一种具有较大Stokes位移的识别线粒体的荧光探针的制作方法

本发明涉及一种识别线粒体并具有较大stokes位移的新型荧光探针，尤其涉及一种专一识别线粒体的菲醌-吡啶盐类化合物荧光探针及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术：

线粒体作为人体中重要的细胞器之一，因自身带有遗传物质并含有核糖体而在人体中具有重要性，作为有氧呼吸产生能量的主要场所，被誉为“细胞能量工厂”。正常情况下人体内线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。

细胞凋亡时发生的一系列形态和生化变化，是受凋亡信号系统激活所导致的细胞内一系列酶的活性以及凋亡相关基因表达的变化调控的。线粒体在凋亡研究领域中日益受到重视，其功能的重要性亦成为研究的热点之一。

人体线粒体出现异常会导致线粒体疾病，由于线粒体病的遗传方式比较复杂，导致疾病的原因往往主要由核基因和线粒体基因造成，且其临床表现复杂，确切病因的诊断十分困难，往往通过大分子酶学活性检测分析并结合遗传学基因分析的双重手段确定病因。所以，对其异常水平的检测应引起人们的高度重视。基于此，开发新型的荧光探针，通过定位线粒体来判断线粒体是否异常有着重要的研究价值。

stokes位移是分子探针的重要参数，较大stokes位移有利于克服激发在荧光造影中的干扰，更好的实现探针的细胞成像。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种能识别线粒体的具有较大stokes位移的菲醌-吡啶盐类化合物荧光探针及其应用。

本发明所述的新型适于识别线粒体具有较大stokes位移的荧光探针pi-c2，其特征在于：其化学结构式如式（i）所示：

（i）

上述化合物的制备方法是：将4-甲基吡啶1与碘乙烷在甲醇做溶剂条件下加热回流生成化合物2，然后将化合物2与对苯二甲醛发生反应得到产物3，产物3与菲醌在冰醋酸条件下反应得最终产物pi-c2，其nmr图谱见图1-3。

上述化合物的制备反应式如下：

上述适于专一识别线粒体的荧光探针在检测线粒体变化的应用。

上述的应用中：所述荧光探针具有大的stokes位移。

上述荧光探针与商用线粒体探针mtr、mtg相比，具有较大的stokes位移。该探针在不同溶剂条件下的吸收波长在400nm左右,而发射波长却红移至600nm，stokes位移高达200nm。而mtr、mtgstokes位移只有30nm左右。且该探针与mtg相比具有高的量子产率。并在细胞中对其做了共定位实验。实现该探针对线粒体的识别作用。

实验证实：当检测环境是水相时，由本发明所述的线粒体荧光探针的溶剂化效应显示，在水中探针的荧光强度相对较弱（图4），其荧光量子产率约为0.02（参见表1：化合物的光物理性质），这使得探针能更好的用于人体环境的检测，大大降低了探针对人体的危害性，同时也消除了自身的干扰性。在紫外吸收实验（图5）与荧光实验的对比可知，探针的stokes位移明显大于mtr、mtg，为了形象表示stokes位移的变化，我们在不同溶剂下对三种探针做了对比（图6,）另外细胞实验（图7）证实，通过与商用线粒体探针进行拟合，该探针能明显地定位于线粒体中，从而实现了线粒体内的检测。

基于上述实验结果，可以证明本发明所述的识别线粒体且具有较大stokes位移的菲醌-吡啶盐类化合物荧光探针是一类新型的高选择性识别线粒体的荧光探针分子，该探针合成路径简便，易于应用。通过体外测试表明具有较大stokes位移，细胞成像实验可以判断该探针能够实现其检测线粒体的作用。

本发明提供的识别线粒体的具有较大stokes位移菲醌-吡啶盐类化合物荧光探针有其显著优势，且本发明所述菲醌-吡啶盐类化合物合成手段也具有新颖性和简便性。基于本发明提供的识别线粒体且具有较大stokes位移的菲醌-吡啶盐类化合物荧光探针能实现线粒体检测，并且实现细胞内成像，为生物学成像应用奠定了理论基础，预示其在荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。且该化合物大的stokes位移将为以后新型荧光探针的合成提供了新的发展方向。

附图说明

图1：化合物2¹hnmr(400mhz,cdcl3)；

图2：化合物3¹hnmr(400mhz,meod)；

图3：化合物pi-c2¹hnmr(400mhz,meod)；

图4：探针的溶剂化效应；

图5:探针的紫外吸收光谱；

图6:不同溶剂下的stokes位移图；

图7：探针的细胞生物成像应用。

具体实施方式

实施例1

化合物2的合成：

将1.0g(10.7mmol)的4-甲基吡啶1，溶于20ml甲醇中，将碘乙烷2.5ml(10.7mmol)滴加至混合液中，加热回流15h，反应体系由淡黄色变为黄色。反应结束后冷却至室温，将溶剂蒸干，所得固体用乙醚洗涤过滤得到黄色固体。

化合物3的合成：

将0.65g(5mmol)对苯二甲醛，0.63g化合物2溶于20ml无水乙醇中。在氮气保护下加热回流过夜，反应体系变为黄色。反应结束后，ea萃取，用dcm：meoh（10:1）淋洗液过柱提纯得黄色固体。

化合物pi-c2的合成：

将0.25g(1.1mmol)菲醌，0.36g（1.1mmol）化合物3，1.54g醋酸铵和10ml冰醋酸混合在50ml的圆底烧瓶中，在氮气保护下加热回流8h，反应结束后冷却至室温，将液体倒入100ml的冰水中，将沉淀过滤，水洗三次烘干，乙醇重结晶得到黄色固体。1hnmr(400mhz,meod)：(ppm):8.88(t,j=9.2hz,2h)，8.82(d,j=6.7hz,2h,)，8.62(d,j=6.8hz,1h)，8.45(t,j=7.2hz,3h)，8.16(d,j=6.6hz,2h,)，8.02-7.89(m,3h)，7.88-7.72(m,4h)，7.53(d,j=16.5hz,2h,)，4.61(q,j=7.4hz,2h,)，1.68(,t,j=7.4hz,3h)。

实施例2

化合物pid的溶剂化效应

预先准备1份8ml的10^-3m探针的n,n-二甲基甲酰胺溶液，然后分别取5μl加入八个相同的5ml容量瓶中，分别用dmf、dmso、thf、乙腈、pbs、甲醇、氯仿、水稀释到5ml，然后进行荧光检测，结果见图4；探针在600nm左右有最大发射峰，且有机溶液中的荧光强度远大于水相中。

实施例3

预先准备1份8ml的10^-3m探针的n,n-二甲基甲酰胺溶液，然后分别取5μl加入八个相同的5ml容量瓶中，分别用dmf、dmso、thf、乙腈、pbs、甲醇、氯仿、水稀释到5ml，然后进行紫外吸收检测，结果见图5；探针在400nm左右有最大吸收峰。

实施例4

根据实施例2、3数据计算探针在各溶剂内的量子产率。

上述计算公式如下：

其中，和分别代表样品和参比的单光子荧光量子产率，和分别代表样品和所选参比的吸光度数值，和分别代表样品和参比分子的荧光强度，∫fs和∫fr分别代表探针分子和参比的单光子荧光积分面积。理想的参比一般是与激发波长无关（见表1）。

表1：化合物pi-c2的光物理性质

。

实施例5

分别用dmf、dmso、thf、乙腈、pbs、甲醇、氯仿、水溶液配置与探针浓度等量的mtr、mtg溶液，并对其测试紫外吸收光谱和荧光光谱，对比stock位移的变化。结果见图6；探针本身的stocks位移高达200nm，远远高于mtr和mtg的30nm。

实施例6

生物成像：活细胞染色实验

将探针配成1mmdmf母液，染色时用1ml培养基稀释。

将接种好的细胞在设定量浓度的探针分子溶液37ºc孵育30min，用pbs洗3-5次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行荧光成像。激发波长为405nm，吸收在570-620nm。

商用线粒体探针(mtg)进行共定位实验，由共聚焦荧光显微镜下成像图可知，该试验证明了探针能很好的定位于线粒体（见图7）。共定位系数高达0.9，说明探针成功定位于线粒体中。