一类具有靛红片段的吡唑希夫碱衍生物用于抗肿瘤的药物及制备法的制作方法

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类具有靛红片段的吡唑希夫碱衍生物，它们的制备方法以及用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

背景技术：

吡唑类氮杂环一直是药物研究领域的重要方向之一，这是因为吡唑衍生物具有多种潜在的药理活性，如解热镇痛、降糖、抗菌、抗痉挛、镇静和抗心律失常等。此外，吡唑衍生物还具有一定的抗肿瘤活性，吡唑也是抗肿瘤阿西替尼、帕唑帕尼和依鲁替尼的核心结构片段。因此，近年来，人们合成了大量具有抗肿瘤活性的吡唑衍生物，经过药理活性筛选，发现一些具有深入研究价值的新型吡唑衍生物（Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 6893; Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 2101; Lett. Drug Des. Discov. 2014, 11, 1010）。

靛红又称为吲哚醌，是吲哚的二酮形式，具有潜在的抗肿瘤活性。靛红结构还存在于多种抗肿瘤药物中，如舒尼替尼等（Anticancer Agents Med. Chem. 2009, 9, 397）。此外，靛红还是中药活性有效成分靛玉红的核心结构，通过对晶体蛋白的研究表明，靛红基团对CDK和GSK-3等激酶氨基酸残基起到了重要的键合作用（J. Med. Chem. 2014, 57, 3715; Curr. Pharm. Design 2013, 19, 4755）。近年来，以靛红为抗肿瘤活性母核，人们对其进行了大量的结构衍生研究，如Dweedar等人设计并合成了一系列的靛红双酰腙的化合物，其对人乳腺癌MCF-7细胞具有显著的抗肿瘤活性，部分化合物的活性与阿霉素相当（Eur. J. Med. Chem. 2014, 78, 275）；Nasr等人设计并合成了一些香豆素-酰腙-靛红缀合物，部分化合物对人胰腺癌Panc-1细胞的活性强于阿霉素（Eur. J. Med. Chem. 2014, 76, 539）。这些研究结果表明，靛红药效团在抗肿瘤药物研发领域受到了广泛的关注，研究具有靛红结构的化合物将有助于抗肿瘤药物的发现。

利用药物化学领域的药效团杂合原理，将靛红和吡唑这两种具有抗肿瘤活性的药效团通过希夫碱进行缀合，得到了未见文献报道的具有靛红片段的吡唑希夫碱衍生物。

技术实现要素：

本发明公开式了一类通式（I）的化合物。药理实验显示，本发明物对人非小细胞肺癌A549细胞的体外增殖具有较强的抑制活性。流式细胞术检测结果表明，本发明物能够诱导A549肿瘤细胞凋亡。因此，本发明物能够用于预防或治疗细胞增殖异常相关疾病，尤其是用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

本发明的化合物通式（I）如下：

其中，R¹代表C2~C8烷烃、C4~C7脂肪环基、芳香基或5~6元杂环基；

R²代表C1~C9烷烃、C4~C6脂肪环基、C1~C5烷氧基、芳香基或5~6元杂环基；

R³代表H、腈基、卤素、硝基、三氟甲基、C1~C6烷基、C1~C4烷氧基、C4~C6脂肪环基或芳香基；

所述的芳香基是联苯基、萘基、苯基或取代苯基；其中所述的取代苯基含1~3个取代基，该取代基取自卤素、三氟甲基、腈基、硝基、C2~C4烷氧基、C1~C6烷基或C4~C6脂肪环基；

所述的5~6元杂环基含有1~3个选自氧、硫或氮的杂原子，能被苯基合并，并含有一个或多个选自硝基、三氟甲基、卤素、腈基或芳香基的取代基；

所述卤素为氟、氯、溴、碘。

根据本发明，药学上可接受的盐包括通式（I）化合物与下列酸形成的酸加成盐：氢溴酸、乙酸、马来酸、磷酸、硝酸、枸橼酸、甲酸、盐酸、柠檬酸、富马酸、甲磺酸、乳酸、琥珀酸、烟酸、酒石酸、碳酸或硫酸。

本发明所述的药物组合物，其中含有有效剂量本发明物或其药学上可接受的盐，剂型可以是酊剂、片剂、混悬剂、缓释剂、胶囊剂、凝胶剂、注射剂、栓剂、贴剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、微球剂、口服液或滴剂等制剂学上常规的剂型形式。

本通式（I）所示化合物的制备方法如下：

其中R¹、R²和R³的定义同上；

其中a代表反应条件：溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、正丁醇、叔丁醇或异丙醇；催化剂为硫酸、盐酸、醋酸、甲酸、磷酸、氨基磺酸或硝酸；反应温度为70~80℃。

其中，中间体（II）的制备方法可参照文献（Bioorganic & medicinal chemistry, 2007, 15, 6893; Chinese Journal of Organic Chemistry, 2007, 27, 1542）报道的方法，以乙酮类化合物（IV）为原料，合成方法如下：

药理活性实验证明，本发明物对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖具有显著的抑制作用，并诱导A549细胞凋亡。

以下是本发明部分化合物的药理活性测试方法及结果：

一、CCK-8法测试体外抗肿瘤活性

细胞株：人非小细胞肺癌A549细胞

阳性药：顺铂（DDP）

实验方法：

将处于对数生长期的肿瘤细胞消化、计数，接种于96 孔板中，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养24小时。根据组别设置加入含有测试药物的培养基，并设立溶媒组、阴性对照组和阳性对照组。在37℃，5%CO₂培养箱中培养72小时后，96 孔板每孔加入10 μL CCK-8 溶液，再孵化3 小时。用酶标仪在450 nm 处测定每孔的吸光度值(OD)，并计算抑制率。实验结果用SPSS17.0 计算得到半数抑制浓度值(IC₅₀)。

部分化合物体外抗肿瘤活性结果如下：

表1本发明部分化合物对A549细胞的体外抗增殖活性

结果表明，本发明物对A549细胞具有不同程度的抑制活性，其中化合物I-5和I-6的抗肿瘤活性最强，其IC₅₀值分别为30.418和29.695 μM，弱于阳性药顺铂。

二、流式细胞术检测细胞凋亡

细胞株：人非小细胞肺癌A549细胞

实验方法：

将A549细胞接种到6 孔板中，置于37℃，5%CO₂的培养箱中孵化24 h。再根据组别设置，加入含药培养基，并设立阴性对照组。药物作用48 h 后，加入500 μL Binding Buffer，再分别加入5 μL Annexin V-APC 以及5 μL 7-AAD，放置15 min。最后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

流式细胞术检测结果如下：

表2 细胞凋亡结果

实验结果表明，本发明物的抗肿瘤活性与诱导肿瘤细胞凋亡相关。

具体实施方式

仪器与试剂

熔点为SGWX-4 显微熔点仪，核磁共振仪为Agilent-NMR-vnmrs 400型，质谱仪为Agilent Accurate Mass Q TOF MS 6520型，其它所用试剂为分析纯。

下面的实施例用于具体说明本发明物的制备，但本发明并不局限于下列实施例。

实施例1：N'-(3-亚氨基-吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-1）的制备

将0.31 mmol 1-苄基-3-( 4-甲氧基苯基) 吡唑-5-甲酰肼（II-1） 和0.31 mmol 靛红（III-1） 加入到25 mL 的圆底烧瓶中，加入5 mL 乙醇和1 滴浓硫酸，N₂ 保护下78℃反应4~5 h。冷却，抽滤，滤饼用冰乙醇洗涤3 次，真空干燥，得到黄色固体N'-(3-亚氨基-吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-1），收率89%。

m.p. 297~299 ℃; ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 13.77 (s, 1H), 11.38 (s, 1H), 7.78 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.39~7.21 (m, 7H), 7.10 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 6.96 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.78 (s, 2H), 3.78 (s, 3H); ¹³C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 163.34, 159.83, 150.07, 143.08, 137.83, 132.53, 128.98, 127.74, 127.15, 124.84, 123.28, 121.55, 120.02, 114.71, 111.76, 55.61, 54.67; HR-MS calcd for C₂₆H₂₂N₅O₃ [M + H]⁺ 452.1717, found 452.1720.

实施例2：N'-(3-亚氨基-4-氯吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-2）的制备

将4-氯靛红代替靛红，按实施例1所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例1，得到黄色固体N'-(3-亚氨基-4-氯吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-2），收率93%。

m.p. 281~283 ℃; ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 13.96 (s, 1H), 11.59 (s, 1H), 7.75 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.38~7.24 (m, 6H), 7.14 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.79 (s, 2H), 3.77 (s, 3H); ¹³C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 162.82, 159.80, 144.35, 137.93, 128.96, 127.94, 127.66, 126.98, 124.92, 124.27, 117.01, 114.74, 110.46, 55.62, 54.85; HR-MS calcd for C₂₆H₂₁ClN₅O₃ [M + H]⁺ 486.1327, found 486.1331.

实施例3：N'-(3-亚氨基-4-溴吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-3）的制备

将4-溴靛红代替靛红，按实施例1所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例1，得到黄色固体N'-(3-亚氨基-4-溴吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-3），收率95%。

m.p. 272~274 ℃; ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 13.96 (s, 1H), 11.57 (s, 1H), 7.76 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.32~7.24 (m, 8H), 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.95 (s, 1H), 5.78 (s, 2H), 3.77 (s, 3H); ¹³C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 162.87, 159.80, 144.54, 137.94, 133.24, 128.96, 127.94, 127.65, 127.47, 127.02, 124.92, 118.68, 114.73, 110.88, 55.62, 54.81; HR-MS calcd for C₂₆H₂₁BrN₅O₃ [M + H]⁺ 530.0822, found 530.0824.

实施例4：N'-(3-亚氨基-5-氯吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-4）的制备

将5-氯靛红代替靛红，按实施例1所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例1，得到黄色固体N'-(3-亚氨基-5-氯吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-4），收率92%。

m.p. 310~312 ℃; ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 13.70 (s, 1H), 11.49 (s, 1H), 7.79 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.56 (s, 1H), 7.45 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 6.99 (t, J = 9.2 Hz, 3H), 5.78 (s, 2H), 3.78 (s, 3H); ¹³C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 163.16, 159.85, 150.10, 141.76, 137.79, 131.90, 128.98, 128.01, 127.74, 127.37, 127.17, 124.79, 121.77, 121.07, 114.71, 113.31, 55.63, 54.73; HR-MS calcd for C₂₆H₂₁ClN₅O₃ [M + H]⁺ 486.1327, found 486.1328

实施例5：N'-(3-亚氨基-6-氯吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-5）的制备

将6-氯靛红代替靛红，按实施例1所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例1，得到黄色固体N'-(3-亚氨基-6-氯吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-5），收率88%。

m.p. 278~279 ℃; ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 13.65 (s, 1H), 11.53 (s, 1H), 7.78 (s, 2H), 7.58 (s, 1H), 7.31~7.00 (m, 10H), 5.78 (s, 2H), 3.78 (s, 3H); ¹³C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 163.34, 159.85, 150.10, 144.25, 137.80, 136.54, 128.98, 128.01, 127.73, 127.17, 124.80, 123.18, 122.96, 114.72, 111.82, 55.63, 54.71; HR-MS calcd for C₂₆H₂₀ClN₅NaO₃ [M + Na]⁺ 508.1147, found 508.1146.

实施例6：N'-(3-亚氨基-6-溴吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-6）的制备

将6-溴靛红代替靛红，按实施例1所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例1，得到黄色固体N'-(3-亚氨基-6-溴吲哚-2-酮)-1-苯甲基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼（I-6），收率97%。

m.p. 274~275 ℃; ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 13.65 (s, 1H), 11.51 (s, 1H), 7.78 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.30~7.22 (m, 7H), 7.12 (s, 1H), 7.01 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 5.78 (s, 2H), 3.78 (s, 3H); ¹³C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ: 163.21, 159.85, 150.10, 144.29, 137.79, 128.98, 128.01, 127.72, 127.17, 126.05, 125.16, 123.13, 119.34, 114.72, 114.56, 55.63, 54.69; HR-MS calcd for C₂₆H₂₁BrN₅O₃ [M + H]⁺ 530.0822, found 530.0821。