本发明涉及微流控芯片技术、纳米电纺丝技术、高分子材料科学、及其细胞学等技术领域，特别提供了一种集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法。
背景技术：
微流控芯片技术是近几年发展起来的一种新兴技术，被誉为本世纪改变人类未来技术之一。是指把化学、生物等过程中的多个单元操作集成到一块微米尺度上的芯片上，自动完成整个过程。微流控芯片由于它在相关领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。
微流控芯片是通过微加工技术将微通道、微阀、微泵、微电极等具备不同功能的微器件集成在一起。不同功能的实现需要利用材料的不同特性，因此芯片材料对于微流控芯片的构建起着关键作用。芯片制备的材料主要用硅片、玻璃、石英、高聚物材料等。高聚物材料种类多，加工成型方便，价格低廉已经成为应用最广泛的一类芯片制备材料。其中聚二甲基硅氧烷(PDMS)用途最广，尤其是其具有良好的透气性，适用于芯片细胞培养、药物筛选、药效评价、动物替代等。
然而此类芯片由于其采用的是平面结构，因此该类芯片在细胞培养等方面只能用于二维细胞的培养，其细胞的表面状态，生理功能，对药物的敏感性等均与实际体系存在很大偏差，因此迫切需要能反应真实生理体系 的细胞培养系统。
纳米电纺丝具有很高的比表面积，多孔结构以及各种制备材料的表面化学性质等已经在生物学领域展现出广泛的应用前景。其应用领域主要包括以下几个方面：1、电纺丝作为细胞的三维培养的基质，来对细胞三维环境中的行为进行研究；2、电纺丝作为药物或基因载体，进行细胞药物筛选或外源基因转染研究；3、电纺丝作为一种体内支架，促进受损组织的修复；4、利用电纺丝在体外重建组织器官。纳米电纺丝技术已经成为组织工程及再生医学发展的一个极具潜力研究平台。然而由于纳米电纺丝与微流控芯片结合方面存在技术难点，灵活方便的纳米电纺丝与微流控芯片集成文章尚未见报道。
人们迫切希望获得一种技术效果优良的集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种技术效果优良的集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法。要求其适合能模拟细胞体内培养状态的集成纳米电纺丝微流控芯片的制备方法，该方法解决了传统电纺丝与微流体通道集成的难题，为细胞生物和药物筛选等研究领域等研究领域提供了一个新的平台。
本发明提供了一种集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：
(1)采用干净的基体材料选定后，将基体在匀胶仪上涂布一层光刻胶，并置于60～100℃热板上烘烤10～40分钟，制成基板；
(2)将涂有光刻胶的基板置于光刻机内，基板表面覆盖具有图型的掩膜，在紫外光下进行曝光，将图案转移到光刻胶上，形成聚合区域和未聚合区域；
(3)将涂有光刻胶的基板置于接通高压电源地线的铝块之上，注射器针头尖端磨平并接通高压电源的正极；采用注射泵推动注射器，使注射器中的高分子溶液匀速输出到注射器针头，在高压电场的作用下在基板的光刻胶层SU8表面形成纳米电纺丝；
(4)将带有电纺丝的基板置于50～90度烘箱内烘烤1～20分钟，未聚合区域的光刻胶层SU8热熔，体积增大，同时在电纺丝毛细作用下，包裹住电纺丝；
(5)取出基板，在曝光机内进行曝光，使未聚合区域的光刻胶层SU8完全聚合，以便制成区域化的电纺丝；
(6)将区域化电纺丝基板，浸泡到0.5％～2％的硅烷化试剂中，10～60分钟，用氮气吹干，用氧等离子体处理0.5～5分钟，备用；
(7)采用软光刻方法制备集成有微流控通道的微流控芯片PDMS，并采用氧等离子体处理1分钟，备用；
(8)将氧等离子体处理后的区域化的电纺丝基板和微流控芯片聚二甲基硅氧烷PDMS贴合在一起，并去除里面的气泡；聚二甲基硅氧烷PDMS为一种硅橡胶，具有良好的透气性，适合于细胞的培养；
(9)将其放在烘箱内，60°～90℃，0.5～2小时，使两者不可逆的键和在一起。
所述集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法还满足下述要求之一或其组合：
其一，基板材料具体为玻璃或高分子聚合物；
其二，光刻胶为一种环氧型光刻胶；
其三，步骤(1)采用干净的基体材料选定后，将基体在匀胶仪上涂布一层光刻胶，并置于80～90℃热板上烘烤15～25分钟，制成基板；
其四，步骤(2)的紫外曝光的条件为：曝光强度100～500mW/cm2，曝光时间为10～200s；
其五，步骤(4)中的烘烤温度为80～90℃，烘烤时间为2分钟；
其六，纳米电纺丝为无机材料或高分子材料；
其七，步骤(6)中采用的硅烷化试剂为氨基丙基三乙氧基甲硅烷APMTS。对光刻胶SU8进行修饰，使其用等离子处理后能够与微流控芯片聚二甲基硅氧烷PDMS键合为一体；
所述集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法，其特征在于：所述集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法中，所述纳米电纺丝的具体材料是下述几种之一：合成有机高分子材料(聚苯乙烯PS，聚乳酸羟基乙酸PLGA，聚乳酸PLLA)、天然高分子材料(如壳聚糖，蚕丝蛋白等)、掺杂与高聚物后可形成电纺丝的无机材料。
本发明所述集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法，可以实现多个流体通道的制备，从而实现不同浓度条件，进而实现细胞多参数的培养条件的 筛查，有效降低了筛查成本。
本发明提供的一种集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法，其优点在于：
1、通用性强，可对多种材料的纳米电纺丝与微流体通道集成；
2、生成通道内电纺丝的形状、尺寸、面积可控；
3、集成的电纺丝性质不受溶剂等方面的污染；
4、可以对通道内电纺丝进行化学性质的改性；
5、操作简单、快速、不需要昂贵的仪器设备。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1为集成纳米电纺丝微流控芯片制备流程图；
图2为多通道集成纳米电纺丝微流控芯片结构图；
图3为集成纳米电纺丝芯片用于细胞培养结构表征；
图4为集成纳米电纺丝芯片用于肿瘤药物的毒性评价。
具体实施方式
图1中，包括SU8涂布，曝光，电纺丝制备，电纺丝浸润，PDMS通道模块与电纺丝键合，集成芯片成品等过程；附图1中附图标记1-9的含义如下：1-SU8，2-基片，3-紫外光，4-掩模，5-交联SU8，6-电纺丝，7-PDMS，8-微流体通道，I-SU8涂布，II-曝光，III-电纺丝制备，IV-加热，电纺丝浸润，V-PDMS通道模块与电纺丝键合，VI-集成芯片成品；
图2中：图2下部的A为整个芯片的结构，芯片分为三层：上层为流体通道，用于添加细胞；中间为电纺丝层；下层为流体通道，用于流体添加；图2上部的B为放大的单元结构示意图；
图3：制备集成亲水的醋酸纤维素电纺丝微流控芯片，阵采用GFP标记的U87细胞进行细胞培养，荧光图像显示，细胞在此芯片上呈现典型的三维生长状态。
图4：将集成芯片用于肿瘤细胞培养，并采用通过添加不同浓度抗肿瘤药物，进行肿瘤药物疗效的评价，并于二维体系，进行对照。
实施例1
一种集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法，具体步骤如下：
(1)首先采用干净的基体材料选定后，将基体在匀胶仪上涂布一层光刻胶，并置于85°热板上烘烤20分钟，制成基板；基板的材料为玻璃和/或高分子聚合物；
(2)将涂有光刻胶的基板置于光刻机内，基板表面覆盖具有图型的掩膜，在紫外光下进行曝光，将图案转移到光刻胶上，形成聚合区域和未聚合区域；光刻胶为一种环氧型光刻胶SU8；紫外曝光的条件为：曝光强度100～500mW/cm2，曝光时间为10～200s；
(3)将涂有光刻胶的基板置于接通高压电源地线的铝块之上，注射器针头尖端磨平并接通高压电源的正极；采用注射泵推动注射器，使注射器中的高分子溶液匀速输出到注射器针头，在高压电场的作用下在基板的光刻胶层SU8表面形成纳米电纺丝；纳米电纺丝可以为无机材料也可以为高分子材料；
(4)将带有电纺丝的基板置于85℃烘箱内烘烤2分钟，未聚合区域的光刻胶层SU8热熔，体积增大，同时在电纺丝毛细作用下，包裹住电纺 丝；
(5)取出基板，在曝光机内进行曝光，使未聚合区域的光刻胶层SU8完全聚合，以便制成区域化的电纺丝；
(6)将区域化电纺丝基板，浸泡到0.5％～2％的硅烷化试剂中，30分钟，用氮气吹干，用氧等离子体处理1分钟，备用；采用的硅烷化试剂为氨基丙基三乙氧基甲硅烷APTES；对光刻胶SU8进行修饰，使其用等离子处理后能够与聚二甲基硅氧烷PDMS微流控芯片键合为一体；
(7)采用软光刻方法制备集成有微流控通道的微流控芯片PDMS，并采用氧等离子体处理1分钟，备用；
(8)将氧等离子体处理后的区域化的电纺丝基板和微流控芯片聚二甲基硅氧烷PDMS贴合在一起，并去除里面的气泡；PDMS为一种硅橡胶，具有良好的透气性，适合于细胞的培养；
(9)将其放在烘箱内，80℃，1小时，使两者不可逆的键和在一起。
所述集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法中，所述纳米电纺丝的具体材料是下述几种之一：合成有机高分子材料(聚苯乙烯PS，聚乳酸羟基乙酸PLGA，聚乳酸PLLA)、天然高分子材料(如壳聚糖，蚕丝蛋白等)、掺杂与高聚物后可形成电纺丝的无机材料。
本实施例所述集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法，可以实现多个流体通道的制备，从而实现不同浓度条件，进而实现细胞多参数的培养条件的筛查，明显降低了筛查成本。
本实施例提供的一种集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法，其优点在于：1、通用性强，可对多种材料的纳米电纺丝与微流体通道集成；
2、生成通道内电纺丝的形状、尺寸、面积可控；
3、集成的电纺丝性质不受溶剂等方面的污染；
4、可以对通道内电纺丝进行化学性质的改性；
5、操作简单、快速、不需要昂贵的仪器设备。
实施例2
一种集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法，具体步骤如下：
(1)首先采用干净的基体材料选定后，将基体在匀胶仪上涂布一层光刻胶，并置于80～90℃热板上烘烤15～20分钟，制成基板；基板的材料为玻璃和/或高分子聚合物；
(2)将涂有光刻胶的基板置于光刻机内，基板表面覆盖具有图型的掩膜，在紫外光下进行曝光，将图案转移到光刻胶上，形成聚合区域和未聚合区域；光刻胶为一种环氧型光刻胶SU8；紫外曝光的条件为：曝光强°100～500mW/cm2，曝光时间为10～200s；
(3)将涂有光刻胶的基板置于接通高压电源地线的铝块之上，注射器针头尖端磨平并接通高压电源的正极；采用注射泵推动注射器，使注射器中的高分子溶液匀速输出到注射器针头，在高压电场的作用下在基板的光刻胶层SU8表面形成纳米电纺丝；纳米电纺丝可以为无机材料也可以为高分子材料；
(4)将带有电纺丝的基板置于80～90℃烘箱内烘烤1～5分钟，未 聚合区域的光刻胶层SU8热熔，体积增大，同时在电纺丝毛细作用下，包裹住电纺丝；
(5)取出基板，在曝光机内进行曝光，使未聚合区域的光刻胶层SU8完全聚合，以便制成区域化的电纺丝；
(6)将区域化电纺丝基板，浸泡到0.5％～2％的硅烷化试剂中，30分钟，用氮气吹干，用氧等离子体处理1分钟，备用；采用的硅烷化试剂为氨基丙基三乙氧基甲硅烷APTES；对光刻胶SU8进行修饰，使其用等离子处理后能够与微流控芯片聚二甲基硅氧烷PDMS键合为一体；
(7)采用软光刻方法制备集成有微流控通道的微流控芯片PDMS，并采用氧等离子体处理1分钟，备用；
(8)将氧等离子体处理后的区域化的电纺丝基板和PDMS贴合在一起，并去除里面的气泡；PDMS为一种硅橡胶，具有良好的透气性，适合于细胞的培养；
(9)将其放在烘箱内，80℃，1小时，使两者不可逆的键和在一起。
所述集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法中，所述纳米电纺丝的具体材料是下述几种之一：合成有机高分子材料(聚苯乙烯PS，聚乳酸羟基乙酸PLGA，聚乳酸PLLA)、天然高分子材料(如壳聚糖，蚕丝蛋白等)、掺杂与高聚物后可形成电纺丝的无机材料。
实施例3
一种集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法，具体步骤如下：
(1)首先采用干净的基体材料选定后，将基体在匀胶仪上涂布一层光 刻胶，并置于60～100℃热板上烘烤10～40分钟，制成基板；基板的材料为玻璃和/或高分子聚合物；
(2)将涂有光刻胶的基板置于光刻机内，基板表面覆盖具有图型的掩膜，在紫外光下进行曝光，将图案转移到光刻胶上，形成聚合区域和未聚合区域；光刻胶为一种环氧型光刻胶SU8；紫外曝光的条件为：曝光强度100～500mW/cm2，曝光时间为10～200s；
(3)将涂有光刻胶的基板置于接通高压电源地线的铝块之上，注射器针头尖端磨平并接通高压电源的正极；采用注射泵推动注射器，使注射器中的高分子溶液匀速输出到注射器针头，在高压电场的作用下在基板的光刻胶层SU8表面形成纳米电纺丝；纳米电纺丝可以为无机材料也可以为高分子材料；
(4)将带有电纺丝的基板置于50～90℃烘箱内烘烤1～20分钟，未聚合区域的光刻胶层SU8热熔，体积增大，同时在电纺丝毛细作用下，包裹住电纺丝；
(5)取出基板，在曝光机内进行曝光，使未聚合区域的光刻胶层SU8完全聚合，以便制成区域化的电纺丝；
(6)(6)将区域化电纺丝基板，浸泡到0.5％～2％的硅烷化试剂中，10～60分钟，用氮气吹干，用氧等离子体处理0.5～5分钟，备用；采用的硅烷化试剂为氨基丙基三乙氧基甲硅烷APTES；对光刻胶SU8进行修饰，使其用等离子处理后能够与微流控芯片PDMS键合为一体；
(7)采用软光刻方法制备集成有微流控通道的微流控芯片PDMS，并采用氧等离子体处理1分钟，备用；
(8)将氧等离子体处理后的区域化的电纺丝基板和PDMS贴合在一起，并去除里面的气泡；PDMS为一种硅橡胶，具有良好的透气性，适合于细胞的培养；
(9)将其放在烘箱内，60～90℃，0.5～2小时，使两者不可逆的键和在一起。
所述集成纳米电纺丝微流控芯片制备方法中，所述纳米电纺丝的具体材料是下述几种之一：合成有机高分子材料(聚苯乙烯PS，聚乳酸羟基乙酸PLGA，聚乳酸PLLA)、天然高分子材料(如壳聚糖，蚕丝蛋白等)、掺杂与高聚物后可形成电纺丝的无机材料。
实施例4
集成纳米电纺丝微流控芯片制备流程。按照图1所示流程进行首先纳米电纺丝区域化，如采用干净的基体材料玻璃或高分子聚合物，在匀胶仪上涂布一层SU8光刻胶后，并置于95度热板上15分钟；将曝光掩膜放于涂有SU8基板上，在紫外等下进行曝光，使SU8形成交联区域和未交联区域；随后将SU8的基板置于电纺丝装置内，在高压电场的作用下在基板表面形成纳米电纺丝；带有电纺丝的基板置于95度热板上，加热2分钟，是SU8未固化的电纺丝进入到SU8内部，便制成区域化的电纺丝；随后将其置于2％的AMPTS溶液中1小时，氮气吹干，备用；同时采用软光刻的方法制备聚二甲基硅氧烷PDMS通道；将用氨基丙基三乙氧基甲硅烷APTES处理后的电纺丝阵列与聚二甲基硅氧烷PDMS一起进行等离子体处理1分钟，然后键合在一起，行程密闭微流体通道。整个过程如图1所示。
实施例5
采用实施例1-4其中之一的方法制备相应的微流控芯片；通过设计具有不同的图案，采用光刻方法按照图1所示流程进行电纺丝的区域化，并与多个流通通道封接在一起，从而制备多通道集成纳米电纺丝微流控芯片，多通道集成芯片结构如图2所示。
实施例6
采用集成纳米电纺丝微流控芯片用于细胞的三维培养。采用实施例中1中提到的方法，制备集成亲水的醋酸纤维素电纺丝微流控芯片，阵采用GFP标记的U87细胞进行细胞的三维培养。从图3细胞生长曲线，可以看出细胞在区域化电纺丝上能够长时间生长。采用多个通道，进行抗肿瘤药物药效评价，采用抗肿瘤药物5-FU，细胞采用GFP标记的U87细胞，细胞分别在细胞培养皿和集成纳米电纺丝微流控芯片内培养后，加入不同浓度药物48小时后，进行荧光拍照，并进行细胞死活数量统计，荧光图及统计结构，如图4所示，从该结果可以看出，细胞在集成芯片的抗药性增强，跟体内肿瘤细胞对抗肿瘤药物的反应具有一致性。