一种麦麸酯酶测定装置及其制备装置的制作方法

本实用新型涉及酶的固定化领域，具体为一种麦麸酯酶测定装置及其制备装置。本实用新型的麦麸酯酶测定装置能够用于农药残留的检测，且具有较高的酶活回收率，具有较好的应用前景。

背景技术：

麦麸酯酶作为植物酯酶(plant esterase,PE)中的一种，属于羧酸酯水解酶类。由于麦麸酯酶的活性能被有机磷和氨基甲酸酯类农药所抑制，因而其可用于快速测定果蔬中有机磷农药和氨基甲酸酯农药的残留。与化学催化剂相比，麦麸酯酶作为一类具有催化功能的蛋白质，其具有反应速度快、反应条件温和、底物专一性强，可在水溶液和中性pH下操作等优点。但其也存在一些不足，如酶一旦从细胞中分离出来，其活性会迅速下降；由于酶是溶于水的，在水溶液中进行反应，会导致酶和底物、产物从水中分离困难，不利于循环使用。

固定化技术的出现彻底解决了前述问题，不仅提高了酶的活性，而且还实现了酶的可重复使用性。酶的固定化一般是指将水溶性的酶固定在水不溶性载体上，使其依然具有催化活性并可回收和重复使用的不溶于水的酶的衍生物。其方法可初步归纳为四类，即吸附、结合、包埋和交联；这些原始方法组合已经形成了数百种方法。

目前，对于麦麸酯酶的固定化主要集中于交联法和吸附法。其中，交联法反应较剧烈，常常引起酶蛋白的高级结构发生变化，并导致活性中心受到破坏，从而难于保证每次都能制得高活力的样品。吸附法具有操作简便，条件温和，不会引起酶的变异失活，且载体价廉易得，可反复使用等优点，被越来越多的学者所采用。现有麦麸酯酶的吸附固定通常选用交换树脂、滤纸等作为吸附载体，吸附效率较低。

为此，迫切需要一种新的装置，以解决上述问题。

技术实现要素：

本实用新型的发明目的在于：针对现有麦麸酯酶的吸附固定通常选用交换树脂、滤纸作为吸附载体，载体单一，酶活回收率较低的问题，提供一种麦麸酯酶测定装置及其制备装置。本实用新型打破了现有传统的麦麸酯酶采用树脂、滤纸吸附固定化的方式，具有设计合理，结构简单，体积小，重量轻，便于携带，酶活回收率高等优点。本实用新型能够用于果蔬中有机磷农药和氨基甲酸酯农药残留的检测及相关研究，测定结果准确、可靠、精度高，能够满足工业化、大规模应用的需求，具有较好的应用前景。

为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：

一种麦麸酯酶测定装置，包括固定化载体膜、设置在固定化载体膜上的麦麸酯酶层，所述固定化载体膜为玻璃纤维素膜，所述固定化载体膜为圆形、椭圆形或多边形。

所述麦麸酯酶层是将麦麸酯酶酶液吸附于固定化载体膜上，然后通过干燥，形成的麦麸酯酶层。

所述固定化载体膜为矩形。

所述固定化载体膜的长、宽分别为0.1～5cm、0.1～5cm。

所述固定化载体膜的规格为1cm×1cm。

用于前述装置的制备装置，包括：

盛放容器，其用于盛放麦麸酯酶酶液，并提供反应空间；

固定化载体膜，其用作麦麸酯酶的载体，并被放置于盛放容器内；

干燥设备，其用于对吸附麦麸酯酶酶液的固定化载体膜进行干燥。

所述盛放容器为烧杯。

所述固定化载体膜为玻璃纤维素膜。

所述干燥设备为干燥板，吸附麦麸酯酶酶液的固定化载体膜经水洗去表面残渣后能在干燥板上自然晾干。

所述干燥设备包括玻璃板、超净工作台，吸附麦麸酯酶酶液的固定化载体膜经水洗去表面残渣后能置于玻璃板上，所述超净工作台的排风扇能对玻璃板上的固定化载体膜进行排风干燥。

还包括恒温加热装置，其能够对盛放容器中的麦麸酯酶酶液进行恒温加热。

针对前述问题，本实用新型提供一种麦麸酯酶测定装置及其制备装置。针对现有麦麸酯酶的吸附固定通常选用交换树脂、滤纸作为吸附载体，回收率较低的问题，本实用新型提供一种新的麦麸酯酶测定装置，其包括固定化载体膜、设置在固定化载体膜上的麦麸酯酶层，固定化载体膜为玻璃纤维素膜，固定化载体膜为圆形、椭圆形、多边形。其中，麦麸酯酶层是将麦麸酯酶酶液吸附于固定化载体膜上，然后通过干燥，形成的麦麸酯酶层。本实用新型中，以玻璃纤维素膜作为载体，然后将麦麸酯酶酶液吸附于固定化载体膜上，然后通过干燥，在玻璃纤维素膜表面形成麦麸酯酶层。本实用新型的玻璃纤维素膜呈化学惰性，具有较多的毛细纤维结构，能吸附比同等纤维素膜更多的水分，流速快，耐高温，可用于细微颗粒的采集，且不含有粘合剂；而本实用新型的测定装置能将酶吸附于玻璃纤维素膜上，且保留较高的活性，同时不需要单独的粘合剂，有效保证测定装置的活性。经过实际验证，本实用新型切实可行，能够用于果蔬中有机磷农药和氨基甲酸酯农药残留的检测，具有较好的效果。同时，本实用新型具有较高的吸附效率，应用前景较好。

作为优选，固定化载体膜为矩形。

进一步，本实用新型提供用于前述测定装置的制备装置，其包括盛放容器、固定化载体膜、干燥设备。其中，盛放容器用于盛放麦麸酯酶酶液，并提供反应空间；玻璃纤维素膜浸润于麦麸酯酶酶液中；麦麸酯酶液可以为麦麸酯酶粗提酶液用0.2mol/L pH值为7.0的磷酸氢钠盐缓冲液稀释4倍的酶液；干燥设备则用于对吸附麦麸酯酶酶液的固定化载体膜进行干燥。

本实用新型的制备装置工作时，酶液盛放于盛放容器中，将玻璃纤维素膜浸润于该酶液中，再将盛放容器置于水浴锅中29℃恒温静置水浴4h；然后，将处理后的玻璃纤维素膜片用超纯水洗去表面残渣，室温晾干备用，即得测定装置。

作为优选，干燥设备包括盛放膜片的玻璃板、超净工作台。将处理后的玻璃纤维素膜片置于玻璃板上，再将玻璃板置于超净工作台内，打开排风扇将膜片干燥，即得测定装置。

本实用新型将麦麸酯酶吸附固定于玻璃纤维素膜片上，同时不破坏麦麸酯酶的活性构象中心，固定化酶能保存较长的时间，且具有较高的酶活性，适用于酶抑制法快速检测农药残留的相关研究。同时，本实用新型的制备简单、操作方便，固定化方式柔和，对酶活的破坏程度较小，效率高。本实用新型技术方案设计合理，简单有效，打破了现有传统的麦麸酯酶采用树脂吸附固定化的方式，具有广阔的应用前景，值得大规模推广和应用。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本实用新型的有益效果是：

(1)本实用新型以麦麸酯酶为酶源，设计简单，生产成本低廉；

(2)麦麸酯酶可选用0.2mol/LpH7.0磷酸氢盐缓冲液稀释4倍，酶液体系较稳定；

(3)本实用新型以玻璃纤维素膜为载体吸附，操作简便，对酶的活性中心破坏较小，所制备的测定装置酶活性高，价格低廉，可生产性强，能够满足工业化、大规模应用的需求，具有较好的应用前景；

(4)本实用新型的干燥方式新颖，外界干扰较小，能够有效保证测定结果的准确性，具有较高的测定精度；

(5)本实用新型测定装置的体积小、重量轻、存储方便，便于携带。

附图说明

图1是本实用新型中测定装置在玻璃板上的结构示意图。

图2为实施例1制备装置的盛放容器工作的原理示意图。

图中标记：1为玻璃纤维素膜，2为麦麸酯酶酶液，3为盛放容器，4为固定化麦麸酯酶的膜片，5为玻璃板。

具体实施方式

下面结合附图，对本实用新型作详细的说明。

为了使本实用新型的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本实用新型进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。

实施例1

如图所示，本实用新型中用于麦麸酯酶测定装置的制备装置，包括盛放容器、固定化载体膜、干燥设备。本实施例中，盛放容器采用烧杯；固定化载体膜采用玻璃纤维素膜。作为优选，干燥设备包括玻璃板、超净工作台，吸附麦麸酯酶酶液的固定化载体膜经水洗去表面残渣后能置于玻璃板上，超净工作台的排风扇能对玻璃板上的固定化载体膜进行排风干燥。

采用前述制备装置固定化麦麸酯酶的过程如下。

(1)制备固定化载体膜

将玻璃纤维素膜裁剪为1cm×1cm规格大小，用超纯水洗去表面残渣，室温晾干备用。

(2)制备麦麸酯酶粗酶液

称取5g粉碎后的麦麸，加入25mL pH6.5的磷酸氢钠缓冲液配制的0.15mol/L NaNO₃提取液，搅拌均匀后置于35℃的水浴锅内水浴静置提取60min，纱布粗过滤后8000r/min冷冻离心5min，取上清液过滤，即得麦麸酯酶粗酶液。

(3)制备固定化麦麸酯酶液

取1mL麦麸酯酶粗酶液于烧杯中，加入3mL0.2mol/L pH7.0磷酸氢钠盐缓冲液，摇匀备用，得到固定化麦麸酯酶液。

(4)麦麸酯酶的固定化

向步骤(3)的烧杯中加入玻璃纤维素膜，然后将烧杯置于水浴锅中，在29℃水浴静置4h，完成麦麸酯酶的固定化。

(5)干燥

待固定化结束后，取出含有麦麸酯酶的玻璃纤维素膜，并置于玻璃板上。然后，将该玻璃板放入超净工作台，打开排风扇，将酶片风干，以此干燥固定化麦麸酯酶膜片，得到固定化麦麸酯酶的膜片，即麦麸酯酶测定装置。该固定化麦麸酯酶的膜片包括固定化载体膜、设置在固定化载体膜上的麦麸酯酶层。本实施例制备的固定化麦麸酯酶的膜片如图2所示。

(6)保存

将制备的固定化麦麸酯酶的膜片保存在干燥、避光、低温(2～8℃)环境中。

(7)固定化酶活回收率测定

取0.25mL稀释后的植物酯酶液，加入到4.25mLpH7.2的磷酸氢钠缓冲液中，加入0.25mLα-乙酸萘酯(浓度为8×10^-4mol/L)溶液，放入40℃恒温水浴5min，然后加入0.25mL4.25％SDS摇匀，之后加入0.25mL0.03％固兰B盐溶液摇匀显色，加入0.25mL1:1盐酸溶液摇匀有于535nm处读取吸光度值。以未加麦麸酯酶酶液的反应液作试剂空白，以吸光度值计算酶活大小。按照酶活习惯计算方法，将每分钟催化分解1μmo1α-乙酸萘酯所需的酶量定义为1U。计算公式如下：

$E=\frac{(b+k\×{\mathrm{OD}}_{535nm})\×V}{5\×V_0}\×N$

式中E——每毫升粗酶液酯酶活力，U/mL

N——酶液的稀释倍数

k——某一pH下α-萘酚的标准曲线的斜率

b——标准曲线截距

OD_535nm——反应后在波长535nm处测得的吸光度

V——反应体系总体积

V₀——测定酶活所用酶液体积

按照如上中酶活测定的方法，将游离态酶换为固定化酶膜片测定固定化酶活，将每分钟催化分解1μmo1α-乙酸萘酯所需的固定化酶量定义为1U。计算公式如下：

$E_0=\frac{(b+k\×{\mathrm{OD}}_{535nm})\×V}{5\×S}$

式中E₀——每平方厘米固定化膜片酯酶活力，U/cm²

k——某一pH下α-萘酚的标准曲线的斜率

b——标准曲线截距

OD_535nm——反应后在波长535nm处测得的吸光度

V——反应体系总体积

S——酶膜片面积，cm²

按以下公式计算酶活回收率：

当采用玻璃纤维素膜规格大小为1cm×1cm，酶液用0.2mol/L pH7.0磷酸氢钠盐缓冲液稀释4倍，固定化时间4h，固定化温度29℃，在此条件下测定的酶活回收率为27.51％。

(8)固定化酶检测农药残留

取固定化酶膜片(即步骤6制备的固定化麦麸酯酶的膜片)，加入到4.25mL不同浓度农药(0.2mol/LpH7.2磷酸缓冲液稀释)中，放置35℃水浴锅中恒温15min后，加入0.25mLα-乙酸萘酯溶液，40℃恒温水浴5min，然后加入0.25mL4.25％SDS摇匀，再加入0.25mL0.03％固兰B盐溶液摇匀，加入0.25mL1:20盐酸溶液摇匀后在535nm处读取OD值。空白组将4.25mL农药替换成4.25mL磷酸盐缓冲液(pH值为7.2)，用未加α-乙酸萘酯的反应液作空白对照，每组实验设置3次平行。

酶活抑制率计算公式：

式中：

A_未抑制：没有农药抑制时的吸光度值

A_抑制：某浓度农药抑制时的吸光度值

将每种农药均用甲醇配制成浓度为10mg/L的标准储备液，然后用pH7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释成2.00mg/L、1.00mg/L、0.50mg/L、0.25mg/L、0.10mg/L、0.005mg/L、的标准工作液。

在此条件下检测农药对固定化酶活的抑制率，1.00mg/L的敌敌畏和丁硫克百威对固定化酶的酶活抑制率分别为65.99％和64.06％。

以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。