激肽释放酶7小分子抑制剂及其制备方法与用途与流程

本发明涉及药物化学领域，特别是指一种激肽释放酶7小分子抑制剂及其制备方法与用途。

背景技术：

特应性皮炎(AD)是一种广泛传播的慢性炎症性皮肤病，特点是干燥、鳞状皮肤、炎症、皮肤渗透性增加，AD病人的皮肤对环境中常见的而对正常人无害的因素也会很敏感从而易于受到表面感染。在过去的30年间工业化国家的特应性皮炎的发病率增长了2到3倍，据估计儿童的特应性皮炎患病率达到了15-30％，成人的特应性皮炎患病率达到了2-10％。由于发病机制的复杂性，对AD的发病机制了解得不多，但皮肤屏障功能紊乱已经被证实是AD发展过程中的关键因素之一。

皮肤屏障的稳定依赖于颗粒层的角质形成细胞分化为角质细胞和皮肤表层角质细胞脱落(即脱屑)之间的平衡，皮肤的脱屑过程包括由KLKs参与的桥粒的降解，由于桥粒是角质细胞的粘连蛋白，桥粒的降解则会导致角质细胞脱落而致皮肤脱屑。证据显示，局部或暂时性的KLKs活性控制的失调，是AD病人皮肤屏障稳定缺失的主要原因之一。

KLKs(Kallikreins，激肽释放酶)是具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶特异性的丝氨酸蛋白酶，其编码基因定位于19q13.4，编码15个分泌型丝氨酸蛋白酶KLK 1-KLK 15。已经证明，KLKs存在于正常人的角质层细胞中，目前发现，至少有8种KLK(KLK 5，KLK 6，KLK 7，KLK 8，KLK 10，KLK 11，KLK 13和KLK 14)存在于人的角质层和汗液中。

其中，KLK7占总量的40％。KLK7可能是皮肤损伤的一个关键酶，而且在AD病人中它可能参与一个系统性炎症反应，在AD的角质层KLK7升高最为突出，这提示KLK7在AD的发病机制上可能是至关重要的，因此，抑制KLK7的活性对于AD的治疗显得最为重要。

LEKTI(Lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor,淋巴上皮组织Kazal型相关蛋白抑制剂)是由SPINK5基因编码的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员，LEKTI前体包含一个信号肽和彼此隔开的15个丝氨酸蛋白酶抑制域(D1-D15)，表达后迅速被弗林蛋白酶水解为几个蛋白片段，其中包含D6-D9抑制域的LEKTI能抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、KLK5和KLK7等酶的活性。LEKTI的内源靶至少包括KLK5、KLK7和KLK14，它们共同参与皮肤的脱屑过程。在AD病人，LEKTI表达水平严重降低，导致了KLK7活性的异常升高。

尽管LEKTI是表皮内KLK7的天然抑制剂，但作为治疗AD的外用药，其不能透过皮肤角质层，同时由于其大分子蛋白质的特性也会导致其降解速度过快，因而将LEKTI作为外用药作用非常有限。并且，到目前为止，还没有一种有效的KLK7小分子抑制剂应用于临床。因此，如果能得到作为皮肤外用药的KLK7的小分子抑制剂，将有助于AD的治疗。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种激肽释放酶7小分子抑制剂及其制备方法与用途，其作为小分子抑制剂能有效抑制KLK7，具有应用于制备特应性皮炎的治疗药物的前景。

本发明通过以KLK7作为靶分子，根据KLK7的晶体结构，以及药效团模型进行分析与筛选，合成出具有KLK7抑制作用的小分子化合物，经实验验证，该化合物具有显著的抑制KLK7作用。

基于上述目的本发明提供的激肽释放酶7小分子抑制剂的化合物结构由式(I)表示：

基于相同的发明构思，本发明还提供了激肽释放酶7小分子抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1)化合物(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾混合后，回流反应3-4小时，过柱分离得化合物(Ⅲ)；

步骤2)化合物(Ⅲ)与二苯醚混合，升温至110-130℃，光照下通入氯气，控制反应温度160-180℃，冷却至80-100℃，加入磷酸锌，再加入水及5-20％(质量分数)的纯碱溶液，回流1-3小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)；

步骤3)化合物(Ⅳ)、40-80％(质量分数)水合肼溶液、乙醇混合后，回流反应8-12小时，过柱分离得化合物(Ⅴ)；

步骤4)化合物(Ⅴ)、中间体化合物(Ⅵ)、甲苯、碳酸钾，回流反应3-5小时后，过柱分离得化合物(I)。

优选地，步骤1)中所述的化合物(Ⅱ)、1-氯丙烷、碳酸钾、甲苯的摩尔比为0.5～2:0.9～1.3:0.5～2:8～12。

优选地，步骤2)中所述的化合物(Ⅲ)、二苯醚、氯气、磷酸锌、水(不包括纯碱溶液所含的水)、纯碱的摩尔比为0.5～2:8～12:1.8～2.4:0.001～0.003:1.2～1.6:0.1～0.3。

优选地，步骤3)中所述的化合物(Ⅳ)、水合肼(折100％)、乙醇的摩尔比为1.0：1.5:10。

优选地，步骤4)中所述的化合物(Ⅴ)、中间体化合物(Ⅵ)、碳酸钾、甲苯的摩尔比为0.5～2:0.9～1.3:0.5～2:8～12。

优选地，所述中间体化合物(Ⅵ)的合成包括以下步骤：化合物(Ⅶ)、三苯基氯甲烷、氯仿、三乙胺混合，室温下搅拌反应，过柱分离得化合物(Ⅷ)；

化合物(Ⅷ)、对甲基苄氯、甲苯、碳酸钾混合，回流反应3-4小时，过

化合物(Ⅸ)与80％(质量分数)醋酸水溶液混合，加热回流1小时，加入5-20％(质量分数)氢氧化钠溶液，游离出化合物(X)，过柱分离得化合物(Ⅹ)；

化合物(Ⅹ)、乙醚、三乙胺混合，再滴加氯乙酰氯，室温反应，过柱分离得化合物(Ⅵ)。

基于相同的发明构思，本发明还提供了上述激肽释放酶7小分子抑制剂的应用，即将所述激肽释放酶7小分子抑制剂用于抑制激肽释放酶7的活性，制备治疗特应性皮炎的药物。

基于相同的发明构思，本发明还提供了一种治疗特应性皮炎的药物组合物，其中含有所述的激肽释放酶7小分子抑制剂作为有效成分。

优选地，上述药物组合物为外用膏剂或外用喷雾制剂。

从上面所述可以看出，本发明提供的激肽释放酶7小分子抑制剂及其制备方法与用途，该抑制剂为小分子抑制剂，避免了传统KLK7的天然抑制剂作为治疗AD的外用药时由于分子大而不能透过皮肤角质层、吸收慢降解快等问题，该小分子抑制剂合成方法简单，操作方便，吸收快，有效抑制KLK7，具有应用于临床特应性皮炎的治疗药物的制备前景。

附图说明

图1为本发明的实施例所涉及的激肽释放酶7小分子抑制剂的IC₅₀曲线拟合图；

图2为本发明的实施例所涉及的激肽释放酶7小分子抑制剂的核磁图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

实施例1：激肽释放酶7小分子抑制剂的制备

向反应瓶中加入2-甲基吲哚-3-乙酸(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾，回流反应4小时。其中，2-甲基吲哚-3-乙酸：1-氯丙烷：碳酸钾：甲苯＝1:1.2：1:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅲ)。随后，向反应瓶中加入化合物(Ⅲ)、二苯醚混合后，升温至110℃，打开光照，通入氯气，控制反应温度180℃，通完氯气后，冷却至80℃，加入磷酸锌，再加入水和重量浓度为20％的纯碱溶液，回流1小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)。其中，化合物(Ⅲ)：二苯醚：氯气：磷酸锌：水(不包括纯碱溶液中的水)：纯碱(100％)＝1.0:10.0:2.2:0.001:1.4:0.3(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅳ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅳ)，水合肼溶液，乙醇，回流反应8小时。其中，化合物(Ⅳ)：水合肼：乙醇＝1.0:1.5:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅴ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅴ)，化合物(Ⅵ)，甲苯，碳酸钾，回流反应3小时，化合物(Ⅴ)：化合物(Ⅵ)：碳酸钾：甲苯＝1.0:1.1:1.0:10.0(摩尔比)，过柱分离得化合物(I)。图2本发明的实施例所涉及的激肽释放酶7小分子抑制剂的核磁图。图2为本发明的实施例所涉及的激肽释放酶7小分子抑制剂的核磁图。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：7.15-8.78(m，9H，Ar-H)，4.81(s，2H，COCH₂N)，0.82(t，3H，NCH₂CH₂CH₃)，2.29(s，3H，Ph-CH₃)，1.15-4.74(m，16H，RCH₂R，1H，C₃CH)。

实施例2

向反应瓶中加入2-甲基吲哚-3-乙酸(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾，回流反应3小时。其中，2-甲基吲哚-3-乙酸：1-氯丙烷：碳酸钾：甲苯＝1:1:1:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅲ)。随后，向反应瓶中加入化合物(Ⅲ)、二苯醚混合后，升温至120℃，打开光照，通入氯气，控制反应温度170℃，通完氯气后，冷却至90℃，加入磷酸锌，再加入水和重量浓度为20％的纯碱溶液，回流2小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)。其中，化合物(Ⅲ)：二苯醚：氯气：磷酸锌：水(不包括纯碱溶液中的水)：纯碱(100％)＝1.0:10.0:2.2:0.001:1.4:0.3(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅳ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅳ)，水合肼，乙醇，回流反应9小时。其中，化合物(Ⅳ)：水合肼(：乙醇＝1.0:1.5:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅴ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅴ)，化合物(Ⅵ)，甲苯，碳酸钾，回流反应4小时，化合物(Ⅴ)：化合物(Ⅵ)：碳酸钾：甲苯＝1.0:1.1:1.0:10.0(摩尔比)，过柱分离得化合物(I)。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：7.15-8.78(m，9H，Ar-H)，4.81(s，2H，COCH₂N)，0.82(t，3H，NCH₂CH₂CH₃)，2.29(s，3H，Ph-CH₃)，1.15-4.74(m，16H，RCH₂R，1H，C₃CH)。

实施例3

向反应瓶中加入2-甲基吲哚-3-乙酸(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾，回流反应4小时。其中，2-甲基吲哚-3-乙酸：1-氯丙烷：碳酸钾：甲苯＝1:1.3:1.5:11(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅲ)。随后，向反应瓶中加入化合物(Ⅲ)、二苯醚混合后，升温至130℃，打开光照，通入氯气，控制反应温度180℃，通完氯气后，冷却至100℃，加入磷酸锌，再加入水和重量浓度为20％的纯碱溶液，回流1小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)。其中，化合物(Ⅲ)：二苯醚：氯气：磷酸锌：水(不包括纯碱溶液中的水)：纯碱(100％)＝1.0:10.0:2.2:0.001:1.4:0.3(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅳ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅳ)，水合肼，乙醇，回流反应8-小时。其中，化合物(Ⅳ)：水合肼：乙醇＝1.0:1.5:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅴ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅴ)，化合物(Ⅵ)，甲苯，碳酸钾，回流反应5小时，化合物(Ⅴ)：化合物(Ⅵ)：碳酸钾：甲苯＝1.0:1.1:1.0:10.0(摩尔比)，过柱分离得化合物(I)。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：7.15-8.78(m，9H，Ar-H)，4.81(s，2H，COCH₂N)，0.82(t，3H，NCH₂CH₂CH₃)，2.29(s，3H，Ph-CH₃)，1.15-4.74(m，16H，RCH₂R，1H，C₃CH)。

实施例4

向反应瓶中加入2-甲基吲哚-3-乙酸(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾，回流反应3.5小时。其中，2-甲基吲哚-3-乙酸：1-氯丙烷：碳酸钾：甲苯＝1:1:1:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅲ)。随后，向反应瓶中加入化合物(Ⅲ)、二苯醚混合后，升温至110℃，打开光照，通入氯气，控制反应温度180℃，通完氯气后，冷却至80℃，加入磷酸锌，再加入水和重量浓度为20％的纯碱溶液，回流1小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)。其中，化合物(Ⅲ)：二苯醚：氯气：磷酸锌：水(不包括纯碱溶液中的水)：纯碱(100％)＝1.0:10.0:2.2:0.001:1.4:0.3(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅳ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅳ)，水合肼，乙醇，回流反应8小时。其中，化合物(Ⅳ)：水合肼：乙醇＝1.0:1.5:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅴ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅴ)，化合物(Ⅵ)，甲苯，碳酸钾，回流反应5小时，化合物(Ⅴ)：化合物(Ⅵ)：碳酸钾：甲苯＝0.5:0.9:0.7:9(摩尔比)，过柱分离得化合物(I)。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：7.15-8.78(m，9H，Ar-H)，4.81(s，2H，COCH₂N)，0.82(t，3H，NCH₂CH₂CH₃)，2.29(s，3H，Ph-CH₃)，1.15-4.74(m，16H，RCH₂R，1H，C₃CH)。

实施例5

向反应瓶中加入2-甲基吲哚-3-乙酸(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾，回流反应3小时。其中，2-甲基吲哚-3-乙酸：1-氯丙烷：碳酸钾：甲苯＝1:0.9:1:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅲ)。随后，向反应瓶中加入化合物(Ⅲ)、二苯醚混合后，升温至110℃，打开光照，通入氯气，控制反应温度160℃，通完氯气后，冷却至80℃，加入磷酸锌，再加入水和重量浓度为20％的纯碱溶液，回流1小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)。其中，化合物(Ⅲ)：二苯醚：氯气：磷酸锌：水(不包括纯碱溶液中的水)：纯碱(100％)＝0.8:9:1.8:0.002:1.5:0.2(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅳ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅳ)，水合肼，乙醇，回流反应10小时。其中，化合物(Ⅳ)：水合肼：乙醇＝1.0:1.5:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅴ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅴ)，化合物(Ⅵ)，甲苯，碳酸钾，回流反应3.5小时，化合物(Ⅴ)：化合物(Ⅵ)：碳酸钾：甲苯＝1.0:1.1:1.0:10.0(摩尔比)，过柱分离得化合物(I)。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：7.15-8.78(m，9H，Ar-H)，4.81(s，2H，COCH₂N)，0.82(t，3H，NCH₂CH₂CH₃)，2.29(s，3H，Ph-CH₃)，1.15-4.74(m，16H，RCH₂R，1H，C₃CH)。

实施例6：中间体化合物(Ⅵ)的合成

向反应瓶中加入化合物(Ⅶ)、三苯基氯甲烷、氯仿、三乙胺、室温下搅拌反应，过柱分离得化合物(Ⅷ)。其中，化合物(Ⅶ)：三苯基氯甲烷：三乙胺：氯仿＝1.0:1.2:1.2:10.0(摩尔比)。

向反应瓶中加入化合物(Ⅷ)、对甲基苄氯、甲苯、碳酸钾，回流反应3-4小时。其中，化合物(Ⅷ)：对甲基苄氯：碳酸钾：甲苯＝1.0:1.2:1.0:10.0(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅸ)。

向反应瓶中加入化合物(Ⅸ)及80％醋酸水溶液，加热回流1小时，加入氢氧化钠溶液，游离出碱性化合物，过柱分离得化合物(Ⅹ)。其中，化合物(Ⅸ)：醋酸(折100％)＝1.0:10.0(摩尔比)。

向反应瓶中加入化合物(Ⅸ)、乙醚、三乙胺，再滴加氯乙酰氯，室温反应2小时。其中，化合物(Ⅵ)：乙醚：三乙胺：氯乙酰氯＝1:5:1.2:1(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅵ)。

实施例7：激肽释放酶7小分子抑制剂的制备

向反应瓶中加入化合物(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾，回流反应4小时。其中，化合物(Ⅱ)：1-氯丙烷：碳酸钾：甲苯＝1:1.2:1:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅲ)。随后，向反应瓶中加入化合物(Ⅲ)、二苯醚混合后，升温至110℃，打开光照，通入氯气，控制反应温度180℃，通完氯气后，冷却至80℃，加入磷酸锌，再加入水和20％(质量分数)的纯碱溶液，回流1小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)。其中，化合物(Ⅲ)：二苯醚：氯气：磷酸锌：水(不包括纯碱溶液中的水)：纯碱(100％)＝1.0:10.0:2.2:0.001:1.4:0.3(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅳ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅳ)，40％(质量分数)的水合肼溶液，乙醇，回流反应8小时。其中，化合物(Ⅳ)：水合肼(折100％)：乙醇＝1.0:1.5:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅴ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅴ)，化合物(Ⅵ)，甲苯，碳酸钾，回流反应3小时，化合物(Ⅴ)：化合物(Ⅵ)：碳酸钾：甲苯＝1.0:1.1:1.0:10.0(摩尔比)，过柱分离得化合物(I)。图2为本发明的实施例所涉及的激肽释放酶7小分子抑制剂的核磁图。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：7.15-8.78(m，9H，Ar-H)，4.81(s，2H，COCH₂N)，0.82(t，3H，NCH₂CH₂CH₃)，2.29(s，3H，Ph-CH₃)，1.15-4.74(m，16H，RCH₂R，1H，C₃CH)。

实施例8

向反应瓶中加入化合物(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾，回流反应3小时。其中，化合物(Ⅱ)：1-氯丙烷：碳酸钾：甲苯＝1:1:1:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅲ)。随后，向反应瓶中加入化合物(Ⅲ)、二苯醚混合后，升温至120℃，打开光照，通入氯气，控制反应温度170℃，通完氯气后，冷却至90℃，加入磷酸锌，再加入水和20％(质量分数)的纯碱溶液，回流2小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)。其中，化合物(Ⅲ)：二苯醚：氯气：磷酸锌：水(不包括纯碱溶液中的水)：纯碱(100％)＝1.0:10.0:2.2:0.001:1.4:0.3(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅳ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅳ)，50％(质量分数)水合肼溶液，乙醇，回流反应9小时。其中，化合物(Ⅳ)：水合肼(折100％)：乙醇＝1.0:1.5:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅴ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅴ)，化合物(Ⅵ)，甲苯，碳酸钾，回流反应4小时，化合物(Ⅴ)：化合物(Ⅵ)：碳酸钾：甲苯＝1.0:1.1:1.0:10.0(摩尔比)，过柱分离得化合物(I)。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：7.15-8.78(m，9H，Ar-H)，4.81(s，2H，COCH₂N)，0.82(t，3H，NCH₂CH₂CH₃)，2.29(s，3H，Ph-CH₃)，1.15-4.74(m，16H，RCH₂R，1H，C₃CH)。

实施例9

向反应瓶中加入化合物(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾，回流反应4小时。其中，化合物(Ⅱ)：1-氯丙烷：碳酸钾：甲苯＝1:1.3:1.5:11(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅲ)。随后，向反应瓶中加入化合物(Ⅲ)、二苯醚混合后，升温至130℃，打开光照，通入氯气，控制反应温度180℃，通完氯气后，冷却至100℃，加入磷酸锌，再加入水和20％(质量分数)的纯碱溶液，回流1小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)。其中，化合物(Ⅲ)：二苯醚：氯气：磷酸锌：水(不包括纯碱溶液中的水)：纯碱(100％)＝1.0:10.0:2.2:0.001:1.4:0.3(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅳ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅳ)，60％(质量分数)水合肼溶液，乙醇，回流反应8小时。其中，化合物(Ⅳ)：水合肼(折100％)：乙醇＝1.0:1.5:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅴ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅴ)，化合物(Ⅵ)，甲苯，碳酸钾，回流反应5小时，化合物(Ⅴ)：化合物(Ⅵ)：碳酸钾：甲苯＝1.0:1.1:1.0:10.0(摩尔比)，过柱分离得化合物(I)。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：7.15-8.78(m，9H，Ar-H)，4.81(s，2H，COCH₂N)，0.82(t，3H，NCH₂CH₂CH₃)，2.29(s，3H，Ph-CH₃)，1.15-4.74(m，16H，RCH₂R，1H，C₃CH)。

实施例10

向反应瓶中加入化合物(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾，回流反应3.5小时。其中，化合物(Ⅱ)：1-氯丙烷：碳酸钾：甲苯＝1:1:1:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅲ)。随后，向反应瓶中加入化合物(Ⅲ)、二苯醚混合后，升温至110℃，打开光照，通入氯气，控制反应温度180℃，通完氯气后，冷却至80℃，加入磷酸锌，再加入水和20％(质量分数)的纯碱溶液，回流1小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)。其中，化合物(Ⅲ)：二苯醚：氯气：磷酸锌：水(不包括纯碱溶液中的水)：纯碱(100％)＝1.0:10.0:2.2:0.001:1.4:0.3(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅳ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅳ)，40％(质量分数)水合肼溶液，乙醇，回流反应8小时。其中，化合物(Ⅳ)：水合肼(折100％)：乙醇＝1.0:1.5:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅴ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅴ)，化合物(Ⅵ)，甲苯，碳酸钾，回流反应5小时，化合物(Ⅴ)：化合物(Ⅵ)：碳酸钾：甲苯＝0.5:0.9:0.7:9(摩尔比)，过柱分离得化合物(I)。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：7.15-8.78(m，9H，Ar-H)，4.81(s，2H，COCH₂N)，0.82(t，3H，NCH₂CH₂CH₃)，2.29(s，3H，Ph-CH₃)，1.15-4.74(m，16H，RCH₂R，1H，C₃CH)。

实施例11

向反应瓶中加入化合物(Ⅱ)、1-氯丙烷、甲苯、碳酸钾，回流反应3小时。其中，化合物(Ⅱ)：1-氯丙烷：碳酸钾：甲苯＝1:0.9:1:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅲ)。随后，向反应瓶中加入化合物(Ⅲ)、二苯醚混合后，升温至110℃，打开光照，通入氯气，控制反应温度160℃，通完氯气后，冷却至80℃，加入磷酸锌，再加入水和20％(质量分数)的纯碱溶液，回流1小时，过柱分离得化合物(Ⅳ)。其中，化合物(Ⅲ)：二苯醚：氯气：磷酸锌：水(不包括纯碱溶液中的水)：纯碱(100％)＝0.8:9:1.8:0.002:1.5:0.2(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅳ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅳ)，40％(质量分数)水合肼溶液，乙醇，回流反应10小时。其中，化合物(Ⅳ)：水合肼(折100％)：乙醇＝1.0:1.5:10(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅴ)。向反应瓶中加入化合物(Ⅴ)，化合物(Ⅵ)，甲苯，碳酸钾，回流反应3.5小时，化合物(Ⅴ)：化合物(Ⅵ)：碳酸钾：甲苯＝1.0:1.1:1.0:10.0(摩尔比)，过柱分离得化合物(I)。

¹H NMR[(CD₃)₂SO，500MHz]，δ(ppm)：7.15-8.78(m，9H，Ar-H)，4.81(s，2H，COCH₂N)，0.82(t，3H，NCH₂CH₂CH₃)，2.29(s，3H，Ph-CH₃)，1.15-4.74(m，16H，RCH₂R，1H，C₃CH)。

实施例12：中间体化合物(Ⅵ)的合成

向反应瓶中加入化合物(Ⅶ)、三苯基氯甲烷、氯仿、三乙胺、室温下搅拌反应，过柱分离得化合物(Ⅷ)。其中，化合物(Ⅶ)：三苯基氯甲烷：三乙胺：氯仿＝1.0:1.2:1.2:10.0(摩尔比)。

向反应瓶中加入化合物(Ⅷ)、对甲基苄氯、甲苯、碳酸钾，回流反应3-4小时。其中，化合物(Ⅷ)：对甲基苄氯：碳酸钾：甲苯＝1.0:1.2:1.0:10.0(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅸ)。

向反应瓶中加入化合物(Ⅸ)及80％(质量分数)醋酸水溶液，加热回流1小时，加入5-20％(质量分数)氢氧化钠溶液游离出化合物(X)，过柱分离得化合物(Ⅹ)。其中，化合物(Ⅸ)：醋酸(折100％)＝1.0:10.0(摩尔比)。

向反应瓶中加入化合物(X)、乙醚、三乙胺，再滴加氯乙酰氯，室温反应2小时。其中，化合物(X)：乙醚：三乙胺：氯乙酰氯＝1:5:1.2:1(摩尔比)，过柱分离得化合物(Ⅵ)。

实施例13：激肽释放酶7小分子抑制剂对KLK7的抑制效果分析

KLK7分别与200μM和50μM的激肽释放酶7小分子抑制剂作用15分钟，然后加入KLK7的荧光底物MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH2，并作用15分钟，测酶活性，计算抑制率，抑制率＝(1-a/b)×100％，其中，a为待测样品的酶活，b为阴性对照的酶活。

1.配制激肽释放酶7小分子抑制剂溶液

1)将上述实施例1-5和实施例7-11合成的激肽释放酶7小分子抑制剂按顺序放好并编号；

2)对抑制剂粉末采用高精度天平称取0.5-1mg；

3)根据各个分子称取的质量及其分子量计算需要加入溶剂的体积，使最终浓度为5mM；

4)采用高纯度DMSO(>99％)将各个抑制剂分子溶解使最终浓度为5mM，放入-20℃冰箱储存。

2.激肽释放酶7小分子抑制剂对KLK7的抑制效果分析

实验总体积100μL，其中KLK7最终浓度5nM，底物最终浓度为30μM，其中DMSO最终浓度不超过3％(v/v)，荧光底物的浓度为4.5mM。

抑制剂、酶和底物作用的顺序为：

1)在KLK7活性buffer中让酶和抑制剂分子在37℃作用15分钟。

2)15min后加入适量底物，随后在37℃下测KLK7的活性15分钟，与不含抑制剂分子的阴性样本对照，计算抑制率＝(1-a/b)×100％，a为待测样品的酶活，b为阴性对照的酶活。

其中，KLK7激活buffer是经0.6057g Tris，0.11098g CaCl₂，0.8775g NaCl，0.05g Brij-35，10mL ddH₂0溶解，再定容至100mL，调节pH 7.5配制而成。

所述KLK7活性buffer是经0.6057g Tris，0.585g NaCl，10mL ddH₂0溶解，再定容至100mL，调节pH 8.5配制而成。

3.抑制剂浓度为200μM和50μM时的抑制率：

1)200μM浓度下实施例1-5和实施例7-11制备的激肽释放酶7小分子抑制剂对KLK7抑制效率均为100％；

2)将化合物(I)的反应浓度降低至50μM，检测在50μM浓度时，实施例1-5和实施例7-11制备的激肽释放酶7小分子抑制剂对KLK7的抑制效率分别为53.68％。

实施例14：激肽释放酶7小分子抑制剂的IC₅₀的测定

将实施例7合成的激肽释放酶7小分子抑制剂设置成6.5、12.5、25、50、100和200μ/mol等6个浓度梯度，分别与KLK7作用15分钟，然后加入KLK7的荧光底物MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH₂，并作用15分钟，测酶活性。如图1所示，得到该化合物的IC₅₀为36.078。

化合物(I)检测数据

可见，本发明提供的激肽释放酶7小分子抑制剂及其制备方法与用途，该抑制剂为小分子抑制剂，有效避免了传统KLK7的天然抑制剂作为治疗AD的外用药时由于分子大而不能透过皮肤角质层、吸收慢降解快等问题，该小分子抑制剂合成方法简单，操作方便，吸收快，有效抑制KLK7，具有应用于临床特应性皮炎的治疗药物的制备前景。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。