一种线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于光分析检测技术领域，具体涉及一种线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

线粒体是细胞中重要的细胞器，是细胞的能量工厂，除此之外线粒体在细胞中还有许多重要的功能，如控制细胞的新陈代谢、钙离子调控及细胞凋亡通路控制等，线粒体的功能紊乱会导致多种疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病等，因此线粒体成像对亚细胞水平的诊疗具有重要的意义。

现在常用的线粒体探针有罗丹明123、JC-1、Mitotracker系列等，尽管它们已经作为商品探针用于线粒体成像，但是依然存在细胞毒性大、抗光漂白能力弱、不适宜长时间线粒体成像等诸多劣势，因此有必要开发出一种新的线粒体荧光探针用于活体细胞线粒体成像。

技术实现要素：

为了克服传统商品探针的诸多不足，本发明提供了一种线粒体成像效果好、毒性低、抗光漂白能力强的线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用。

本发明提供的技术方案具体如下：

一种具有线粒体靶向功能的荧光分子探针(以下简称TEA-BODIPY)，具有式(I)所示的结构：

一种制备上述具有线粒体靶向功能的荧光探针的方法，包括以下步骤：

(1)将对羟基苯甲醛溶于无水DMF中，加入无水碳酸钾和1,4-二溴丁烷，室温反应，得到粗产物，粗产物经柱层析纯化，得到化合物1；所述的化合物1为

(2)将化合物1与2,4-二甲基吡咯一同溶于无水二氯甲烷中，在氮气保护下，加入三氟乙酸作为催化剂，室温搅拌12小时，然后加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌，室温条件下继续搅拌2小时，搅拌结束后加入三乙胺和三氟化硼乙醚，搅拌过夜，反应结束后，反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，然后用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸钠干燥，将粗产物浓缩后采用柱层析纯化，得到化合物2；所述的化合物2为

(3)将化合物2与三乙胺一同在无水甲苯中回流48小时，将反应液浓缩后经柱层析纯化得到式(I)所示结构的化合物。

步骤(1)中，对羟基苯甲醛、碳酸钾和1,4-二溴丁烷的摩尔比为1：1.5：2。

步骤(2)中，化合物1、2,4-二甲基吡咯和2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌的摩尔比为1：2：1。

步骤(3)中，化合物2与三乙胺的摩尔比为1：10。

步骤(1)中，柱层析的淋洗液为体积比为8：1的正己烷-丙酮混合液；步骤(2)中，柱层析的淋洗液为体积比为8：1的石油醚-乙酸乙酯混合液；步骤(3)中，柱层析的淋洗液为体积比为4：1的甲醇-乙酸乙酯混合液。

上述具有线粒体靶向功能的荧光探针在生物标记领域中的应用。

上述具有线粒体靶向功能的荧光探针用于活细胞线粒体标记和成像。

一种利用上述具有线粒体靶向功能的荧光探针检测线粒形貌变化的方法，通过共聚焦成像技术检测线粒的形貌变化。

本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明制备的线粒体靶向荧光探针，具有荧光量子产率高(0.80)、水溶性好、环境极性及酸碱性对探针影响小、抗光漂白能力强、细胞毒性低等优点。

(2)本发明合成方法简单，可进行大规模生产。

(3)本发明制备的线粒体靶向荧光探针可用于生物成像、线粒体标记，是很好的生物标记探针。

附图说明：

图1为实施例1中探针TEA-BODIPY的合成路线图。

图2为实施例2中探针TEA-BODIPY在乙腈中的吸收和发射光谱图。

图3为实施例2中探针TEA-BODIPY在水溶液中的吸收和发射光谱图。

图4为实施例3探针TEA-BODIPY在不同pH条件下荧光强度的测试图。

图5为实施例4中探针TEA-BODIPY的在SGC7901细胞和HeLa细胞中MTT细胞毒性实验结果图；其中，图5(a)为SGC7901细胞，图5(b)为HeLa细胞。

图6为实施例5中探针TEA-BODIPY与商品线粒体染料Mito-Tracker red对活细胞线粒体的共定位成像实验结果图；其中，图6(a)为TEA-BODIPY对活细胞线粒体的成像图，图6(b)为Mito-Tracker red对活细胞线粒体的成像图，图6(c)为TEA-BODIPY和Mito-Tracker red对活细胞线粒体的成像图重合，图6(d)为Mito-Tracker red的发射区域与TEA-BODIPY的发射区域叠加。

图7为实施例6中探针TEA-BODIPY的抗光漂白实验结果图，其中，1～16表示扫描序号。

图8为实施例6中商品探针Mito-Tracker red的抗光漂白实验结果图，其中，1～16表示扫描序号。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：线粒体靶向功能的荧光有机分子(TEA-BODIPY)的制备

将对羟基苯甲醛(1.22g,10mmol)和1,4-二溴丁烷(4.30g,20mmol)溶于20mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入无水碳酸钾(K₂CO₃)(2.07g,15mmol)作为碱，室温反应，得到粗产物，过层析柱，得到化合物1，淋洗液为正己烷/丙酮(v/v)＝8/1的正己烷-丙酮混合液，化合物1的结构式为

将化合物1(0.512g,2mmol)与2,4-二甲基吡咯(0.380g,4mmol)一同溶于200mL干燥的二氯甲烷中，在氮气保护下，用少量的三氟乙酸(TFA)作为催化剂，室温搅拌12小时后加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)(2.27g,20mmol)，然后在室温条件下继续搅拌2小时，搅拌结束后加入5mL三乙胺(Et₃N)和8mL三氟化硼乙醚(BF₃-OEt₂)，搅拌过夜，反应结束后，反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，然后用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，粗产物浓缩后柱层析纯化，淋洗液为石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝8/1的石油醚-乙酸乙酯混合液，得到化合物2，化合物2的结构式为

将化合物2(0.237g,0.5mmol)与三乙胺(0.505g,5mmol)在无水甲苯中回流48小时，反应液浓缩柱层析纯化得到目标产物TEA-BODIPY，淋洗液为甲醇/乙酸乙酯(v/v)＝4/1的甲醇-乙酸乙酯混合液；¹H NMR(300MHz,DMSO)δ＝7.23-7.26(d,J＝8.6Hz,2H),7.08-7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.14(s,2H),4.06(s,2H),3.20-3.22(s,2H),3.20(s,6H),2.40(s,6H),1.76(s,4H),1.36(s,6H),1.13(s,15H)；ESI:元素分析的理论值:C₄₁H₄₁BBrF₂N₂OP⁺(M⁺)657.30；实际测量到的数值:657.40。

实施例2：线粒体靶向荧光探针TEA-BODIPY在不同极性溶液中的吸收和发射光谱测试

本发明采用的光谱测试浓度为10μM，测试的溶剂为水溶液和乙腈溶液，TEA-BODIPY在不同溶剂中的吸收和发射光谱如图2和图3所示。溶剂的极性对探针的吸收和发射光谱的改变很小，其斯托克斯位移几乎没有发生变化，可见溶剂极性对探针TEA-BODIPY的影响很小。

实施例3：线粒体靶向荧光探针TEA-BODIPY在不同pH条件下荧光强度的测试

本发明采用的光谱测试浓度为10μM，TEA-BODIPY在pH条件下荧光强度的测试如图4所示。pH对探针的荧光强度影响很小，说明该探针在细胞生理pH条件下可以正常使用。

实施例4：线粒体靶向荧光探针TEA-BODIPY的MTT细胞毒性实验

将消化后的细胞接种在96孔板上，细胞接种密度为10⁴个/孔，在37℃、5％CO₂条件下培养24小时，吸出培养液，然后用含有TEA-BODIPY的不同浓度的培养液继续培养细胞24小时，然后每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，继续培养4小时后终止培养，吸出培养液，每孔加入150μL二甲亚砜，摇床震荡10分钟后，使用多功能酶标仪测试，MTT细胞毒性结果如图5所示，所测试的两种细胞HeLa及SGC-7901细胞在TEA-BODIPY浓度增加至200μmol/L，培养24小时以后，细胞存活率均大于90％，证明该探针具有较低的细胞毒性，可以用于细胞成像。

实施例5：线粒体靶向荧光探针TEA-BODIPY与商品线粒体染料Mito-Tracker red对活细胞线粒体的共定位实验

本发明采用的细胞为HeLa细胞，将消化后的细胞接种在培养皿中，在37℃、5％CO₂条件下，培养24小时使之贴壁，用PBS溶液洗去不新鲜的细胞培养液后用TEA-BODIPY(5μM)的细胞培养液孵育细胞12小时，再用含有Mito-Tracker red(0.5μM)细胞培养液继续培养30分钟，用PBS溶液洗三次后成像，共定位成像结果如图6所示，TEA-BODIPY由488nm激光激发，Mito-Tracker red由561nm激光激发，将商品线粒体染料Mito-Tracker red的发射区域与TEA-BODIPY的发射区域叠加，发现二者的重合度很高且成像效果好，证明本发明的线粒体荧光探针TEA-BODIPY可以用于活体线粒体标记。

实施例6：线粒体靶向荧光探针TEA-BODIPY对比商品探针Mito-Tracker red的抗光漂白实验

TEA-BODIPY的抗光漂白实验具体如下：实验采用的细胞为HeLa细胞，将消化后的细胞接种在培养皿中，在37℃、5％CO₂条件下，培养24小时使之贴壁，用PBS溶液洗去不新鲜的细胞培养液后，用TEA-BODIPY(5μM)的细胞培养液孵育细胞12小时，用PBS溶液洗三次后成像，然后用激光共聚焦显微镜进行光漂白实验，激光强度为(65μW)，激发波长为(488nm)，每次扫描13.6秒，实验结果如图7所示。

Mito-Tracker red的抗光漂白实验具体如下：实验采用的细胞为HeLa细胞，将消化后的细胞接种在培养皿中，在37℃、5％CO₂条件下，培养24小时使之贴壁，用PBS溶液洗去不新鲜的细胞培养液后，用含有Mito-Tracker red(0.5μM)细胞培养液继续培养30分钟，用PBS溶液洗三次后成像，然后用激光共聚焦显微镜进行光漂白实验，激光强度为(65μW)，激发波长为(561nm)，每次扫描13.6秒，实验结果如图8所示。

实验结果表明，本发明所示的荧光探针TEA-BODIPY对比商品探针Mito-Tracker red有着非常优异的抗光漂白特性，可以用于长时间线粒体成像。

本发明的保护内容不局限于以上实施例，在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。