本发明属于制药领域，提供一类吉西他滨磷酸酯的n-甲酸酯乏氧活化前药及其应用。
背景技术：
：吉西他滨是一种核苷类抗肿瘤药物，该类药物的作用机理为拮抗核苷酸代谢，在体内经细胞内三磷酸化后，通过抑制脱氧核苷三磷酸(dntps)的合成、掺入dna或rna分子中干扰细胞复制、竞争性抑制dna聚合酶等作用，特异性干扰核酸的代谢，阻止细胞的分裂和繁殖，最终导致肿瘤细胞死亡。吉西他滨进入体内后，被脱氧胞苷脱氨酶在肝脏、肾脏、血液和其他组织中快速而完全代谢，转化为无活性的代谢产物2’-脱氧-2’,2’-二氟尿苷。将核苷类抗肿瘤药物的氨基酰化，可以延缓药物被脱氧胞苷脱氨酶的代谢，如阿糖胞苷(cytarabine)的氨基酰化获得的衍生物依诺他滨(enocitabine)，抗肿瘤作用比阿糖胞苷强而且持久。但是，氨基酰化不能减少药物对正常组织的毒副作用。核苷类抗肿瘤药物容易发生耐药，其磷酸酯前药能够减少耐药发生，具有良好的抗肿瘤作用，其中吉西他滨磷酸酯前药nuc-1031已经进入临床研究(journalofmedicinalchemistry2014，57，1531-1542)。但是吉西他滨磷酸酯前药不能延缓其被脱氧胞苷脱氨酶的代谢，也不能减少药物对非肿瘤组织的毒副作用。吉西他滨磷酸酯前药氨基酰化(wo2015/134334)能够延缓药物被脱氧胞苷脱氨酶的代谢，仍然无法减少药物对非肿瘤组织的毒副作用。随着肿瘤的快速生长，部分肿瘤组织离最近的血管越来越远，氧供应不足，导致肿瘤乏氧(naturereviewcancer2002,2:38-47)。传统的抗肿瘤药物对血管附近的肿瘤有良好的杀伤力，但对乏氧区域的肿瘤作用有限。肿瘤乏氧活化前药能够特异性地在肿瘤乏氧区域释放抗肿瘤活性成分，从而杀伤乏氧区域肿瘤(chinesejournalofcancer2014,33:80-86)。乏氧活化前药具有肿瘤靶向性，从而具有更好的安全性，与传统的抗肿瘤药联合使用时抗肿瘤效果更加出色。其中th302已经进入临床研究，对胰腺癌等具有良好的治疗作用(journalofclinicaloncology2015，33，1475-1482)。中国发明201610649914.x公布了吉西他滨protide乏氧活化前药及其应用，在吉西他滨磷酸酯的侧链上引入乏氧活化基团，使药物产生乏氧活化选择性，减少对正常组织的毒副作用。但是仍然不能延缓药物被脱氧胞苷脱氨酶的代谢。本发明获得的吉西他滨磷酸酯的n-甲酸酯乏氧活化前药，将吉西他滨磷酸酯氨基酰化，能够延缓药物被脱氧胞苷脱氨酶的代谢，增加药物作用时间，减小药物剂量。并且氨基酰化过程中引入了乏氧活化基团，在正常氧环境下具有较小的细胞毒性，在乏氧条件下，具有较大的细胞毒性，因此，能够特异性的对肿瘤乏氧区域的肿瘤发挥抗肿瘤作用，减少对其他组织的毒副作用，对肿瘤具有优异的抗癌作用和良好的安全性，可用于制备治疗肿瘤的药物。技术实现要素：解决的技术问题：本发明提供一类吉西他滨磷酸酯衍生物的n-甲酸酯乏氧活化前药及其应用。该类药物能够延缓药物被脱氧胞苷脱氨酶的代谢，增加药物作用时间，减小药物剂量，并且在正常氧环境下具有较小的细胞毒性，在乏氧条件下具有更强的细胞毒性，可用于制备治疗肿瘤的药物。技术方案：一类吉西他滨磷酸酯的n-甲酸酯乏氧活化前药，结构符合通式(i)其中：r为：a为其中r’为异丙基或苄基，ar为苯基或邻甲基苄基。一类吉西他滨磷酸酯的n-甲酸酯乏氧活化前药，具体化学结构如以下式1-6所示：上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。治疗肿瘤药物，有效成分为上述化合物或其药学上可接受的盐。细胞生长抑制试验显示，与吉西他滨磷酸酯前药nuc-1031相比，本发明所示的化合物具有比较低的细胞毒性。肝匀浆稳定性考察试验显示，与吉西他滨磷酸酯前药nuc-1031吉西他滨磷酸酯前药nuc-1031相比，在正常氧条件下，发明所示的化合物产生的活性成分吉西他滨单磷酸浓度较低，提示在在正常氧条件下，本发明所示的化合物被代谢的速度较低。而在乏氧条件下，本发明所示的化合物产生的活性成分吉西他滨单磷酸浓度较高，提示能够在乏氧条件下产生更大的细胞毒性。需要特别指出的是，乏氧基团与吉西他滨磷酸酯的连接方式对保持药物乏氧选择性具有很大影响，如果将乏氧基团与吉西他滨磷酸酯的氨基以其他方式连接，无法保持药物的乏氧选择性。以化合物7为例，肝匀浆稳定性考察试验显示，在正常氧条件下或者乏氧条件下，均不能产生的活性成分吉西他滨单磷酸。如果乏氧基团侧链上的甲基缺失，药物乏氧选择性具有显著下降。以化合物8为例，肝匀浆稳定性考察试验显示，在正常氧条件下或者乏氧条件下，产生的活性成分吉西他滨单磷酸浓度的差异显著下降。有益效果：该类药物能够延缓药物被脱氧胞苷脱氨酶的代谢，增加药物作用时间，减小药物剂量，并且在正常氧环境下具有较小的细胞毒性，在乏氧条件下具有更强的细胞毒性，具有优异的抗肿瘤作用和良好的安全性，可用于治疗肿瘤药物的制备。附图说明图1目标化合物6对人bxpc-3裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用图。具体实施方式下面的实施例可使本专业技术人员可全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1：目标化合物1-标化合物6的合成：化合物1的合成合成路线:在-78℃下，将三光气(0.178g，0.6mmol)以4ml甲苯溶解，加入吡啶(0.047g，0.6mmol)的1ml甲苯溶液，然后缓慢加入1-(4-硝基苯)乙醇(0.72g，0.4mmol)溶解在40ml的甲苯溶液，在室温下搅拌24h。反应完成后，减压蒸馏除去甲苯，得到的残余物溶于n,n-二甲基甲酰胺(2.5ml)，4℃下，加入吉西他滨磷酸酯前药1a(0.14g,0.27mmol)，吡啶(61μl,0.75mmol)，室温下搅拌24h，减压蒸馏除去溶剂，用乙酸乙酯(30ml)溶解，水洗，有机层用无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析得白色固体(1，97mg)。参照化合物1的方法，合成了化合物2-化合物6。表1实施例化合物的主要原料和1hnmr实施例2：目标化合物对肿瘤细胞增殖体外抑制作用研究取对数生长期肿瘤细胞，加入0.25％胰酶消化3min，用含10％小牛血清rpmi-1640悬浮细胞，计数，调细胞浓度为1×105个/ml，以100μl/孔接种于top-count专用96孔细胞培养板中，37℃，5％co2孵育24h。然后将细胞分为实验组和对照组，实验组加入目标化合物溶液(0.1nm，1nm，10nm，100nm)，每一浓度均为四复孔，且每孔体积均补足200μl。各组加样后分别继续培养72h，于培养结束前，每孔分别加入3h-tdr3×105bq，用top-count测定各孔cpm(countperminute)值。计算各实验组药物对细胞增殖的半数抑制浓度(medianinhibitionconcentration，ic50)。表1目标化合物对肿瘤细胞增殖(72小时)的半数抑制浓度(ic50，nm)以上实验结果显示：本发明的实施例化合物(1-6)对肿瘤细胞增殖体外抑制作用显著低于吉西他滨、nuc-1031，提示本发明的实施例化合物细胞毒性较小。实施例3：目标化合物在肝匀浆中的产生活性代谢物单磷酸吉西他滨浓度的考察nadph启动系统制备：精密称取nadpna2，g-6-p-na，g-6-pdh和mgcl2适量，加水溶解并定容，体系含有2mmol·l-1nadpna2，40mmol·l-1g-6-p-na，4u·l-1g-6-pdh，40mmol·l-1mgcl2，-20℃保存。样品制备：首先在ep管中加入适量的样品甲醇溶液，水浴挥干溶剂，加入tris缓冲溶液，大鼠肝匀浆，涡旋混匀。恒温振荡水槽37℃预温孵5min。加入nadph启动系统200μl，涡旋混合均匀以启动反应。反应终体积为400μl，含1.0mmol·l-11nadpna2，20mmol·l-1g-6-p-na，2u·l-1g-6-pdh，20mmol·l-1mgcl2，肝匀浆蛋白质量浓度为2.0mg·ml-1，底物终浓度为0.5μmol·l-1。37℃水浴温孵。于温孵60min后分别加入乙腈0.4ml终止反应。平行5份。样品处理：乙腈终止反应后，涡旋并超声5min使混合均匀，高速离心(13000r·min-1，20min，4℃)，取上清，37℃水浴氮气流下挥干。残渣用400μl甲醇复溶，超声使溶解完全，高速离心(13000r·min-1，20min，4℃)，上清供hplc分析，测定单磷酸吉西他滨的浓度，并与nuc-1031产生的单磷酸吉西他滨的浓度进行比较。表2目标化合物在肝匀浆中的单磷酸吉西他滨的浓度比较化合物编号单磷酸吉西他滨的浓度(相对值％)162745566570882nuc-1031100以上实验结果显示：与nuc-1031相比，目标化合物1-6在肝匀浆中的产生的单磷酸吉西他滨的浓度明显较低,目标化合物7未能测到单磷酸吉西他滨，而目标化合物8产生的单磷酸吉西他滨的浓度稍低于nuc-1031。实施例4：目标化合物乏氧状态下在肝匀浆中的稳定性考察操作参考实施例3，样品孵育时，溶液在加入样品前先用氮气处理20分钟，并在加入样品后在氮气下孵育60分钟。离心液用hplc测定目标化合物以及o-去甲基乐伐替尼浓度。表3目标化合物乏氧条件下在肝匀浆中的单磷酸吉西他滨的浓度以上实验结果显示：目标化合物1-6乏氧状态下在肝匀浆中的产生的单磷酸吉西他滨的浓度明显高于正常氧状态。目标化合物7未能测到单磷酸吉西他滨，提示化合物7在乏氧条件下仍然不能有效释放出单磷酸吉西他滨。而目标化合物8产生的单磷酸吉西他滨的浓度稍高于正常氧状态，提示化合物8没有乏氧选择性。实施例5：目标化合物6对人bxpc-3裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用取对数生长期的bxpc-3人类胰腺癌细胞，以5×106个细胞·0.2ml-1·只-1的浓度，接种于裸鼠背部皮下，待裸鼠移植瘤长径均≥5mm后，以移植瘤长短径计算瘤体相似体积。按肿瘤体积的大小来顺排，用随机区组设计分配方法将裸鼠分为5组。给药方案:模型动物40只，随机被分为阴性对照组、低剂量组(化合物6，0.15mmol/kg)、高剂量组(化合物6，0.6mmol/kg)、盐酸吉西他滨组(0.2mmol/kg)，分别经腹腔注射给药(2次/每周)，持续3周，停药一周后处死裸鼠。同时测定动物体重。抑制效果和体重变化见图1：给药后，各组均显示出显著的抑制肿瘤生长作用，所有试验组裸小鼠体重没有明显差异，但是均小于对照组。高剂量组比吉西他滨组显示出更好的治疗作用和安全性。当前第1页12