一种三重RT‑PCR特异性扩增引物组及三重鉴定的RT‑PCR检测方法与流程

本发明属于动物病毒病诊断技术领域，具体涉及一种三重rt-pcr特异性扩增引物组以及利用该引物组同时快速鉴定h6亚型及两种不同na亚型aiv的三重rt-pcr检测方法。

背景技术：

h6亚型aiv同样在世界范围内流行较为广泛。h6亚型aiv最初在1965年分离自美国的火鸡，随后相继在野鸟、水禽和陆禽中分离到。欧洲和美国的流行病学监测显示，h6亚型aiv是监测中分离率较高的亚型之一，同时相对于其他亚型的aiv有更广的宿主范围。虽然h6亚型aiv感染水禽后仅引起亚临床症状，但是鸡感染该亚型病毒后会伴随产蛋下降、上呼吸道感染以及增加鸡群的发病率和死亡率。多个研究显示，某些h6亚型aiv可以感染小鼠和雪貂，并引起发病。有报道2013年我国台湾省出现一例人感染h6n1的病例；wang等人报道，近年我国南方地区分离的h6亚型aiv已经具备在豚鼠上的水平传播能力，这些研究报道均显示该亚型对公共卫生安全的威胁日益增大。

2013年5月，中国台湾报道了一例人感染h6n1亚型aiv的病例，这也是全球范围内首次出现人感染h6亚型aiv的事件，引起各界的高度重视。因此，对h6亚型aiv的及时、快速、准确诊断方法的建立非常必要。目前，针对h6亚型aiv的检测方法较少，应用较多的鉴定方法是病毒的分离测序、血凝抑制试验、神经氨酸酶试验等常规方法，这些实验虽然准确率高，但是耗时长、费用高，无法满足疫病暴发时对疫病快速、及时诊断的要求；而且这些检测方法存在共同的问题是只能确定该病毒是否是h6亚型aiv，不能确定是h6n1还是h6n2亚型aiv。

因此，流行病学调查和疫病现场诊断上迫切需要一种能够快速、准确的鉴别h6n1和h6n2亚型aiv的检测方法。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供一种同时鉴定h6亚型及两种不同na亚型aiv的rt-pcr检测引物组及相应检测方法。本发明的引物组和检测方法可以一次检测中确定h6n1或h6n2亚型aiv。不但能够确定病毒是否是h6亚型aiv，还能够确定是n1或n2亚型aiv，而且对当前流行毒株具有很好的针对性。

具体而言，本发明采用以下技术方案来解决：

一种三重rt-pcr特异性扩增引物组，其特征在于，所述三重rt-pcr特异性扩增引物组用于快速鉴定h6亚型及两种不同na亚型aiv，所述三重rt-pcr特异性扩增引物组包括三组引物对。

在一种优选实现方式中，所述三组引物对为：第一引物对a、第二引物对b和第三引物对c，所述第一引物对a包括a1-up和a1-low，所述第二引物对b包括b1-up和b1-low，所述第三引物对c包括：c1-up和c1-low。

另一方面，本发明提供一种快速鉴定h6亚型及两种不同na亚型aiv的三重rt-pcr检测方法，包括下述步骤：

(1)获取目标样品；

(2)从目标样品中提取病毒rna；

(3)以所提取的病毒rna为模板，加入通用引物反转录出cdna；

(4)以所获得的cdna为模板加入权利要求1或2中所述的引物对进行pcr扩增；扩增后利用琼脂糖凝胶电泳法分析，确定其病毒的类型。

在一种优选实现方式中，所述的三重rt-pcr特异性扩增引物组a、b和c在用于pcr的试剂中的用量分别为浓度20pm的a1-up和浓度20pm的a1-low各0.5μl、浓度20pm的b1-up和浓度20pm的b1-low各0.5μl、浓度20pm的c1-up和浓度20pm的c1-low各0.5μl。

在一种优选实现方式中，rt-pcr扩增的反应体系为20μl：5×buffer4μl，2.5mmdntp1μl，rtaq酶0.5μl，cdna1μl，浓度20pm的a1-up和浓度20pm的a1-low各0.5μl、浓度20pm的b1-up和浓度20pm的b1-low各0.5μl、浓度20pm的c1-up和浓度20pm的c1-low各0.5μl，用去离子水补至20μl。

在一种优选实现方式中，rt-pcr扩增的反应程序为：

在一种优选实现方式中，所述方法还包括基于pcr产物中dna序列的长度确定是否存在h6n1和h6n2亚型aiv。

更优选地，

所述第一引物对a包括：a1-up：aaatgggatatgttacccag；和a1-low：aayttgtawgcataccaagg；

所述第二引物对b包括：b1-up：atcaagagttggaggaataa；和b1-low：tgctcccactagtccaaatt；

所述第三引物对c包括：c1-up：gcycctttctccaaggacaa；c1-low：cgtcattactaccgcacaag。

本发明的有益效果是：

(1)本发明针对我国目前流行的h6亚型和两种不同na亚型的aiv基因序列特点设计了特异性的引物，具有特异性强的特点，除了h6亚型及n1、n2两种不同na亚型aiv能检测出来，h2n3、h4n6、h8n4、h10n3等亚型流感病毒均为阴性，新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒等均为阴性；本发明对检测方法进行深入优化，具有灵敏度高的特点，通过对样品倍比稀释进行灵敏度检测得出检测的最低浓度为10°eid50/100μl；具有重复性好的特点，同一样品在同一反应条件下重复三次作为同一批次内重复试验，不同样品在同一反应条件下重复一次作为不同批次间重复试验，试验结果相同。

(2)本发明弥补现有禽流感病毒学鉴定和诊断的技术不足，现有的检测方法只能确定该病毒是否是h6亚型aiv，不能确定是h6n1还是h6n2亚型aiv。本发明建立快速鉴定h6亚型及两种不同na亚型禽流感病毒的三重rt-pcr检测方法，达到可以同时快速诊断和鉴别h6n1或h6n2亚型aiv的目的。与传统检测方法相比，本发明实现了对同一样品同时进行多种不同目的基因的检测，样品用量少，操作简单，时间短，成本低，需要检测仪器简便，完全可以在基层实验室推广使用。

附图说明

图1为三重rt-pcr检测方法的特异性检测电泳图；

图2为h6n1亚型aiv的灵敏度检测电泳图；

图3为h6n2亚型aiv的灵敏度检测电泳图；

图4为三重rt-pcr检测方法对临床样品检测电泳图。

具体实施方式

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导。下述实施例中所用的病毒、试剂、耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1：pcr引物对设计

根据实验室已保存的h6n1和h6n2亚型aiv序列，设计了上千组引物序列的组合，最终找到了一种能够同时鉴别h6亚型及两种不同na亚型aiv的快速及准确的特异性检测引物组。

该引物组包括3对特异性引物，分别为引物对a1-up和a1-low、引物对b1-up和b1-low、引物对c1-up和c1-low，其核苷酸序列如下所示：

表1

实施例2：三重rt-pcr检测方法的建立及条件优化

一、病毒总rna提取

选取实验室保存的h6n1、h6n2亚型aiv，分别提取病毒总rna。

1、取病毒液250μl，加入750μltrizol，混匀，室温静置5min；

2、加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温静置5min；

3、于4℃下12000转/min，离心15min；

4、将上清液吸取到新的离心管中，加入500μl异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置20min；

5、于4℃下12000转/min，离心20min；

6、弃上清液，用75％乙醇1000μl洗一次

7、于4℃下12000转/min，离心10min；

8、弃上清液，自然晾干后加入20μl无rna酶水，将病毒rna溶解。

二、rna反转录为cdna

反应体系为20μlrna(上面步骤一中所获得的病毒rna)加入2μl通用引物，于70℃水浴锅5min，冰水浴5min后，加入5×buffer8μl，dntpmixture4μl，rnaseinhibitor1μl，反转录酶1μl，加入rnasefreeh2o定容至40μl，于42℃反应1h。

三、加入上面本发明所找到的特异性扩增引物进行pcr检测

1、三重rt-pcr反应体系优化

三重rt-pcr反应体系为20μl，5×buffer4μl，2.5mmdntp1μl，rtaq酶0.5μl，cdna1μl，a1-up(浓度为20pm)和a1-low(浓度为20pm)各0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl或1μl，b1-up(浓度为20pm)和b1-low(浓度为20pm)各0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl或1μl，c1-up(浓度为20pm)和c1-low(浓度为20pm)各0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl或1μl，用去离子水补至20μl。

2、三重rt-pcr反应程序优化

三重rt-pcr反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s；50-60℃(设置梯度50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃)退火40s；72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃终延伸5min。

3、取pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并在紫外光下拍照，分析记录结果。

四、结果判定方法及分析

h6的特异性扩增引物的扩增产物大小为494bp，若待检样品中含有500bp左右的dna片段，则此浓度的引物或退火温度能够扩增h6，反之则此浓度的引物或退火温度不能扩增h6；n1的特异性扩增引物的扩增产物大小为712bp，若待检样品中含有700bp左右的dna片段，则此浓度的引物或退火温度能够扩增n1，反之则此浓度的引物或退火温度不能扩增n1；n2特异性扩增引物的扩增产物大小为404bp，若待检样品中含有400bp左右的dna片段，则此浓度的引物或退火温度能够扩增n2，反之则此浓度的引物或退火温度不能扩增n2。

结果表明，实施例1中的引物对a可以用于鉴定h6基因，引物对b可以用于鉴定n1基因，引物对c可以用于鉴定n2基因。最佳反应体系(20μl)：20μl，5×buffer4μl，2.5mmdntp1μl，rtaq酶0.5μl，cdna1μl，a1-up(浓度为20pm)和a1-low(浓度为20pm)各0.5μl，b1-up(浓度为20pm)和b1-low(浓度为20pm)各0.5μl，c1-up(浓度为20pm)和c1-low(浓度为20pm)各0.5μl，用去离子水补至20μl。三重rt-pcr最佳反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火40s；72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃终延伸5min。

实施例3：rt-pcr检测方法的特异性检测

一、总rna提取

选取实验室保存的h6n1、h6n2、h2n3、h4n6、h8n4、h10n3亚型流感病毒，新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒，分别提取病毒总rna。方法同实施例2。

二、rna反转录为cdna

方法同实施例2。

三、三重rt-pcr检测

1、样品的组成

由h6n1和h6n2亚型aiv的cdna溶液(体积比为1:1)组成混合溶液、h6n1亚型aiv的cdna溶液、h6n2亚型aiv的cdna溶液、h2n3亚型aiv的cdna溶液、h4n6亚型aiv的cdna溶液、h8n4亚型aiv的cdna溶液、h10n3亚型aiv的cdna溶液、新城疫病毒cdna溶液、传染性喉气管炎病毒cdna溶液、传染性支气管炎病毒cdna溶液、去离子水。

2、加入特异性扩增引物进行pcr检测

用到的特异性引物对a、b和c。反应体系和反应程序同优化的实施例2。

四、电泳

取pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，对图1进行分析，泳道1为混合溶液，泳道2为h6n1亚型aiv的cdna溶液，泳道3为h6n2亚型aiv的cdna溶液，泳道4为h2n3亚型aiv的cdna溶液，泳道5为h4n6亚型aiv的cdna溶液、泳道6为h8n4亚型aiv的cdna溶液、泳道7为h10n3亚型aiv的cdna溶液、泳道8为新城疫病毒cdna溶液、泳道9为传染性喉气管炎病毒cdna溶液、泳道10为传染性支气管炎病毒cdna溶液、泳道11为去离子水。在紫外线下拍照后，将目的片段切割后送至测序公司测序。

结果分析，h6n1和h6n2亚型aiv样品处有三条大小分别为700bp、500bp和400bp的条带，h6n1亚型aiv样品处有两条大小为700bp和500bp的条带，h6n2亚型aiv样品处有两条大小为500bp和400bp的条带，其他病毒样品和阴性对照处均无pcr产物条带。对目的片段测序，对序列结果分析显示与引物设计模板的基因对应片段完全一致。结果表明，本发明的检测方法对h6亚型和n1、n2两种不同na亚型aiv特异性很好，可以特异检测出该亚型的禽流感病毒。

实施例4：rt-pcr检测方法的灵敏度检测

一、rt-pcr检测方法对h6n1亚型aiv的灵敏度检测

1、h6n1亚型aiv各种稀释液的制备

取h6n1亚型aiv测定病毒含量eid50，将病毒稀释为10⁶eid50/100μl，在此基础上进行10倍倍比稀释，使各稀释液的病毒含量分别为10⁵eid50/100μl、10⁴eid50/100μl、10³eid50/100μl、10²eid50/100μl、10¹eid50/100μl、10⁰eid50/100μl、10^-1eid50/100μl。选择10⁴eid50/100μl-10^-1eid50/100μl区间检测rt-pcr检测方法的灵敏性。

2、总rna提取

取10⁴eid50/100μl-10^-1eid50/100μl共5个区间样品稀释液，分别提取总rna，方法同实施例2。

3、rna反转录为cdna

方法同实施例2。

4、加入特异性扩增引物进行pcr检测

用到的特异性扩增引物对a和b。反应体系和反应程序同优化的实施例2。

5、电泳

取pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，对图2进行分析，h6n1亚型aiv的样品稀释液在10⁰eid50/100μl及以上病毒稀释液可以观察到两条大小分别在500bp和700bp左右的条带。结果表明，检测方法对h6n1亚型禽流感病毒的检测灵敏度可达到10⁰eid50/100μl。

二、rt-pcr检测方法对h6n2亚型禽流感病毒的灵敏度检测

1、h6n2亚型aiv各种稀释液的制备

h6n2亚型aiv的稀释方法同步骤一中的1。

2、总rna提取

取10⁴eid50/100μl-10^-1eid50/100μl共5个区间样品稀释液，分别提取总rna，方法同实施例2。

3、rna反转录为cdna

方法同实施例2。

4、加入特异性扩增引物进行pcr检测

用到的特异性引物对a和c。反应体系和反应程序同优化的实施例2。

5、电泳

取pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3所示，对图3进行分析，h6n2亚型aiv的样品稀释液在10⁰eid50/100μl及以上病毒稀释液可以观察到两条大小分别在500bp和400bp左右的条带。结果表明，检测方法对h6n2亚型禽流感病毒的检测灵敏度可达到10⁰eid50/100μl。

实施例5：待检病料(病禽的喉拭子和泄殖腔拭子)中h6亚型禽流感病毒的rt-pcr检测

1、样品的制备

采集病禽的喉拭子和泄殖腔拭子共50份，将拭子浸润到pbs缓冲液中，在振荡器上充分混匀，离心，将上清液转移至无菌的离心管中，编号a1-a50备用。

2、总rna提取

取250μl上清液，加入750μltrizol，提取病毒总rna，方法同实施例2。

3、rna反转录为cdna

方法同实施例2。

4、加入扩增引物进行pcr检测

用到的特异性引物对a、b和c。反应体系和反应程序同优化的实施例2。

5、电泳

随机选取12份pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测出来1份样品为h6n1和h6n2亚型aiv阳性，4份样品为h6n1亚型aiv阳性，2份样品为h6n2亚型aiv阳性。这一实验结果与实验室的血清学结果一致。同时，将扩增的目的片段送到测序公司进行测序，测序结果与rt-pcr结果一致。

琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图4，m为marker，泳道1为编号a8的样品，扩增出三条条带，大小分别为712、494和404bp，显示流感病毒同时含有h6n1和h6n2亚型aiv；泳道2-4和泳道6为编号a9、a10、a12和a33的样品，扩增出大小为712和494bp的两条条带，显示这4株病毒为h6n1亚型aiv；泳道5和6为编号a38和a40的样品，扩增出大小为494和404bp的两条条带，显示这2株病毒为h6n2亚型aiv。结果表明，利用本发明的三重rt-pcr可以准确鉴定h6亚型和n1、n2两种不同na亚型的aiv。

此外，本申请的发明人还从几百种引物中找到了几组对h6n1和h6n2亚型aiv也具有一定检测能力的引物组，这些引物对相对于所筛选掉的引物对而言是具有一定检测能力的，但检测的灵敏度和特异性却远非上面的实施例可比。

表2

表3

表4

采样常规的pcr检测方式和上述实施例1-5中的检测方式，申请人分别对表2-4中的多对引物进行不同的排列组合，然后分别进行rt-pct检测，但是引物对a2-up和a2-low、a4-up和a4-low、b2-up和b2-low、c3-up和c3-low、c4-up和c4-low的检测灵敏度最低分别为10³eid50/100μl、10²eid50/100μl、10²eid50/100μl、10²eid50/100μl、10³eid50/100μl。引物对a3-up和a3-low、b3-up和b3-low、c2-up和c2-low虽然检测灵敏度可以达到10⁰eid50/100μl，但是特异性极差。引物对a3-up和a3-low同时检测h6和h4亚型，引物对b3-up和b3-low、c2-up和c2-low同时检测n1和n2亚型。因此，这些引物对出在灵敏度或特异性上无法达到本发明引物的灵敏度或特异性。

应当理解这里描述的具体实施方式只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110>聊城大学

<120>一种三重rt-pcr特异性扩增引物组及三重鉴定的rt-pcr检测方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(man-made)

<400>1

aaatgggatatgttacccag20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(man-made)

<400>3

aayttgtawgcataccaagg20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(man-made)

<400>3

atcaagagttggaggaataa20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(man-made)

<400>4

tgctcccactagtccaaatt20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(man-made)

<400>5

gcycctttctccaaggacaa20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(man-made)

<400>6

cgtcattactaccgcacaag20