启动子PdoeR及其在指导cry基因表达中的应用的制作方法

本发明涉及一种新的强启动子PdoeR，能指导苏云金芽胞杆菌cry基因表达，其表达效率与cry8E基因启动子(Porf1cry8E)相似。
背景技术：
：苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性菌，属于蜡样芽胞杆菌族(Bacilluscereusgroup，Bc)(Vilas‐BoasGT,PerucaAP,ArantesOM(2007)BiologyandtaxonomyofBacilluscereus,Bacillusanthracis,andBacillusthuringiensis.CanJMicrobiol53(6):673‐687doi:10.1139/W07‐029)。苏云金芽胞杆菌在形成芽胞的同时，也会产生具有杀虫活性的伴胞晶体(BravoA,LikivivatanavongS,GillSS,SoberónM(2011)Bacillusthuringiensis:Astoryofasuccessfulbioinsecticide.InsectBiochemistryandMolecularBiology41(7):423‐431doi:10.1016/j.ibmb.2011.02.006)。这些晶体主要成分是由cry或cyt基因编码的毒素蛋白，对包括鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目以及线虫等在内的多种昆虫都具有较高的杀虫活性(SchnepfE,CrickmoreN,VanRieJ,LereclusD,BaumJ,FeitelsonJ,ZeiglerDR,DeanDH(1998)Bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev62(3):775‐806)。Cry或Cyt毒素的种类多样性决定了苏云金芽胞杆菌对不同昆虫物种的杀虫特异性。基于Bt杀虫活性好、靶标特异性强、对环境友好等特点，苏云金芽胞杆菌已经作为生防制剂在全世界商业化使用，且占据了现今快速增长的微生物杀虫剂大约50％的市场份额(GerwickBC,SparksTC(2014)Naturalproductsforpestcontrol:ananalysisoftheirrole,valueandfuture.Pestmanagementscience70(8):1169‐1185doi:10.1002/ps.3744；LaceyLA,GrzywaczD,Shapiro‐IlanDI,FrutosR,BrownbridgeM,GoettelMS(2015)Insectpathogensasbiologicalcontrolagents:Backtothefuture.Journalofinvertebratepathology132:1‐41doi:10.1016/j.jip.2015.07.009)。Cry毒素和Cyt毒素的种类非常多，迄今为止，已经发现了825种cry和cyt基因(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。cry基因通常在细胞生长稳定期(stationaryphase)表达，蛋白在母细胞中积累并形成晶体内含物，其表达量非常高，能占细胞干重的20％到30％(SchnepfE,CrickmoreN,VanRieJ,LereclusD,BaumJ,FeitelsonJ,ZeiglerDR,DeanDH(1998)Bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev62(3):775‐806)。依据与芽胞形成的关系，cry基因可以分成两类：依赖芽胞形成的cry基因(sporulation‐dependentcrygenes)和不依赖芽胞形成的cry基因(sporulation‐independentcrygenes)(AgaisseH,LereclusD(1995)HowdoesBacillusthuringiensisproducesomuchinsecticidalcrystalprotein？Journalofbacteriology177(21):6027‐6032doi:10.1128/jb.177.21.6027‐6032.1995；KroosL,ZhangB,IchikawaH,YuYT(1999)ControlofsigmafactoractivityduringBacillussubtilissporulation.Molecularmicrobiology31(5):1285‐1294doi:10.1046/j.1365‐2958.1999.01214.x；SchnepfE,CrickmoreN,VanRieJ,LereclusD,BaumJ,FeitelsonJ,ZeiglerDR,DeanDH(1998)Bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev62(3):775‐806)。不依赖芽胞形成的cry基因中的典型的例子就是cry3Aa。cry3Aa受σA控制，在营养生长时期就有一定量的表达(AgaisseH,LereclusD(1994)StructuralandfunctionalanalysisofthepromoterregioninvolvedinfullexpressionofthecryIIIAtoxingeneofBacillusthuringiensis.MolecularMicrobiology13(1):97‐107doi:10.1111/j.1365‐2958.1994.tb00405.x；DesouzaMT,LecadetMM,LereclusD(1993)FullexpressionofthecryIIIAtoxingeneofBacillusthuringiensisrequiresadistantupstreamDNAsequenceaffectingtranscription.Journalofbacteriology175(10):2952‐2960)。而大部分的cry基因属于依赖芽胞形成的基因，在芽胞形成过程中转录水平较高，如cry1Aa,cry1Ba,cry1Ac,cry2Aa,cry4Aa,cry4Ba,cry11Aa,cry15Aa等(BravoA,AgaisseH,SalamitouS,LereclusD(1996)AnalysisofcryIAaexpressioninsigEandsigKmutantsofBacillusthuringiensis.Molecular&generalgenetics:MGG250(6):734‐741doi:10.1007/BF02172985；Brizzardetal.1991；Brown1993；Dervynetal.1995；Kroosetal.1999；Yoshisueetal.1993；Zhangetal.1998)。这些基因在母细胞中表达和积累，形成晶体。这是一个高度有序的细胞程序化过程，并受到一系列sigma因子的调控(如σE,σk)(AgaisseandLereclus1995；Kroosetal.1999；SchnepfE,CrickmoreN,VanRieJ,LereclusD,BaumJ,FeitelsonJ,ZeiglerDR,DeanDH(1998)Bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev62(3):775‐806)。例如，含有双启动子的cry1Aa基因的转录由σE和σK控制，σE和σK分别负责调控BtI和BtII两个启动子，使其分别在芽胞形成的早‐中期和中‐晚期具有活性(BravoA,AgaisseH,SalamitouS,LereclusD(1996)AnalysisofcryIAaexpressioninsigEandsigKmutantsofBacillusthuringiensis.Molecular&generalgenetics:MGG250(6):734‐741doi:10.1007/BF02172985；BrownKL,WhiteleyHR(1988)IsolationofaBacillusthuringiensisRNApolymerasecapableoftranscribingcrystalproteingenes.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica85(12):4166‐4170doi:10.1073/pnas.85.12.4166；BrownKL,WhiteleyHR(1990)IsolationofthesecondBacillusthuringiensisRNApolymerasethattranscribesfromacrystalproteingenepromoter.JBacteriol172(12):6682‐6688doi:10.1128/jb.172.12.6682‐6688.1990；SaxildHH,AndersenL,HammerK(1996)dra‐nupC‐pdpoperonofBacillussubtilis:nucleotidesequence,inductionbydeoxyribonucleosides,andtranscriptionalregulationbythedeoR‐encodedDeoRrepressorprotein.JBacteriol178:424‐434；WongHC,SchnepfHE,WhiteleyHR(1983)TranscriptionalandtranslationalstartsitesfortheBacillusthuringiensiscrystalproteingene.TheJournalofbiologicalchemistry258(3):1960‐1967)。另一个芽胞形成依赖型基因cry8Ea1(也称为cry8E)的两个启动子Porf1和Pcry8E(Porf1启动子是位于orf1基因的上游，Pcry8E启动子是位于orf1和cry8Ea1基因之间的区域)的转录活性也是分别的受到σE和σH的控制(DuL,QiuL,PengQ,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Identificationofthepromoterintheintergenicregionbetweenorf1andcry8Ea1controlledbysigmaHfactorAppliedandenvironmentalmicrobiology78(12):4164‐4168doi:10.1128/AEM.00622‐12)。尽管苏云金芽胞杆菌已用作杀虫剂被广泛使用，但是它仅占有全球杀虫剂市场的2％。其占比与传统的化学杀虫剂相比还相差甚远，主要原因是晶体蛋白的产量较低以及在田间的稳定性差(BradleyD,HarkeyMA,KimMK,BieverKD,BauerLS(1995)TheinsecticidalCryIBcrystalproteinofBacillusthuringiensisspp.thuringiensishasdualspecificitytoColeopteranandLepidopteranlarvae.Journalofinvertebratepathology65(2):162‐173doi:10.1006/jipa.1995.1024，BravoA,LikivivatanavongS,GillSS,SoberónM(2011)Bacillusthuringiensis:Astoryofasuccessfulbioinsecticide.InsectBiochemistryandMolecularBiology41(7):423‐431doi:10.1016/j.ibmb.2011.02.006；HuangD,ZhangJ,SongF,LangZ(2007)MicrobialcontrolandbiotechnologyresearchonBacillusthuringiensisinChina.Journalofinvertebratepathology95(3):175‐180doi:10.1016/j.jip.2007.02.016)。现在已经开发了一些可以增加杀虫晶体蛋白的产量、药效以及稳定性的技术。例如，用cry8E基因启动子Porf1cry8E指导cry1Ac表达可以提高HDΔsigK突变体中Cry1Ac的产量(LiCR,DuLX,PengQ(2013)Constructionofhigh‐levelexpressionvectorforBacillusthuringiensis.MicrobiologyChina40(2):350‐361)。有趣的是，非cry类基因启动子也可以成功指导cry1Ac表达。ExsY是炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)芽胞外壁的基质结构蛋白(BoydstonJA,YueL,KearneyJF,TurnboughCLJ(2006)TheExsYproteinisrequiredforcompleteformationoftheexosporiumofBacillusanthracis.Journalofbacteriology188(21):7440‐7448doi:10.1128/JB.00639‐06)。研究表明，在芽胞形成晚期，exsY基因启动子(PexsY)可以指导cry1Ac基因表达，但会导致Cry蛋白产量降低(ZhengQ,WangG,ZhangZ,QuN,ZhangQ,PengQ,ZhangJ,GaoJ,SongF(2014)Expressionofcry1AcgenedirectedbyPexsYpromoteroftheexsYgeneencodingcomponentproteinofexosporiumbasallayerinBacillusthuringiensis.ActamicrobiologicaSinica54(10):1138‐1145)。这一成果提供了非cry基因启动子可以提高Cry蛋白产量以及稳定性的重要线索。技术实现要素：本发明发现了一个新的强启动子PdoeR，它来自于一个潜在的DeoR转录调控因子家族成员。与强的cry类启动子Porf1cry8E相类似，它可以高效地指导cry1Ac基因在苏云金芽胞杆菌中表达。本发明构建了PdoeR驱动cry1Ac表达并产生晶体蛋白的菌株HD-PdeoR-1Ac。通过比较，发现HD-PdeoR-1Ac菌株的Cry1Ac产量以及对小菜蛾幼虫的杀虫活性均与野生菌株HD73类似。这些结果证明非cry基因启动子PdeoR在构建苏云金芽胞杆菌工程菌株方面有很好的应用前景。本发明为今后农业生产中改良晶体蛋白或其它杀虫剂提供了新策略，为进一步开发和利用生物农药带来新的曙光。启动子PdoeR，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。一种表达载体，含有上述启动子PdoeR和cry基因。所述cry基因为cry1Ac基因。其骨架载体为pHT315载体，所述表达载体命名为pHT315-PdeoR-1Ac。一种工程菌株，由无晶体突变株HD73-转入上述表达载体而得到。所述表达载体为pHT315-PdeoR-1Ac，其含有deoR启动子与cry1Ac基因，人工菌株命名为HD-PdeoR-1Ac菌株。上述启动子PdoeR在指导cry基因表达中的应用。所述cry基因为cry1Ac基因。本发明鉴定了一个新的非cry类的强启动子PdeoR，它可以有效地指导cry1Ac表达。我们研究证明PdeoR指导表达Cry1Ac蛋白的效果与强cry基因启动子Porf1cry8E指导的相似。这一结论得到以下证据的支持：首先，SDS-PAGE和Westernblot分析证明，deoR基因启动子(PdeoR)与orf1cry8E基因启动子(Porf1cry8E)和野生株中自身启动子(nativepromoter)指导表达的Cry1Ac具有相似的产量(图3)。其次，携带有PdeoR指导cry1Ac的菌株HD-PdeoR-1Ac也可以在母细胞中积累晶体蛋白(图4)。最后，在对小菜蛾幼虫杀虫活性方面，PdeoR指导的Cry1Ac具有与Porf1cry8E指导的Cry1Ac以及野生株中Cry1Ac有相当的杀虫活性水平(表3)。此前有许多研究致力于提高杀虫蛋白的产量和稳定性，甚至是如何提高在多种环境胁迫条件下的稳定性(SanchisV,GoharM,ChaufauxJ,ArantesO,MeierA,AgaisseH,CayleyJ,LereclusD(1999)Developmentandfieldperformanceofabroad‐spectrumnonviableasporogenicrecombinantstrainofBacillusthuringiensiswithgreaterpotencyandUVresistance.Appliedandenvironmentalmicrobiology65(9):4032‐4039；YangJ,PengQ,ChenZ,DengC,ShuC,ZhangJ,HuangD,SongF(2013)TranscriptionalregulationandcharacteristicsofanovelN‐acetylmuramoyl‐L‐alanineamidasegeneinvolvedinBacillusthuringiensismothercelllysis.JBacteriol195(12):2887‐2897doi:10.1128/JB.00112‐13；ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)。使用非天然启动子来指导cry基因表达便是其中一种方法。Porf1cry8E是来自cry8Ea1基因的一个强启动子，由σE和σH调节(DuL,QiuL,PengQ,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Identificationofthepromoterintheintergenicregionbetweenorf1andcry8Ea1controlledbysigmaHfactorAppliedandenvironmentalmicrobiology78(12):4164‐4168doi:10.1128/AEM.00622‐12)。该启动子能够增加Cry1Ac蛋白产量，尤其是在HDΔsigK中(LiCR,DuLX,PengQ(2013)Constructionofhigh‐levelexpressionvectorforBacillusthuringiensis.MicrobiologyChina40(2):350‐361；ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)。exsY基因启动子(PexsY)是第一个被报道能指导cry1Ac表达的非cry基因启动子。然而，PexsY指导Cry1Ac的表达量低于野生型菌株HD73(ZhengQ,WangG,ZhangZ,QuN,ZhangQ,PengQ,ZhangJ,GaoJ,SongF(2014)Expressionofcry1AcgenedirectedbyPexsYpromoteroftheexsYgeneencodingcomponentproteinofexosporiumbasallayerinBacillusthuringiensis.ActamicrobiologicaSinica54(10):1138‐1145)。在此，本发明发现了另一个非cry基因启动子PdeoR，在苏云金芽胞杆菌的芽胞形成过程中，其转录活性与强cry基因启动子Porf1cry8E处于同一水平(图1中B)。虽然本发明只是PdeoR指导表达Cry1Ac蛋白，但本发明指出，deoR基因启动子以特异依赖于σE的形式在芽胞形成过程中发挥作用，因此PdeoR应该可以指导所有cry基因的表达。总之，本发明为利用非cry基因的启动子成功指导Cry1Ac表达提供了一个很好的例子。这个deoR基因启动子也许还能用于其它cry基因的表达。我们的工作为今后Bt菌株改良，使用非cry基因启动子增加Cry蛋白产量和杀虫活性提供了重要线索。同时，也提示我们思考新的策略改良其它的杀虫剂，以满足农业生产的进一步开发和利用的需求。附图说明图1deoR基因启动子在芽胞形成阶段具有高转录活性图中(A)融合deoR基因启动子与lacZ，构建转录活性报告系统；(B)deoR和cry8E基因启动子转录活性比较。3个独立的克隆在SSM培养基中，30℃条件下培养，并按时间点(Tn)检测β-半乳糖苷酶活性。图中每个值代表3次以上重复实验的平均值和标准误。图2deoR基因启动子活性依赖于σE因子图中(A)分析苏云金芽胞杆菌HD73中deoR基因启动子序列。图中注释了-35序列、-10序列以及转录起始位点，带下划线的TTG是deoR基因的起始密码子，TAA为deoR基因的终止密码子。(B)deoR基因启动子在野生型(HD73)、sigK突变体以及sigE突变体中转录活性分析。3个独立的克隆在SSM培养基中，30℃条件下培养，并按时间点(Tn)检测β-半乳糖苷酶活性。图中每个值代表3次以上重复实验的平均值和标准误。图3deoR基因启动子指导cry1Ac高效表达和积累图中(A)质粒pHT315-PdeoR-1Ac的图谱；(B)SDS-PAGE分析HD-PdeoR-1Ac、HD8E-1Ac、HD73和HD73-菌株中Cry1Ac蛋白表达水平。图下标注的数值代表Cry1Ac蛋白产量，数值根据0.1μg/μlBSA计算；(C)Westernblot检测各菌株中Cry1Ac特异性。使用Cry1Ac特异性抗体anti-Cry1Ac，三角形指示Cry1Ac特异性条带。图4不同启动子驱动的Cry1Ac影响晶体形态图中(A)-(D)不同菌株在SSM培养基中，30℃条件下培养至T24的透射电子显微镜(TEM)照片。(A)HD-PdeoR-1Ac菌株；(B)HD8E-1Ac菌株；(C)HD73,野生株(D)HD73-，受体菌株，阴性对照。(E)-(G)不同菌株中Cry1Ac晶体结构的原子力显微镜(AFM)照片。(E)HD-PdeoR-1Ac菌株；(F)HD8E-1Ac菌株；(G)HD73野生株具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。材料方法:1、细菌菌株、质粒和生长条件苏云金芽胞杆菌KurstakiHD73(文章中都称为HD73)，和无晶体突变株HD73-(LereclusD,ArantesO,ChaufauxJ,LecadetM(1989)Transformationandexpressionofacloneddelta‐endotoxingeneinBacillusthuringiensis.FEMSmicrobiologyletters51(1):211‐217)在5mlLB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％胰蛋白胨，固体LB培养基需要补充1.5％琼脂)中活化。检测启动子活性时，选择Schaeffer氏芽胞形成培养基(SchaefferP,MilletJ,AubertJP(1965)CatabolicrepressionofbacterialsporulationProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica54(3):704‐711doi:10.1073/pnas.54.3.704)，其中SSM培养基的成分是0.8％营养肉汤，0.012％MgSO4,0.1％KCl,0.5mMNaOH,1mMCa(NO3)2,0.01μMMnCl2,1μMFeSO4。此外，在实验中使用到的大肠杆菌JM109菌株用于常规分子克隆实验，而ET1菌株用于获得非甲基化质粒DNA以便成功转入苏云金芽胞杆菌(MacalusoA,MettusAM(1991)EfficienttransformationofBacillusthuringiensisrequiresnonmethylatedplasmidDNAJBacteriol173(3):1353‐1356doi:10.1128/jb.173.3.1353‐1356.1991；WangG,ZhangJ,SongF,WuJ,FengS,HuangD(2006b)EngineeredBacillusthuringiensisGO33Awithbroadinsecticidalactivityagainstlepidopteranandcoleopteranpests.Appliedmicrobiologyandbiotechnology72(5):924‐930doi:10.1007/s00253‐006‐0390‐x)，大肠杆菌都是在LB培养基中，37℃，220rpm的条件下培养。用于苏云金芽胞杆菌生长时所需的抗生素和使用浓度：红霉素5μg/ml、卡那霉素50μg/ml。用于大肠杆菌的生长时所需的抗生素和使用浓度：氨苄青霉素100μg/ml。本研究中使用的细菌菌株和质粒总结在表1中。菌株和质粒均可以对外公开发放。表1用于本研究的菌株和质粒a抗生素抗性如下所示：ErmR，红霉素抗性；AmpR，氨苄青霉素抗性。2、DNA的操作和转化用质粒小量制备试剂盒(Axygen，杭州，中国)从大肠杆菌细胞中提取质粒DNA，根据说明书使用限制酶和T4DNA连接酶(宝生物工程有限公司，大连，中国)进行酶切和连接反应。用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶(宝生物工程有限公司，大连，中国)和普通TaqDNA聚合酶(BioMed，北京,中国)进行PCR扩增。从1％琼脂糖凝胶中回收DNA片段使用DNA凝胶回收试剂盒(Axygen，杭州，中国)。大肠杆菌的转化用热激法(SambrookBJ,RussellDW(2015)MolecularCloningALaboratoryManual.3rdededn.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)，苏云金芽胞杆菌的转化采用电激法(LereclusD,ArantesO,ChaufauxJ,LecadetM(1989)Transformationandexpressionofacloneddelta‐endotoxingeneinBacillusthuringiensis.FEMSmicrobiologyletters51(1):211‐217。)3、构建deoR启动子与lacZ融合载体为了分析deoR启动子的转录活性并与orf1-cry8E启动子相比较(DuL,QiuL,PengQ,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Identificationofthepromoterintheintergenicregionbetweenorf1andcry8Ea1controlledbysigmaHfactorAppliedandenvironmentalmicrobiology78(12):4164‐4168doi:10.1128/AEM.00622‐12)，首先从HD73菌株扩增deoR启动子的序列。deoR启动子是位于deoR基因起始密码子上游长710bp的序列，使用特异性引物PdeoR-5/PdeoR-3(表2中)扩增。随后通过PstI和BamHI两个酶切位点融合到含有lacZ基因的pHT304-18Z载体上(AgaisseH,LereclusD(1994)StructuralandfunctionalanalysisofthepromoterregioninvolvedinfullexpressionofthecryIIIAtoxingeneofBacillusthuringiensis.MolecularMicrobiology13(1):97‐107doi:10.1111/j.1365‐2958.1994.tb00405.x)。将重组质粒pHT304-PdeoR通过电激转化的方法转入到HD73菌株中(GenePulserIIApparatus,BIO-RAD)。构建好的HDPdeoR菌株通过红霉素抗性筛选和PCR方法鉴定。表2本研究中使用的特异性引物a限制性内切酶位点标有下划线4、构建deoR启动子与cry1Ac基因融合载体通过重叠PCR技术将deoR启动子与cry1Ac基因融合。特异性引物pHTdeoR-5/pHTdeoR-3和pHT1Ac-5/pHT1Ac-3(见表2)分别用于扩增deoR启动子和cry1AcORF(基因登录号AAB46989.1)(WongHC,SchnepfHE,WhiteleyHR(1983)TranscriptionalandtranslationalstartsitesfortheBacillusthuringiensiscrystalproteingene.TheJournalofbiologicalchemistry258(3):1960‐1967)，扩增得到的特异性PCR产物经过凝胶回收，作为模板并用引物pHTdeoR-5/pHT1Ac-3进行第二轮PCR，扩增出重叠片段。得到的融合片段PdeoR-cry1Ac经过SalI和SphI位点构建到pHT315载体，得到pHT315-PdeoR-1Ac质粒。经测序验证正确后，采用电激转化的方法将其转入到HD73-菌体中。构建好的HD-PdeoR-1Ac菌株通过红霉素抗性筛选和PCR方法鉴定。此外，质粒pHT315-8E-1Ac和菌株HD8E-1Ac作为阳性对照(表1)(ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)。5、β-半乳糖苷酶活性测定为了测定β-半乳糖苷酶活性，将苏云金芽胞杆菌菌株HDPdeoR和HD(Porf1-cry8E-lacZ)接种到SSM培养基中，在30℃、220rpm振荡培养。以1小时为间隔从T1至T12各收集2ml菌液(T0表示指数生长期的结束，Tn表示T0后第n小时)。将菌液离心1min，弃去上清并将沉淀储存在-20℃冰箱中备用。β-半乳糖苷酶活性的测定方法参见(YangH,WangP,PengQ,RongR,LiuC,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Weaktranscriptionofthecry1AcgeneinnonsporulatingBacillusthuringiensiscells.Appliedandenvironmentalmicrobiology78(18):6466‐74doi:10.1128/aem.01229‐12)，并且使用国际统一化的Miller单位(MillerJH(1972)ExperimentsinMolecularGenetics.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。6、Cry蛋白产量分析苏云金芽胞杆菌接种到50mlSSM培养基中，在30℃、220rpm的条件下生长至T24时期，随后离心8000×g，4℃10min收集菌体，并经冷冻干燥直至成冻干粉末。在每个样品中加入适当体积的ddH2O重悬，使每个样品生物量浓度(mg/ml)相同。准备含200μg石英砂(直径为0.1mm)的2ml离心管，加入细胞细胞重悬液并破碎。离心12000×g，4℃5min，取上清液，作为总蛋白样品。进而通过SDS-PAGE(4％聚丙烯酰胺浓缩胶，10％聚丙烯酰胺分离胶)和考马斯亮蓝染色来检测Cry蛋白的产量。实验结果经过ImageJ软件(Version1.6.0_24,NationalInstitutesofHealth)和BSA进行定量分析。7、Cry蛋白特异性检测蛋白样品经SDS-PAGE分离后，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜进行Westernblot实验(WangG,ZhangJ,SongF,WuJ,FengS,HuangD(2006a)EngineeredBacillusthuringiensisGO33Awithbroadinsecticidalactivityagainstlepidopteranandcoleopteranpests.Appliedmicrobiologyandbiotechnology72(5):924‐30doi:10.1007/s00253‐006‐0390‐x)。用1：5,000稀释的一抗anti-Cry1Ac(华大蛋白，北京，中国)与载有Cry蛋白的PVDF膜孵育，用PBST洗涤，随后用HRP偶联二抗羊抗鼠IgG(康为世纪，北京，中国)孵育。显色方法参见已报到的文献(NiD,XuP,GallagherS(2016)ImmunoblottingandImmunodetection.In:ColiganJE(ed)Currentprotocolsinimmunology.p8.10.1‐8.10.36).8、转录起始位点鉴定HD73菌株在SSM培养基中生长至T7阶段，收集菌体，提取总RNA，通过逆转录PCR将其反转录成cDNA,方法参见(DuL,QiuL,PengQ,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Identificationofthepromoterintheintergenicregionbetweenorf1andcry8Ea1controlledbysigmaHfactorAppliedandenvironmentalmicrobiology78(12):4164‐4168doi:10.1128/AEM.00622‐12)。为了确定转录起始位点，按照cDNA扩增试剂盒(Clontech，MountainView，CA)使用说明书进行SMARTerRACE实验。PdeoRRace和NestRace作为用于扩增PdeoRcDNA的5'末端的特异性引物。引物序列见表2。9、菌体形态和晶体结构观察使用透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)观察苏云金芽胞杆菌菌体形态和晶体结构。TEM的样品的制备如下：苏云金芽胞杆菌接种到SSM培养基中，在30℃下在培养至T24。离心收集20ml样品，然后加入1ml3％戊二醛溶液进行固定。样品经过固定，脱水，替换，浸泡，包埋，切片和染色等一系列操作之后用于观察，仪器的操作过程参见(LiuR,YuG,ZouW,DuT(2008)Improvementsintechniqueofmaddingultrathinsectionfortransmissionelectronmicroscope.JiangxiForestryScience&Technology(1):41‐43；WeigelD,GlazebrookJ(2010)Transmissionelectronmicroscopy(TEM)freezesubstitutionofplanttissuesColdSpringHarborprotocols.vol7,)。AFM实验中用到的样品是将菌株培养到T24或更晚阶段，直至90％以上晶体完成释放。详细的操作步骤参照仪器使用指南(BrukerMultiMode8SPM)。10、杀虫活性测定杀虫活性的测定方法参照文献(ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)，本专利中使用的菌株分别是HD-PdeoR-1Ac,HD8E-1Ac,HD73和HD73-。将四种菌液制备成相同生物量的杀虫蛋白液，将这种杀虫蛋白液分为七个浓度梯度(1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml和80μg/ml)，随后分别将蛋白液均匀涂抹在相同面积的卷心菜叶片(直径6cm)上，并且每个叶片上接种30只体型相近的二龄小菜蛾幼虫(XueJ,LiangG,CrickmoreN,LiH,HeK,SongF,FengX,HuangD,ZhangJ(2008)CloningandcharacterizationofanovelCry1AtoxinfromBacillusthuringiensiswithhightoxicitytotheAsiancornborerandotherlepidopteraninsects.FEMSmicrobiologyletters280(1):95‐101doi:10.1111/j.1574‐6968.2007.01053.x.)。3天后计数幼虫的存活数，并使用概率分析(ProbitAnalysis)计算LC50。每个浓度进行三次重复实验。结果1、deoR基因启动子在芽胞形成阶段具有高转录活性为获的可以高效指导cry基因表达的强启动子，根据基因芯片数据(AccessionNo.GSE48410)(PengQ,WangG,LiuG,ZhangJ,SongF(2015)Identificationofmetabolismpathwaysdirectlyregulatedbysigma54factorinBacillusthuringiensis.FrontiersinMicrobiology6:407)，分析了苏云金芽孢杆菌HD73菌株在T7时期各基因的表达水平，并挑选出前100个高转录活性的基因作为候选(表3)。然后利用RNA-seq数据(未发表)，进一步筛选在过渡时期(从营养生长到芽胞形成)和芽胞形成时期都高量表达的基因。最后，选取HD73_5014基因(DeoR转录子家族成员)，其启动子作为候选强启动子用于本研究，并标识为PdeoR。表3具有高表达的前100个基因的基因芯片数据已有报道cry8E基因启动子(Porf1cry8E)是一个强的cry基因启动子，可以高效指导cry1Ac基因表达(ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)。为了证实deoR启动子(PdeoR)的高转录活性，本发明对PdeoR和Porf1cry8E的转录活性进行比较。通过构建启动子融合lacZ的菌株(图1中A)，并进行β-半乳糖苷酶活性测定。结果表明，在芽胞形成时期，特别是从T6到T12期，PdeoR和Porf1cry8E的转录活性非常高(图1中B)。两个启动子的转录活性相似，都一直呈上升趋势直至T8达到峰值，而后逐渐降低(图1中B)。总体而言，PdeoR的转录活性与Porf1cry8E在各个时间段都很相似，表明在芽胞形成过程中，PdeoR也是强启动子。2、deoR基因启动子活性依赖于σE因子进一步，仔细分析了deoR基因启动子序列(见SEQIDNO：1)。依据5'-RACE获得的随机克隆的序列，确定了转录起始位点，是位于deoR翻译起始密码子上游的55个核苷酸残基位置的“A”(图2中A)。对deoR启动子区的分析显示，-35区(GCATGA)和-10区(AGTACAAT)(图2中A)与σE依赖型启动子的保守序列(KHATANHT...MATANNHT)相似(ZhangJB,SchairerHU,SchnetterW,LereclusD,AgaisseH(1998)Bacilluspopilliaecry18Aaoperonistranscribedbysigma(E)andsigma(K)formsofRNApolymerasefromasingleinitiationsite.NucleicAcidsResearch26(5):1288‐1293doi:10.1093/nar/26.5.1288)。这表明deoR启动子也可能依赖于σE。cry1Ac基因是依赖芽胞形成的cry基因，有两个启动子，分别受σE和σK识别和控制(WongHC,SchnepfHE,WhiteleyHR(1983)TranscriptionalandtranslationalstartsitesfortheBacillusthuringiensiscrystalproteingene.TheJournalofbiologicalchemistry258(3):1960‐1967)。在利用deoR基因启动子指导cry1Ac基因表达前，需要确认deoR启动子是否也由σE和σK调控。为此，我们构建含有PdeoR-lacZ融合的质粒pHT304-PdeoR，并转入野生型菌株(HD73)，sigE突变体(HDΔsigE)和sigK突变体(HDΔsigK)中，测定和比较这三个株菌的β-半乳糖苷酶活性。如图2中B所示，PdeoR-lacZ融合在sigE突变体中β-半乳糖苷酶活性降低，而在野生型和sigK突变体中，PdeoR的转录活性在T1至T8时期内快速增加(图2中B)，从而证实deoR启动子由σE调控。此外，在T9到T12时期内，PdeoR的转录活性在野生型中低于在sigK突变体中(图2中B)，此结果与已报道Porf1cry8E的转录活性相一致(DuL,QiuL,PengQ,LereclusD,ZhangJ,SongF,HuangD(2012)Identificationofthepromoterintheintergenicregionbetweenorf1andcry8Ea1controlledbysigmaHfactorAppliedandenvironmentalmicrobiology78(12):4164‐4168doi:10.1128/AEM.00622‐12)。以上研究结果证实deoR基因启动子以特异依赖于σE的形式在芽胞形成过程中发挥作用。3、deoR基因启动子指导cry1Ac表达和积累为了检测deoR启动子能否指导cry1Ac在苏云金芽胞杆菌中高效表达，我们首先构建了pHT315-PdeoR-1Ac质粒，其内含有PdeoR-cry1Ac融合(图3中A)。同时，以pHT315-8E-1Ac质粒(ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)作为对照。随后将这两个质粒导入HD73-菌株——该菌株无cry基因，不能形成晶体(LereclusD,ArantesO,ChaufauxJ,LecadetM(1989)Transformationandexpressionofacloneddelta‐endotoxingeneinBacillusthuringiensis.FEMSmicrobiologyletters51(1):211‐217)。相应的，得到菌株HD-PdeoR-1Ac和HD8E-1Ac(ZhouC,ZhengQ,PengQ,DuL,ShuC,ZhangJ,SongF(2014)Screeningofcry‐typepromoterswithstrongactivityandapplicationinCryproteinencapsulationinasigKmutant.Appliedmicrobiologyandbiotechnology98(18):7901‐7909doi:10.1007/s00253‐014‐5874‐5)。通过透射电子显微镜(TEM)对所得到的菌株进行检测，观察其晶体蛋白的形成情况。结果表明，与HD73-(图4中D)相比，HD-PdeoR-1Ac(图4中A)、HD8E-1Ac(图4中B)和HD73(图4中C)都能产生明显的晶体内含物。有趣的是，HD-PdeoR-1Ac(图4中A)和HD8E-1Ac(图4中B)在芽胞形成过程中不能形成典型的双锥体晶体，而在HD73中却可清楚地观察到(图4中C)。为进一步确认这一现象，我们通过高分辨力的原子力显微镜(Atomicforcemicroscope，AFM)检测了晶体形态。与HD73菌株产生的完美双锥体晶体(图4中G)相比，我们在HD-PdeoR-1Ac(图4中E)和HD8E-1Ac(图4中F)中都只能观察到一些不规则的晶体。基于这些结果，推测Cry1Ac的转录后调节显著影响双锥体晶体结构形成。接下来，我们对HD-PdeoR-1Ac菌株的Cry蛋白产量进行检测，以决定PdeoR启动子能否高效指导Cry1Ac蛋白表达并且适合生产应用。SDS-PAGE实验显示HD-PdeoR-1Ac，HD8E-1Ac和HD73都产生～130kDa大小的Cry1Ac蛋白，且产率大致相同，而在在受体菌株HD73-中没有检测到该蛋白(图3中B)。同时，我们用Cry1Ac抗体进行免疫印迹实验验证这几个菌株产Cry蛋白的特异性。先将菌株在SSM培养基中培养至稳定期，随后收集细胞并提取蛋白质进行检测。与预期一致，在HD-PdeoR-1Ac，HD8E-1Ac和HD73中发现有～130-kDaCry1Ac，而在HD73-中没有(图3中C)。以上结果表明，deoR基因启动子能够正确、高效地指导cry1Ac基因表达。4、deoR启动子指导表达的Cry1Ac具有杀虫活性。尽管HD-PdeoR-1Ac不能和野生型(HD73)一样产生典型的双锥体晶体，但和HD73-相比，HD-PdeoR-1Ac有明显的Cry1Ac蛋白积累(图3和图4)。那么，是否deoR启动子指导表达的Cry1Ac具有与野生型和对照菌株HD8E-1Ac相似杀虫活性？我们用HD-PdeoR-1Ac，HD8E-1Ac，HD73和HD73-预处理的卷心菜分别喂养二龄小菜蛾幼虫，随后计算半致死浓度(LC50)。结果发现HD-PdeoR-1Ac与HD8E-1Ac和HD73的杀虫活性相似(表4)。这表明deoR启动子指导表达的Cry1Ac具有良好的杀虫活性，HD-PdeoR-1Ac菌株可以作为候选的生物防治剂使用。表4苏云金芽孢杆菌菌株对小菜蛾的杀虫活性菌株半致死浓度(μg/ml)95％置信区间HDdeoR1Ac‐31517.112.77‐22.93HD8E1A‐315c21.6318.74‐25.09HD7320.6318.3‐23.19HD73‐NANASEQUENCELISTING<110>中国农业科学院植物保护研究所<120>启动子PdoeR及其在指导cry基因表达中的应用<130>PP17008－ZWB<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>912<212>DNA<213>启动子PdoeR的核苷酸序列<400>1ctttccatcgcgaatatccgcactatatgcaggagtcgtccagccatctccttctggtac60aacatcaacgtgacaaagaatgcctactaactcttctccttgtcccatttcaagatgacc120tgcatatccttctaaatttttagaagcaaaaccttcagtttctcctttatgtaacatgaa180agataaagctttttctacaccttcaccgaatggtgcgccctctttcgccgattcttcttc240ccatacacttttaatttgtaaaaattgttgtgtatcacgaattaaatcatcttttcgttt300cgcaacttcttctgtccaattaattgctgacatcacgcatccatccttcactatattgtt360tctttcatcataacaaaccgaaatctcttatgccatacacgaaaactaaataccgaacaa420ttgtaatatttcagatatttcttattagtttttcttttattttttcaaaaaaatttgcag480gaatttggcgttttacgtagaattttatgtgttagttgactgaccatatatacaatgtca540actaccaatatttttctatatgaatatttgttaaatttctgtaaaatttaagtagattaa600agcatgaattttatcatgtagagtacaatggtagtaacgaccttctttcctgaatggggt660caaaaaaactagtagaggagtggttttctcttgaaacctacaactactcgtatgctaaca720cgcattaaatcaatttatatgtacatcaatgaaaacggaacggtaacgacgaaagacctt780gtagatgagttcgggatcacaccgcgaacgatacaacgtgatctaaatgtgttgcagttt840aatgaactcgtgtatagcccttgccgcggtaagtggacaacaacaggaaagaaagtgaga900atgacctcataa912当前第1页1 2 3