一种地衣芽孢杆菌菌株TA65及其在促进堆肥腐熟中的应用的制作方法

本发明属于植物促生菌开发
技术领域：
，具体涉及的是一种地衣芽孢杆菌菌株ta65及其在促进堆肥腐熟中的应用。
背景技术：
：化肥在现代农业生产中发挥着巨大作用。但是随着化肥使用量的增加，其利用率逐年降低。农药和化肥的残留，向环境释放了大量的有害物质，污染了土壤、水源和食品，对人类健康及生存环境构成了极大威胁，要求保护生态环境和生产安全食品的呼声日益强烈。因此，开发利用替代化学肥料的新肥源，以适应发展绿色农业和绿色食品的需要已是当务之急。而微生物肥料可使土壤中无效营养有效化，预防和控制农作物病害，减少农药和化肥的使用，是解决土壤、水源和食品污染的根本途经，被普遍认为是一种环境友好、经济有效的提高作物产量的方法。微生物肥料是一类含有微生物活体的特定制品，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应。其中制品中活微生物起关键作用。目前，一般将微生物肥料制品分为两大类：一类是狭义的微生物肥料，指通过微生物的生命活动，增加了植物营养元素的供应量，包括土壤和生产环境中植物营养元素的供应总量，导致植物营养状况的改善，进而增加产量。这一类微生物肥料的代表是根瘤菌肥；另一类是广义的微生物肥料，指通过其中微生物的生命活动，不但能提高植物营养元素的供应量，还能产生植物生长激素，促进植物对营养元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，减轻农作物病虫害简介提高作物产量。与化学肥料相比，微生物肥料具有以下优点：不破坏土壤结构；保护生态、不污染环境，对人畜无毒无害；肥效持久；提高作物产量，改善作物品质；成本低廉，经济有效。植物根际促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，pgpr)是一类能高密度定殖在植物根际的微生物，兼有抑制植物病原菌、根际有害微生物，以及促进植物生长并增加作物产量的作用。作为生物肥料和生物农药的重要资源库，pgpr的研究和应用已经起到了举足轻重的作用。从资源再生利用的角度来研究和开发微生物肥料则对资源综合利用和环境保护更具有现实意义。地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)，其细胞形态和排列呈杆状、单生，可调整菌群失调达到治疗目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。地衣芽孢杆菌主要应用以下几个方面：(1)有效预防水产动物肠炎，烂鳃等疾病。(2)分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质。(3)具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分。(4)刺激水产动物免疫器官的发育，增强机体免疫力。(5)促进肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能；(6)对肠道细菌感染具有特效，对轻型或重型急性肠炎，轻型及普通型的急性菌痢等，均有明显疗效；(7)能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。目前，地衣芽孢杆菌主要用作动物饲料添加剂，而对于地衣芽孢杆菌在促进堆肥腐熟中应用尚未见有相关报道。公开于该
背景技术：
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。技术实现要素：本发明解决的问题在于提供一种地衣芽孢杆菌菌株ta65，该菌株可应用于制备表面活性剂及促进堆肥腐熟。本发明的目的通过如下技术方案实现：本发明公开了一种地衣芽孢杆菌菌株ta65，其分类学命名为地衣芽孢杆菌a65(bacilluslicheniformis)，于2017年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc13531。本发明还提供了所述的地衣芽孢杆菌菌株ta65在降解木质纤维素中的用途。本发明还提供了所述的地衣芽孢杆菌菌株ta65在制备表面活性剂中的用途。本发明还提供了所述的地衣芽孢杆菌菌株ta65在制备漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶中的用途。本发明还提供了一种菌剂，将权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株ta65种子液按1％(v/v)的接种量，接种到1l灭菌后的lb培养液中，在摇床(50℃，120rmp)中培养24h，收集培养液，即得菌剂。本发明还提供了所述的菌剂在促进堆肥腐熟中的用途。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：1.本发明提供的地衣芽孢杆菌菌株ta65为首次从堆肥高温期样品中筛选分离得到的，该菌株耐高温，生长繁殖快，且能够产木质纤维素降解酶。2.本发明提供的含地衣芽孢杆菌菌株ta65的菌剂能够提高堆肥温度，加速有机质降解生成小分子水溶有机质(dom)，提高凯氏氮的含量，促进堆肥腐熟。3.本发明提供的地衣芽孢杆菌菌株ta65还具有产生物表面活性剂的功能，因此，该菌株可以用于制备表面活性剂。保藏信息说明地衣芽孢杆菌a65(bacilluslicheniformis)，保藏编号为cgmcc13531，保藏日期为2017年01月05日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。附图说明图1为温度随堆肥时间变化曲线。rt：室温，空白组(ck)，实验组(t)图2为ph随堆肥时间变化曲线。空白组(ck)，实验组(t)图3为水分随堆肥时间变化曲线。空白组(ck)，实验组(t)图4为有机质含量随堆肥时间变化曲线。空白组(ck)，实验组(t)图5为凯氏氮含量随堆肥时间变化曲线。空白组(ck)，实验组(t)图6为氨氮含量随堆肥时间变化曲线。空白组(ck)，实验组(t)图7为硝态氮含量随堆肥时间变化曲线。空白组(ck)，实验组(t)图8为dom含量随堆肥时间变化曲线。空白组(ck)，实验组(t)图9为bacilluslicheniformista65菌落图。图10为bacilluslicheniformista65在血琼脂平板上的表现。图11为葡糖糖标准曲线。图12为木糖标准曲线。图13为筛选出菌株的凝胶电泳图谱；有关附图标记的说明：m-2000bpmake；1-tb21；2-tb22；3-tb23；4-tb24；5-tb25；6-tb41；7-tb42；8-tb43；9-tb44；10-tb45；11-tb61；12-tb62；13-tb63；14-tb64；15-tb65；16-ta65；17-tb46。具体实施方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1：地衣芽孢杆菌a65(bacilluslicheniformis)的筛选1.实验材料与设备1.1主要试剂表1主要试剂1.2主要仪器与设备表2主要仪器与设备仪器名称型号生产厂家紫外-可见分光光度计uv759上海精科洁净工作台sw-cj-1f苏州安泰空气技术有限公司自动平衡离心机psz4-1.2北京市医用离心机厂雷偌ph计phs-2s上海仪电仪器股份有限公司恒温摇床hq45z武汉中科科技技术发展有限责任公司生化培养箱spx-150b上海跃进医疗器械厂电子调温万用电炉dk-98-ii天津市泰斯特仪器有限公司冰箱电子天平yp6102上海光正医疗仪器有限公司电热干燥箱立式压力蒸汽灭菌器yxq-ls-50sii上海博讯实业有限公司医疗设备厂电热恒温水浴锅北京市医疗设备厂精密电子天平jj500y1.3培养基细菌培养基：营养琼脂33g，去离子水1000ml；lb培养液：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，去离子水1000ml。2.木质素降解菌的分离筛选2.1取样筛菌的样品分别为2、4、6天的堆肥样品，在堆体温度较高处多点取样(一般在堆体表面下方10-20cm)，样品混匀后装入样品袋中于-4℃的冰箱里保存。2.2耐高温菌的筛选及纯化称取样品10g，加入到含有90ml灭菌处理后的nacl溶液(0.9％w/v)的三角瓶中，置于摇床上振荡30min，目的是打散菌胶团，使细菌呈单细胞状态分散于溶液中。将灭菌处理后的nacl溶液分别加到7支试管中(同样灭菌处理过)，每支加入9ml,取震荡后的菌液1ml分别加入试管，即分别稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，再分别将各稀释度下的菌液取0.1ml涂布在细菌培养基平板上，50℃恒温培养。每种稀释梯度的平板均作5个平行。可以观察到细菌群落在10-5稀释度下长势较好。在五个平行平板中选取菌落较大的进行分离培养并多次划线纯化。如图9-10所示，地衣芽孢杆菌a65菌落形态较规则，菌落较小，表面粗糙干燥，边缘湿润，白色，菌落边缘较整齐。3.粗酶液的制取配制lb培养液，灭菌处理，倒入同样灭过菌的血清瓶中(25ml)，把分离得到的株菌接种到血清瓶中，放入摇床(50℃，120rmp)培养，制备种子液。配制lb培养液，在锥形瓶中倒入100ml，灭菌处理，吸取上述1ml种子液到锥形瓶中，同样放入摇床培养(50℃，120rmp)，制成菌液。液体产酶培养：菌液经5000r/mim离心5min，取上清液作为粗酶液，以热灭活酶液(取0.6ml粗酶液于离心管，煮沸10min)作为对照。4.酶活的测定方法4.1漆酶(lac)活性的测定1、试剂(1)由该酶氧化abts的速度决定；(2)0.1mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液:分别称取2.941g柠檬酸钠和2.1014g柠檬酸，加去离子水100ml，向柠檬酸钠中加柠檬酸，用ph计调ph＝5.0；(3)0.5ml0.5mol/labts；2、操作步骤(1)在25℃时，在试管中加入2ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1mmol/l，ph＝5)，和0.5mlabts，将混合液倒入比色皿中；(2)然后添加1ml酶液启动反应，在420nm下测定吸光值变化。3、计算方法酶活定义：为每分钟氧化1μmol的abts为一个酶活单位，消光系数ε＝3.6*104[(mol/l)-1cm-1]，酶活单位：u/l漆酶(lac)活力＝aod*106/δt*v酶液*∈＝(δod/δt)*106/0.5*3.6*104式中：δod-测定的相邻吸光度值差最大的值；δt-δod值对应的时间差值；v-酶液的体积。4.2木质素过氧化物酶(lip)活性的测定1、试剂(1)0.24mol/l酒石酸钠缓冲液：分别称取3.60216g酒石酸和5.52192g酒石酸钠，加去离子水100ml，向酒石酸钠中加酒石酸，调ph＝3.0；(2)0.1ml24mmol/l藜芦醇；(3)0.05ml6.0mmol/l的h2o2；2、操作步骤(1)在37℃时，总反应体系为3ml，向试管中加入1.85ml0.24mol/l酒石酸钠缓冲液(ph＝3.0)，和0.1ml24mmol/l藜芦醇和1.0ml酶液；(2)预热至37℃将溶液倒入比色皿，然后再添加0.05ml6.0mmol/l的h2o2启动反应，在波长为310nm下测定吸光值变化。3、计算方法酶活定义为每分钟氧化1μmol的藜芦醇为一个酶活单位，消光系数ε＝9.3*103[(mol/l)-1cm-1]。酶活单位：u/l过氧化物酶(lip)活力＝δod*106/δt*v酶液*∈＝(δod/δt)*106/1*9.3*103式中：δod-测定的相邻吸光度值差最大的值；δt-δod值对应的时间差值；v-酶液的体积。4.3锰过氧化物酶(mnp)活性的测定1、试剂(1)0.11mol/l的乳酸钠缓冲液：称取1.10098g乳酸和2.05516g乳酸钠，分别加去离子水100ml,向乳酸钠中加乳酸，调ph＝4.5；(2)0.025ml40mmol/l硫酸锰；(3)0.025ml1.6mmol/l的h2o2；2、操作步骤(1)根据酶在h2o2存在下把mn2+氧化mn3+的速度来决定；(2)总反应体积为1ml，向试管中加入0.85ml0.11mol/l的乳酸钠缓冲液(ph＝4.5)再加入0.025ml、40mmol/lmnso4和1ml的酶液；(3)预热37℃后，将溶液倒入比色皿，在比色皿中添加0.025ml1.6mmol/l的h2o2启动反应，在240nm下测定吸光值变化。3、计算方法酶活的定义为每分钟氧化1μmol的mn2+为mn3+为一个酶活单位，消光系数ε＝6.5*103[(mol/l)-1cm-1]。酶活单位：u/l锰过氧化物酶(mnp)活力＝δod*106/δt*v酶液*∈＝(δod/δt)*106/1*6.5*103式中：δod-测定的相邻吸光度值差最大的值；δt-δod值对应的时间差值；v-酶液的体积。4.4纤维素酶活性的测定1、试剂(1)0.1mol/l柠檬酸钠-柠檬酸钠缓冲液：分别称取2.941g柠檬酸钠和2.1014g柠檬酸，加去离子水100ml，向柠檬酸钠中加柠檬酸，用ph计调ph＝4.8；(2)1.5mldns；(3)葡萄糖标准液：1.0000g葡萄糖溶于1000ml的去离子水配制成1mg/ml的葡萄糖标准液。2、标准葡萄糖曲线制作取1mg/ml标准葡萄糖液各0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml于试管中，补加去离子水至2.0ml，再加入2.0mldns试剂，具塞，沸水浴10min，冷却后定容至15ml，用分光光度计在波长为550nm下测od值，3次重复实验，取均值制图，葡糖糖标准曲线参见图11。由光密度值引得葡萄糖量。3、操作步骤(1)向试管中加入1cm*2cm的whatmanno1定量试纸，再加入1.0cm柠檬酸钠-柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/l,ph＝4.8)以及0.5ml酶液；(2)在50℃下保温1h，然后取出加入1.5mldns终止反应，再废水浴5min后流水冷却，定容至25ml；(3)在540nm下测定其吸光度。4、计算方法纤维素酶活力＝y*1000ug/v酶液/t,其中y由标曲得到y＝0.6916x式中：x-测定的吸光度值；t-水浴的时间；v酶液-酶液的体积。4.5半纤维素酶活性测定1、试剂(1)1.8ml1％的木聚糖溶液：用木聚糖以ph＝4.8醋酸缓冲液配成1％溶液；(2)1.8ml醋酸缓冲液：称取0.82g乙酸钠，量取0.6ml乙酸，分别加去离子水100ml，向乙酸钠中加乙酸，调ph＝4.8；(3)2mldns；(4)木糖标准液：1.0000g木糖溶于1000ml的去离子水配制成1mg/ml的木糖标准液。2、木糖曲线制作取1mg/ml标准木糖液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml于试管中，补加去离子水至2.0ml，再加入2.0mldns试剂，具塞、沸水浴10min，冷却后定容至15ml，用分光光度计在波长为550nm下测od值，3次重复试验，取均值制图，木糖标准曲线参见图12。由光密度值引得木糖量。3、操作步骤(1)在15ml刻度试管中加入酶液0.2ml，再各吸取1.8ml1％的木聚糖溶液；(2)空白用0.2ml酶液加1.8ml醋酸缓冲液，不加木聚糖溶液，摇匀；(3)50℃水浴60min，取出后，再吸取2mldns试剂摇匀，具塞，立即沸水浴反应10min，冷却后，补加水定容到15ml，轻轻上下摇匀；(4)用空白调零点，于波长550nm下测吸光度。4、计算方法按照公式计算：半纤维素酶活力＝y*1000ug/v酶液/t,其中y由标曲得到y＝1.1504x+0.008；式中：x-测定的吸光度值；t-水浴的时间；v酶液-酶液的体积。5、结果表3bacilluslicheniformista65菌株产酶活性测定如表3所示，地衣芽孢杆菌a65产纤维素酶的活力最高，为851u/l，其次是锰过氧化物酶，其活力为264u/l，而漆酶、木质素过氧化物酶和半纤维素酶的活力分别为23u/l、44u/l和16u/l。实施例2：地衣芽孢杆菌a65(bacilluslicheniformis)的鉴定2.1实验主要仪器表4实验所用仪器2.2实验步骤2.2.1提取dnadna使用生工《ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒说明书》提取。具体操作步骤详见说明书。2.2.2pcr扩增使用2×estaqmastermix进行pcr扩增，反应体系如下：反应程序：2.2.3pcr产物电泳结果使用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳，电压120v，电泳30min，每孔上样1ul，电泳图谱见图13。如图13所示，pcr产物电泳结果表明成功扩增了细菌的16srdna片段。2.2.4测序及比对结果测序使用引物27f/1492r双向测序，地衣芽孢杆菌菌株ta65的序列如seq.1所示。在ncbi基因库进行blastn比对，得菌种鉴定结果，结果见表5。表5地衣芽孢杆菌菌株ta65鉴定数据由表5所示，菌株ta65与bacilluslicheniformis相似度达到99％，因此，将菌株命名为地衣芽孢杆菌a65(bacilluslicheniformis)。实施例3：含地衣芽孢杆菌菌株ta65的菌剂在促进堆肥腐熟中的应用3.1菌剂制备把ta65种子液按1％(v/v)的接种量，接种到1l灭菌后的lb培养液中，在摇床(50℃，120rmp)中培养24h，收集培养液即为菌剂。添加菌剂组为实验组(t)，空白组(ck)添加1l灭菌后的lb培养液。3.2堆肥实验堆肥原料选用牛粪和甘蔗叶，质量比17:3，共20kg。堆肥进行45d，分别在第0，5，10，16，23，30，45d取样，测定了温度，ph，含水率，有机质，凯氏氮，无机氮，dom含量等参数。整个堆肥过程接种菌剂两次，分别在0d和10d。堆体翻堆三次，分别是10d，20d和30d。3.3实验结果地衣芽孢杆菌ta65耐高温，增长繁殖快，且能够产木质纤维素降解酶。与不添加菌剂的堆肥相比(ck)，添加ta65菌剂的堆肥(t)具有以下优势：(1)堆肥过程的温度看，添加ta65菌剂的堆体温度比不添加菌剂的堆体温度高。有利于灭杀堆体中病原体及加速堆肥物料的高温降解，促进堆体腐熟(图1)。(2)由图2，图3可知，添加ta65菌剂的堆肥的ph升得更高，水分降得更快，即添加菌剂的堆体反应更加剧烈从而导致nh3大量挥发增加ph，产热更多带走大量的水分。(3)从有机质(om)的降解率看，不添加菌剂的om从90.38％下降到78.67，降解率为12.95％，添加ta65菌剂的om从90.00％下降到76.62％，降解率为14.87％(图4)。(4)从堆体可溶性有机物(dom)含量变化的角度看，不添加菌剂的dom含量由69.6mg/g下降到9.8mg/g，下降了85.9％，添加ta65菌剂的dom含量由75.6mg/g下降到9.7mg/g，下降了87.2％(图8)。综上所述，添加ta65菌剂能够提高堆肥温度，加速有机质降解和dom降解，提高凯氏氮的含量，促进堆肥腐熟。实施例4：地衣芽孢杆菌菌株ta65产表面活性剂情况由血琼脂平板和表面张力仪共同鉴定三株菌产表面活性剂情况。血琼脂平板制法：取营养琼脂(北京陆桥)，灭菌处理后，待其冷却至50℃左右，在无菌环境于每100ml营养琼脂加灭菌脱纤维绵羊血5-10ml，轻轻摇匀，立刻倾注于平板，制成斜面备用。发酵液表面张力测定：采用环法测定发酵液表面张力，采用全自动表面张力仪，仪器型号：bzy-1。实验证明，地衣芽孢杆菌菌株ta65能产生表面活性剂。前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。sequencelisting<110>广西大学<120>一种地衣芽孢杆菌菌株ta65及其在促进堆肥腐熟中的应用<130>zyws<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1450<212>dna<213>人工序列<400>1ccccgggcgctcctataatgcagtcgagcggaccgacgggagcttgctcccttaggtcag60cggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaa120accggggctaataccggatgcttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttt180tcgctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtggggtaacggctcac240caaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacg300gcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacg360gagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaaga420acaagtaccgttcgaacagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaa480ctacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcg540taaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggag600ggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcg660gtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaac720tgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgc780cgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgca840ttaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggg900cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggt960cttgacatcctctgacaaccctagagatagggcttccccttcgggggcagagtgacaggt1020ggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgc1080aacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaa1140accggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacac1200gtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaat1260ctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaa1320tcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaca1380ccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttggagccagccgccgaagg1440tgatcagagt1450当前第1页12