一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料及其应用的制作方法

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种人骨髓间充质干细胞体外培养支架材料，及其应用。

背景技术：

骨髓间充质干细胞因其取材容易、易于体外培养增殖，同时具有良好的成骨、成软骨、成脂肪甚至肌原细胞分化潜能，成为骨组织工程研究领域最重要的种子细胞，具有广泛的应用前景。

定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，对骨组织工程的研究提供重要的理论指导，进而为临床上骨质疏松、骨损伤等骨科疾病的攻克提供了新思路。

相关诱导bmscs特异性成骨分化研究也已经取得诸多进展，已成功应用多种支架材料进行成骨诱导分化，但目前可促进成骨分化的高机械强度支架材料多为人工合成材料，其难形成理想的材料-细胞界面，影响种子细胞在材料的黏附、增殖、分化，同时材料的机械强度和降解速度之间的矛盾还无法解决且材料在体内仍有一定的抗原性；而更有利于细胞生长增值的天然支架材料可塑性差、机械强度较弱。因此仍需要更多机械强度合适的天然支架来高效获得性状更为稳定的成骨细胞，这将有利于生物工程获得更多骨组织样结构，并启发其未来在骨缺损替代疗法中的应用。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种能够理想维持人骨髓间充质干细胞生长活性，并显著提高人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化表型与功能的硅包被多孔蚕丝蛋白支架材料。

具体的，所述的间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料，其制备方法包括下述步骤：

以多孔蚕丝蛋白支架为主体，以生物硅化作用对支架进行有机硅包被，作为人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化的培养载体；

所述多孔蚕丝蛋白支架的制备方法包括，将蚕茧于0.02m碳酸钠溶液中进行萃取并溶解于9.3m溴化锂溶液中，蒸馏水透析并离心，得到2.5g/ml丝素蛋白溶液。将甘油溶液与上述制备的丝素蛋白溶液以3:7的重量比预混合。将所得混合物倒入不锈钢容器中，并冷冻干燥后切片使用。在-40℃下预冷冻6小时冻干36小时后，将所得的支架切成小圆片(3mm直径×1mm厚)，即多孔蚕丝蛋白支架。本发明所述的多孔蚕丝蛋白支架的制备方法在下述文献中有所记载mingzhongli,shenzhoulu,zhengyuzu,haojingyan,jingyumo,lihongwang.studyonporoussilkfibroinmaterials:1finestructureoffreeze-driedsilkfibroin.appliedpolymerscience,2001,79(12):2185-2191。

优选的情况下，对于上文所述支架材料的制备方法中，多孔蚕丝蛋白支架置于硅酶(silicatein)溶液中，在2-8℃条件下浸泡6-18h后，将硅酸钠、六氟硅酸钠、四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷按照上述含硅化合物与硅酶质量比5～50:1的比例，加入溶液中，经25-37℃反应1-6h，pbs洗去反应液。上述含硅化合物与硅酶质量比理论上应该是5～100:1都可以的，本发明实施例中所用的比例是30:1。

优选的情况下，对于上文所述的支架材料的制备方法中，在接种细胞前所述支架材料需经灭菌处理，且浸泡在基础培养基内进行预平衡10-14h。

所述灭菌处理方法包括：高温高压灭菌、其他高温方法灭菌或75％乙醇浸泡12-24h。

优选的情况下，对于上文所述支架材料的制备方法中，所述间充质干细胞培养方法如下：采用人骨髓间充质干细胞为种子细胞，将人骨髓间充质干细胞以10⁵～10⁶细胞数/支架接种到硅包被多孔蚕丝蛋白支架上，并将硅包被多孔蚕丝蛋白支架置于成骨诱导分化微环境中进行培养。

所述的以有机硅包被的多孔蚕丝蛋白支架作为人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化的培养载体的具体操作步骤如下：将消化的人骨髓间充质干细胞与胶原混合，获得细胞-胶原悬液，然后将细胞-胶原悬液多点接种至多个硅包被多孔蚕丝蛋白支架，并保证人骨髓间充干细胞数量为2～5×10⁵细胞数/支架，胶原的体积为5～15μl/支架。

对于上文所述支架材料的制备方法中，所述的将硅包被多孔蚕丝蛋白支架置于成骨诱导分化微环境中进行培养的具体操作步骤如下：将接种完成的硅包被多孔蚕丝蛋白支架按照1个支架/孔的密度放置到多孔细胞培养板中，并将多孔细胞培养板置于细胞培养箱中，在37℃、5％co2的条件下凝胶化20min，然后向多孔细胞培养板的每个孔中加入成骨诱导培养基，所述的成骨诱导培养基由高糖基础培养基(dmem)、10％胎牛血清(fbs)、1％双抗(pen/strep)、100nm地塞米松(dexamethasone)、10μmβ-磷酸甘油(β-glycerolphosphate)、0.5μm抗坏血酸(l-ascorbicacidphosphate)混合而成。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：

本发明所公开的人骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导支架材料，该支架材料通过对多孔蚕丝蛋白表面进行生物硅化修饰，其中，多孔蚕丝蛋白支架所特有的生物相容性、机械强度特征及生物降解特性，使得该培养体系易于实现成骨细胞体内移植，这不但可推进骨损伤愈合治疗，而且还可能为探讨有关体外诱导成骨细胞移植的相关研究提供理想的研究模型体系；利用有机硅与细胞之间复杂的相互作用，促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。

采用硅包被多孔蚕丝蛋白作为培养支架，同时添加胶原作为培养基质，构建出一个复合培养体系，该复合培养体系不但能够为人骨髓间充质干细胞提供三维生长空间，而且其具有生物相容性、材料可塑性和支持人骨髓间充质干细胞生长的特点，此外，其多孔特征也可大大提高培养体系内的物质传递，从而有利于人骨髓间充质干细胞在体外培养过程中维持其活性及多能性。本支架材料所建立的模型内，细胞间彼此建立细胞通讯，有明显钙盐沉积且可形成类钙结节结构，说明所构建的人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化体系有利于提高成骨诱导分化表型及功能；该方法所建立的成骨诱导分化体系中，人骨髓间充质干细胞的钙盐沉积、类钙结节形成及成骨特异性基因及蛋白表达均显著高于平面诱导组及无硅包被多孔蚕丝蛋白诱导组成骨细胞的功能活性。

附图说明

图1为硅包被多孔蚕丝蛋白支架的扫描电镜图(a：多孔丝蛋白；b：硅包被多孔丝蛋白)。

图2为利用活/死细胞双染色试剂盒显示人骨髓间充质干细胞在硅包被多孔蚕丝蛋白支架上的生长形态和细胞活性。其中，图中标记d的为极少量显示红色荧光的死细胞，图中未做标记的其余细胞为活细胞，显示绿色荧光。

图3为he染色显示利用本发明所述支架材料诱导分化的人骨髓间充干细胞的形态结构。

图4为扫描电镜(sem)检测显示人骨髓间充质干细胞细胞在硅包被多孔蚕丝蛋白支架上的生长形貌及特征(a1-2：多孔丝蛋白诱导组；b1-2：硅包被多孔丝蛋白支架诱导组)。

图5为本发明所述支架材料诱导分化的人骨髓间充质干细胞的钙盐沉积及类钙结节形成(a：2d硅包被诱导组；b：多孔丝蛋白诱导组；c：硅包被多孔丝蛋白诱导组)。

图6为利用qrt-pcr方法检测本发明所述支架材料对人骨髓间充质干细胞成骨特异性基因表达水平的影响。

图7为本发明所述支架材料诱导分化的人骨髓间充质干细胞的成骨特异性蛋白表达图，bmp2：a：2d硅包被诱导组；b：多孔丝蛋白诱导组；c：硅包被多孔丝蛋白诱导组。

图8为本发明所述支架材料诱导分化的人骨髓间充质干细胞的成骨特异性蛋白表达图，runx2：a：2d硅包被诱导组；b：多孔丝蛋白诱导组；c：硅包被多孔丝蛋白诱导组。

图9为本发明所述支架材料诱导分化的人骨髓间充质干细胞的成骨特异性蛋白表达图，opn：a：2d硅包被诱导组；b：多孔丝蛋白诱导组；c：硅包被多孔丝蛋白诱导组。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明中所用到的生物材料或化学试剂，如无特殊说明，均由常规方法制备获得，或商业途径获得。

本发明中所用到的硅酶(silicatein)由大连化物所制备，硅酶的氨基酸序列来自繁茂膜海绵的silicateinalpha蛋白(genbank:abc94586.1)基因，插入到pet28载体后，于大肠杆菌中(e.colidh5αde3)表达并通过6xhis-tag进行纯化获得。

本发明中所用到的硅酶(silicatein)的制备方法在下述文献中有所记载：hcoboreiko，akrasko，areiber，hschwertner.mineralizationofsaos-2cellsonenzymatically(silicatein)modifiedbioactiveosteoblast-stimulatingsurfaces.journalofbiomedicalmaterialsresearchpartbappliedbiomaterials,2005,75b(2):387–392.

实施例1

下面将结合附图说明本发明的具体实施方式。如图1至图7所示：

多孔蚕丝蛋白支架的制备：

将蚕茧于0.02m碳酸钠溶液中进行萃取并溶解于9.3m溴化锂溶液(sigma)中，蒸馏水透析并离心，得到2.5％(w/v)丝素蛋白溶液。将甘油溶液(sigma)与上述制备的丝素蛋白溶液以30wt％的重量比预混合。将所得混合物倒入不锈钢容器中，并在-40℃下预冷冻6小时，然后转移到virtisgenesis25-le冷冻干燥机中。冻干36小时后，将所得的支架切成小圆片(3mm直径×1mm厚)，即多孔蚕丝蛋白支架。用于细胞培养实验。本发明所述的多孔蚕丝蛋白支架的制备方法在下述文献中有所记载mingzhongli,shenzhoulu,zhengyuzu,haojingyan,jingyumo,lihongwang.studyonporoussilkfibroinmaterials:1finestructureoffreeze-driedsilkfibroin.appliedpolymerscience,2001,79(12):2185-2191。

多孔蚕丝蛋白支架在接种细胞前需经75％乙醇浸泡灭菌处理，且浸泡在(基础培养基)dmem内进行预平衡10-14h。

硅包被多孔蚕丝蛋白支架的制备：

多孔蚕丝蛋白支架置于硅酶中，在4℃条件下浸泡6-18h后，将六氟硅酸钠与硅酶(silicatein)质量比30:1的比例，加入溶液中，经37℃反应4h，pbs洗去反应液。制备获得有机硅包被的多孔蚕丝蛋白支架。

人骨髓间充质干细胞的体外培养：

人骨髓间充质干细胞培养于dmem培养基，细胞生长至近90％融合度时进行1:3常规传代培养，培养于37℃，5％co2细胞培养箱内。

进行人骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导分化：

以上述步骤中获得人骨髓间充质干细胞为种子细胞，以上述步骤中获得的有机硅包被的多孔蚕丝蛋白支架，作为人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化的培养载体，将人骨髓间充质干细胞按一定细胞密度接种到硅包被多孔蚕丝蛋白支架上，并将硅包被多孔蚕丝蛋白支架置于成骨诱导分化微环境中进行培养。

将消化的人骨髓间充质干细胞混悬于ⅰ型胶原溶液(bdbiosciences，354236)(混合比例根据实验具体情况，相当与用培养基混悬细胞得到相应浓度的悬液，使之定量接种于支架后保证支架上有所需量细胞数)，获得细胞-胶原悬液，然后将细胞-胶原悬液多点接种至多个硅包被多孔蚕丝蛋白支架，并保证人骨髓间充干细胞数量为3.5×10⁵细胞数/支架，胶原的体积为10μl/支架。

所述的将硅包被多孔蚕丝蛋白支架置于成骨诱导分化微环境中进行培养的具体操作步骤如下：将接种完成的硅包被多孔蚕丝蛋白支架按照1个支架/孔的密度放置到(多孔即可，根据实验具体所需而定)多孔细胞培养板中，并将多孔细胞培养板置于细胞培养箱中，在37℃、5％co2的条件下凝胶化20min，然后向多孔细胞培养板的每个孔中加入成骨诱导培养基，所述的成骨诱导培养基由高糖基础培养基(dmem)、10％胎牛血清(fbs)、1％双抗(pen/strep)、100nm地塞米松(dexamethasone)、10μmβ-磷酸甘油(β-glycerolphosphate)、0.5μm抗坏血酸(l-ascorbicacidphosphate)混合而成。

通过上述步骤，构建出人骨髓间充质干细胞的三维成骨诱导分化模型。

以同批次人骨髓间充质干细胞为种子细胞，以2d非诱导组为对照组1(2d-n)，另设有机硅包被的2d诱导组为对照组2(2d-si-i)及多孔丝蛋白诱导组为对照组3(silk-i)，以有机硅包被的多孔丝蛋白诱导组为实验组(silk-si-i)。

2d非诱导组制备及培养方法：将细胞爬片(玻片)置于24孔板中，细胞以3×10⁴/爬片接种至爬片上，以非诱导培养基即维持培养基(dmem+10％fbs+1％pen/strep)培养。

有机硅包被的2d诱导组制备及培养方法：将细胞爬片(玻片)置于24孔板中，加入硅酶(silicatein)，在4℃条件下浸泡6-18h后，将六氟硅酸钠与硅酶(silicatein)质量比30:1的比例，加入溶液中，经37℃反应4h，pbs洗去反应液。细胞以3×10⁴/爬片接种至爬片上，加入诱导培养基进行成骨诱导培养。

人骨髓间充质干细胞三维成骨诱导分化模型的形态学检测：

(1)人骨髓间充质干细胞生长形态及活性检测：为了更好的观察三维成骨诱导分化体系内细胞生长形态及活性检测，细胞培养20天后，采用calcein-am/ethd-1染色试剂盒(invitrogen)，37℃孵育2h，其余操作按说明书进行。染色后于激光共聚焦显微镜下观察、拍照。结论：在硅包被多孔蚕丝蛋白支架上人骨髓间充质干细胞生长状态良好，细胞活性染色显示大部分细胞均为绿色荧光，说明其活性理想。

人骨髓间充质干细胞生长形态及活性检测结果：如图2所示，在硅包被多孔蚕丝蛋白支架上人骨髓间充质干细胞生长状态良好，细胞活性染色显示大部分细胞均为绿色荧光，说明其活性理想。仅有少量细胞死亡，显示红色荧光。

(2)h&e染色：样品收集后经pbs冲洗、4％多聚甲醛室温下固定24h，由形态学中心制备石蜡切片。再依次经过脱蜡、h&e染色以及封片，制备h&e染色切片。正视光学显微镜下观察，拍照。人骨髓间充质干细胞在硅包被多孔蚕丝蛋白支架内部分布均匀，在支架及孔隙边缘细胞较密集。人骨髓间充质干细胞呈梭形伸展，生长状态良好。

h&e染色(图3)结果进一步证明人骨髓间充质干细胞的生长形态特征。可见：人骨髓间充质干细胞在硅包被多孔蚕丝蛋白支架内部分布均匀，在支架及孔隙边缘细胞较密集。人骨髓间充质干细胞呈梭形伸展，生长状态良好。

(3)扫描电镜观察：所收集样品经pbs充分清洗后，2.5％戊二醛溶液前固定4-6h，pbs冲洗后，2％锇酸后固定2h，再次pbs充分清洗后，采用冷冻干燥法进行干燥。干燥后样品经喷金15min后，于扫描电镜下观察拍照。

如图4所示，扫描电镜结果显示人骨髓间充质干细胞紧密生长于硅包被多孔蚕丝蛋白支架表面及三维孔隙，分泌大量的细胞外基质，同时，可见大量钙盐沉积与类钙结节的形成。彼此间相互连接，形成类组织化的表观形貌特征。

人骨髓间充质干细胞三维成骨诱导分化模型的功能活性检测：

(1)钙盐沉积及类钙结节形成测定：成骨诱导分化21天后，收集样品，pbs充分清洗，95％乙醇固定30min，pbs冲洗后，茜素红s染色5min，pbs充分冲洗后，中性树脂封片，于正视光学显微镜下观察，拍照。

如图5所示，钙盐沉积及类钙结节形成检测结果表明：与对照组比较，基于硅包被蚕丝蛋白支架的三维成骨诱导组内所形成的钙盐沉积及类钙结节数量较多。该结果说明，人骨髓间充质干细胞在该成骨诱导分化体系下分化较为成熟。

(2)定量rt-pcr测定成骨特异性基因表达：成骨诱导分化21天后，直接采用trizol裂解细胞，rnaeasy试剂盒(qiagen).提取总rna后，采用primescript^tmrt试剂盒和sybrpremixextaq^tmii试剂盒(takara)进行定量rt-pcr扩增。依据各目的基因的ct值及内参基因的ct值进行定量分析(abismarti)，确定各目的基因的表达水平。所扩增基因的引物序列如下：

(3)定量rt-pcr检测的引物序列

h:human-specificprimer

人骨髓间充质干细胞成骨特异性蛋白表达测定：成骨诱导分化21天后，收集样品，经pbs冲洗、4％多聚甲醛室温下固定24h，由形态学中心制备石蜡切片。再进行脱蜡，并采用生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒，进行免疫组织化学染色，染色后于正视光学显微镜下观察、拍照。

人骨髓间充质干细胞成骨特异性基因及蛋白表达测定结果：人骨髓间充质干细胞成骨特异性基因与蛋白表达的改变是对人骨髓间充质干细胞成骨分化程度进行评价的重要指标。如图6、7所示，经硅包被蚕丝蛋白支架进行成骨诱导后，人骨髓间充质干细胞成骨特异性基因及蛋白表达水平显著高于对照组。