本发明涉及一种番茄黑环病毒rt-lamp检测用的试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
番茄黑环病毒tomatoblackringnepovirus，tbrv，属于豇豆病毒花叶科comoviridae线虫传多面体病毒属nepovirus，包括很多的株系：烟草黑环株系tobaccoblackringstrain；莴苣环斑株系lettuceringspotstrain；马铃薯花束株系potatobouquetstrain；马铃薯伪奥古巴株系potatopseudo-aucubastrain；甜菜环斑株系beetringspotstrain；芹菜黄脉株系celeryyellowveinstrain，这些株系不能通过寄主植物的症状来有效区分，但可以通过血清学和介体关系来区分。
tbrv主要发生在欧洲，现分布在全球30多个国家和地区。据报道tbrv的寄主范围很广，能够广泛侵染单子叶和双子叶草本和木本植物，包括许多重要的经济作物，如葡萄和其他果树、甜菜、马铃薯和蔬菜以及观赏植物，还能侵染乔木和灌木以及一些杂草品种，可造成这些植物的严重危害。据了解，番茄黑环病毒在美国、土耳其、加拿大、英国、德国、意大利、法国、荷兰等国虽有分布，但因该病毒的危害性较大，这些国家在各自的进境检疫法规中都明确规定为检疫性有害生物。
该病毒的传播途径很多，可以接触传毒、种子带毒和线虫传毒。据文献记载超过15个属24种以上的植物可以tbrv种传，许多植物的种传率超过10％，甚至达到100％。如研究发现甜菜、黄豆、莴苣和番茄的种传效率分别是3-7，83，3和20％。由于病毒在线虫介体中仅保持数周，tbrv的种传在病害流行病学中占有重要地位。可见线虫介体只能短距离传播，被害的植物种子和其它繁殖材料可以进行远距离的传播。因此植物种子和种球苗木是tbrv在国际间进行传播和扩散的重要根源。
随着我国加入wto，国际贸易越来越频繁，尤其是上海作为我国十分重要的口岸城市，每年进口大量的花卉、林木和蔬菜的种子和苗木，且进口的数量和品种有逐年增多的趋势。tbrv为我国进境检疫法规中明确规定的危险性有害生物，寄主范围广、传播途径多、适生性强，进口植物种子苗木携带该病毒的风险性很大，伴随着我国进出境贸易的高速增长，传入我国并危害流行的可能性极大。因而，必须对此病毒引起高度重视，研究准确可靠快速的检测方法，以防止tbrv随种苗的国际贸易传入我国，引起农作物、花卉和蔬菜生产的巨大损失。
目前，国内针对tbrv的检测方法研究较少，采用的检测手段主要是血清学方法，因为tbrv具有多个血清型突变株和分离物，常规的血清学方法由于其灵敏度较低和特异性较差，仅靠此单一的方法大大限制了对该病毒的检测，并可能出现漏检的现象。国外学者采用免疫捕获反转录pcr的方法检测到黄瓜上的tbrv，但尚未见到系统的分子生物学方法检测tbrv的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，番茄黑环病毒检测用的试剂盒；
本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测番茄黑环病毒的方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种番茄黑环病毒rt-lamp检测用的试剂盒，其特征在于包括以下组分：
引物f3：
tgttgagataaccgatctga
引物b3：
atagcaaaccaaggaaaagg
引物fip：
ctatatttcgctgcgggacc-aataactcaactttcttctagagtg
引物bip：
agtttaggtttaatttctgcagggt-acaaaccttgattatcgcca。
如上所述的一种番茄黑环病毒rt-lamp检测用的试剂盒，其特征在于所述引物fip和引物bip的浓度均为40pmol/μl。
如上所述的一种番茄黑环病毒rt-lamp检测用的试剂盒，其特征在于所述引物f3和引物b3浓度均为10pmol/μl。
一种番茄黑环病毒rt-lamp鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
a、植物组织总dna提取；
b、lamp检测：
采用权利要求所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的dna5μl，使总量达到25μl；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μl；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的dna5μl；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应60min，最后80℃下保温5min以结束反应；
c、lamp结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有番茄黄化曲叶病毒；若与阴性对照一样未发出荧光，则判定样品中没有携带番茄黄化曲叶病毒。
如上所述的鉴定方法，其特征在于步骤a中植物组织总dna提取的具体步骤：
a.取0.1g植物组织置于液氮中研磨，时间尽量短，保持研钵中有液氮；
b.转移样品到1.5mlrnasefree离心管中，加入1ml的pl裂解液颠倒混匀，65℃条件下进行孵育5min，使核蛋白体分解完全；
c.室温条件下12000rpm离心10min后，取上清转入新的rnasefree过滤柱中；
d.10000rpm离心45s，收集下滤液于收集管中，进行下一步的操作；
e.收集管中加入1倍体积的70％乙醇，颠倒进行混匀，得到的溶液以及沉淀一起转移到吸附柱ra中，量太多可分次进行过柱；
f.10000rpm下离心45s，弃掉废液后，重新将吸附柱放回收集管中；
g.加入500μl去蛋白液re，12000rpm下离心45s，废液弃掉；
h.加入700μl漂洗液rw，12000rpm下离心60s，废液弃掉；
i.加入500μl漂洗液rw，12000rpm下离心60s，废液弃掉；
j.将吸附柱ra重新放回收集管中，12000rpm离心2min，除去漂洗液，以免抑制下游反应；
k.取出吸附柱ra，取一个新的rnasefree离心管中放入，根据所预期基因组和rna的产量在吸附膜中间部位加50-80μlrnasefreewater，室温下放置2min后12000rpm离心1min。
综上所述，本发明的有益效果：
本发明tbrvrt-lamp检测方法，在27min时即可检测到tbrv的扩增，配合植物基因组rna快速提取试剂盒，从核酸的提取到完成整个lamp结果的检测只需1.5h左右，检测结果直观、简便且准确性高。在灵敏度检测方面，本论文建立的tbrv的lamp方法比pcr方法至少高1000倍，表明lamp方法具有较高的灵敏度。在特异性方面，结果表明lamp方法能够准确的检测到tbrv并产生扩增，而其他同属的病毒和健康样品均未发生扩增，具有良好的特异性。因此，本发明成功建立了tbrv的lamp特异检测方法。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
一种番茄黑环病毒rt-lamp检测用的试剂盒，包括以下组分：
引物f3：
tgttgagataaccgatctga
引物b3：
atagcaaaccaaggaaaagg
引物fip：
ctatatttcgctgcgggacc-aataactcaactttcttctagagtg
引物bip：
agtttaggtttaatttctgcagggt-acaaaccttgattatcgcca。
实施例2
一种番茄黑环病毒rt-lamp检测用的试剂盒，包括以下组分：
引物f3：
tgttgagataaccgatctga
引物b3：
atagcaaaccaaggaaaagg
引物fip：
ctatatttcgctgcgggacc-aataactcaactttcttctagagtg
引物bip：
agtttaggtttaatttctgcagggt-acaaaccttgattatcgcca。
所述引物fip和引物bip的浓度均为40pmol/μl。
所述引物f3和引物b3浓度均为10pmol/μl。
实施例3
一种番茄黑环病毒rt-lamp鉴定方法，包括以下步骤：
a、植物组织总dna提取；
a.取0.1g植物组织置于液氮中研磨，时间尽量短，保持研钵中有液氮；
b.转移样品到1.5mlrnasefree离心管中，加入1ml的pl裂解液颠倒混匀，65℃条件下进行孵育5min，使核蛋白体分解完全；
c.室温条件下12000rpm离心10min后，取上清转入新的rnasefree过滤柱中；
d.10000rpm离心45s，收集下滤液于收集管中，进行下一步的操作；
e.收集管中加入1倍体积的70％乙醇，颠倒进行混匀，得到的溶液以及沉淀一起转移到吸附柱ra中，量太多可分次进行过柱；
f.10000rpm下离心45s，弃掉废液后，重新将吸附柱放回收集管中；
g.加入500μl去蛋白液re，12000rpm下离心45s，废液弃掉；
h.加入700μl漂洗液rw，12000rpm下离心60s，废液弃掉；
i.加入500μl漂洗液rw，12000rpm下离心60s，废液弃掉；
j.将吸附柱ra重新放回收集管中，12000rpm离心2min，除去漂洗液，以免抑制下游反应；
k.取出吸附柱ra，取一个新的rnasefree离心管中放入，根据所预期基因组和rna的产量在吸附膜中间部位加50-80μlrnasefreewater，室温下放置2min后12000rpm离心1min。
b、lamp检测：
采用权利要求所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的dna5μl，使总量达到25μl；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μl；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的dna5μl；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应60min，最后80℃下保温5min以结束反应；
c、lamp结果判断
扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有番茄黄化曲叶病毒；若与阴性对照一样未发出荧光，则判定样品中没有携带番茄黄化曲叶病毒。
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<110>陈,定虎
<120>番茄黑环病毒rt-lamp检测用的试剂盒及检测方法
<130>番茄黑环病毒rt-lamp检测用的试剂盒及检测方法
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