综合征变异毒株QYYZ株，可以对各种临床样品进行检测、鉴别，从而可以快捷的对流行的繁殖与呼吸综合征变异毒株QYYZ株毒株进行区分，操作简单、实用。

与测序方法相比，本发明具有时间短、操作简单和灵敏度高等几方面优点。时间短、操作简单是因为荧光定量PCR方法，操作步骤少，节约大量时间，灵敏度高是因为荧光定量PCR方法采用荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术组合，比测序方法中常规PCR方法灵敏。

附图说明

图1本发明特异性实验结果：对不同毒株核酸样品扩增的曲线，其中A为繁殖与呼吸综合征变异毒株QYYZ株，B为JXA1变异株，C为CH-1a经典株，D为类NADC30毒株，E为猪瘟病毒核酸扩增曲线。

图2：本发明灵敏性检验结果：1、2、3、4、5、6、7代表的拷贝数分别为1.92×10⁶、1.92×10⁵、1.92×10⁴、1.92×10³、1.92×10²、1.92×10¹、1.92，8为阴性对照。

图3：本发明重复性检验结果：其中A为变异株，B和C为同一样品3次重复性试验，D为阴性对照。

具体实施方式

引物、探针的设计：

根据NCBI登陆的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列：猪繁殖与呼吸综合征病毒QYYZ株(登录号：JQ308798)，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1株(登录号EF112445.1)，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN(登录号：EF517962.1)，PRRSVBJ-4(登录号：AF331831.1)，PRRSV-HB-1(登录号AY150312.1)，PRRSVNADC30(登录号JN654459.1)提供的信息，经过比对分析，设计了以上定量PCR的引物和探针，分别为：

上游引物：5’-TCACATGAGATTGGCCTTGCT-3’(SEQ ID NO:1)

下游引物：5’-CGCAGGTGCCGTCGTTC-3’(SEQ ID NO:2)

探针：5’-AAGGAGATGAGCAGCCCTTCGTG-3’(SEQ ID NO:3)

检测试剂盒：

猪蓝耳病QYYZ株的荧光定量检测试剂盒，包括：

(1)反转录部分：

RT预混液1：随机引物25μm和dNTP mix 5mm，共60μL；

RT预混液2：5倍反转录缓冲液，RNA酶抑制剂5U/μL，反转录酶25U/μL，共110μL；

不含RNA酶的双蒸水：300μL；

(2)定量PCR部分：

定量PCR预混液：2倍定量PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶6U/μL，引物SEQ ID NO:1所示1pm、SEQ ID NO:2所示1pm和探针SEQ ID NO:3所示0.8pm，共700μL；

双蒸水700μL。

(3)阴阳性对照部分：阴性对照1.5mL；阳性对照1.5mL。

检测方法：

1、提取待检测样品中的RNA，具体操作为：

待检血液样品经过8000g离心5分钟，取上层血清备用；组织器官样品需要以1:5的质量体积比与灭菌双蒸水混合，研磨后8000g离心5分钟，取上清液备用。

血清或组织上清用AxyGen体液病毒DNA/RNA柱子法小量抽提试剂盒(也可用其他核酸提取方法)提取核酸，保存备用。

2、将提取的RNA反转录为cDNA，具体操作为

(1)反转录反应体系(每份)：

RT预混液1：1μL，RT预混液2：2μL，不含RNA酶的双蒸水：5μL，加入提取RNA：2μL，共10μL。

(2)反转录反应程序：

为42℃、15分钟；95℃、2分钟。

3、将反转录后cDNA进行荧光定量PCR扩增，具体操作为：

(1)定量PCR反应体系(每份)：

定量PCR预混液：12.5μL，双蒸水：7.5μL。

向上述PCR反应体系中加入5μL反转录好的cDNA液。

(2)荧光定量PCR扩增程序：

95℃、5秒；60℃、30秒，40个循环，其中60℃、30秒收集荧光信号。

以上操作所得扩增产物序列如下：

5-TCACATGAGATTGGCCTTGCTAAAGGAGATGAGCAGCCCTTCGTGCCGAACGACGGCACCTGCG-3(SEQ ID NO:4)

通过扩增曲线快速对猪繁殖与呼吸综合征变异毒株QYYZ株和其它毒株进行快捷的鉴别区分，具体操作为：

1、样品制备

(1)样品采集：病死或捕杀猪，取肺或淋巴结；待检活猪，采血1mL，2～8℃保存，送实验室检测。

(2)样品处理：病死或捕杀猪的组织样品，从每份三个不同位置取约1g样品，用手术剪剪碎混匀后取0.2g，加1mL生理盐水研磨，待匀浆后，8000g离心5分钟，取上清液备用；待测活猪的血液样品经过8000g离心5分钟，取上层血清备用。

2、病毒RNA的提取

制备的样品，连同阴性对照和阳性对照各取200μL，用AxyGen体液病毒DNA/RNA柱子法小量抽提试剂盒(也可用其他核酸提取方法)提取核酸，保存备用。

3、反转录操作

每管加1μL RT预混液1、2μL RT预混液2、不含RNA酶的双蒸水5μL，再加入提取核酸液2μL，混匀后，按42℃、15分钟；95℃、2分钟反应条件在PCR仪上反应。

4、实时荧光PCR操作

每管反应液，定量PCR预混液：12.5μL，双蒸水：7.5μL，反转录好的cDNA液：5μL，在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，反应条件为：95℃、5秒；60℃、30秒，按此反应条件做40个循环，其中60℃、30秒收集荧光信号。

检测结果：待荧光PCR反应结束后，根据阳性对照和阴性对照是否有扩增曲线及Ct值判定实验结果是否成立，若实验结果成立，根据被检样品是否有扩增曲线及Ct值判定样品是否含有繁殖与呼吸综合征变异毒株QYYZ株毒株。

结果分析：阳性对照Ct值≤25并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值，则实验结果成立；被检样品Ct值≤35并出现特定的扩增曲线，判定为繁殖与呼吸综合征变异QYYZ株阳性，CT值＞35而≤37的判为可疑，需重复试验，第二次CT值仍在这个范围的判为阳性；若CT值＞37，超出本方法的检测范围，判定为阴性；对于某些未出现特定的扩增曲线，但本底较高的样品，判定为阴性。

试验一特异性实验

取已知含有猪繁殖与呼吸综合征QYYZ株，JXA1变异株，CH-1a经典株，类NADC30株的样品，处理后取200μL用AxyGen体液病毒DNA/RNA柱子法小量抽提试剂盒提取核酸，然后进行反转录和荧光PCR操作，得出结果如图1所示，含有猪繁殖与呼吸综合征QYYZ株的样品扩增出图1中A曲线，Ct值为15.26，结果判定为阳性；含有JXA1变异株，CH-1a经典株，类NADC30株的样品未扩增出特定的曲线，判定为阴性。由此结果可知本发明方案有很好的特异性。

试验二灵敏性检验

将已知浓度为1.92×10⁹拷贝/mL的PMD-18T质粒(已克隆入序列5-TCACATGAGATTGGCCTTGCTAAAGGAGATGAGCAGCCCTTCGTGCCGAACGACGGCACCTGCG-3)进行10倍系列稀释，稀释至1.92×10³拷贝/mL，每个稀释度取1μL，加入定量PCR预混液：12.5μL，双蒸水：11.5μL，在荧光定量PCR仪上进行定量PCR反应，结果如附图2所示，曲线1、2、3、4、5、6、7Ct值分别是17.28、20.37、27.25、23.75、30.78、33.59、37.12，对应的质粒拷贝数分别为1.92×10⁶、1.92×10⁵、1.92×10⁴、1.92×10³、1.92×10²、1.92×10¹、1.92，由此结果可知，本发明的方案有很高额灵敏度。

试验三重复性检验

取已知含有猪繁殖与呼吸综合征QYYZ株的样品分成3份，处理后取200μL用AxyGen体液病毒DNA/RNA柱子法小量抽提试剂盒提取核酸，然后进行反转录和荧光PCR操作，得出结果如附图3所示，图3中曲线A、B、C，对应的Ct值分别是为16.57、16.39和16.89，结果判定为阳性；由此结果可知本发明有很好的重复性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。