本发明涉及一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术：
海藻糖(trehalose)由两个吡喃葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，是一种稳定的非还原性寡糖，同时具有高度安全性和有良好的稳定性，被广泛应用于医药、食品、化妆和农业等领域。自1995年以来，日本、美国和欧盟等先后批准海藻糖可以用作食品添加剂。2005年，我国卫生部正式批准海藻糖为新资源食品。
1993年日本林原生化研究所首次发现麦芽寡糖基海藻糖合成酶(mtsase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)，以液化淀粉作为底物，这两种酶协同作用，可以生成海藻糖，并且率先实现了海藻糖工业化生产。目前，我国已有公司开始生产海藻糖，但产品性能、产率与进口产品存在一定差距，并且生产成本一直居高不下。更为严峻的是，为了迎合市场需求，海藻糖售价不断下降，给海藻糖生产带来了巨大挑战和压力。因此如何提升海藻糖产率，实现海藻糖低成本规模化制备，使其走向大众消费者的餐桌成为学术界和产业界关注的热点。
目前，工业化生产海藻糖主要通过两种方法：①利用海藻糖合成酶，以麦芽糖作为底物，通过分子内转糖基作用，生成海藻糖；②以淀粉液化液作为底物，经麦芽寡糖基海藻糖合成酶(mtsase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)协同作用生产海藻糖。两种方法海藻糖产率均为80％左右。但是，从生产成本以及周期考虑，以淀粉作为底物制备海藻糖，工艺更为简便，成本跟为低廉。因此，麦芽寡糖基海藻糖合成酶(mtsase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)协同作用生产海藻糖，更具优势。
国内外双酶法生产海藻糖包括中低温酶系(海藻糖转化率：arthrobactersp.q36：80％、arthrobacterramosuss34：66％，brevibateriumhelvolum：70.4％)和高温酶系(sulfolobussolfataricuskm1：81.5％、sulfolohusacidocaldariusatcc33909：80.2％)。高温酶系通常具有较高的海藻糖转化率，并且具有良好的热稳定性，能在较高温度下转化淀粉生成海藻糖，不容易在生产过程中污染杂菌。但是，高温酶系相对于中低温酶系，具有蛋白表达量低，比酶活低的缺点，不利于其工业化应用。
技术实现要素：
基于上述现状，本发明利用基因工程和酶工程的手段，提高麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活，为其工业化生产创造条件。
本发明提供了具有酶活提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的突变体，包含了将来源于嗜酸热硫化叶菌(sulfolobusacidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第81、263、284、432、439、583、585、586、611或615位的氨基酸中的一个或多个进行取代得到的突变体。这些突变体与其亲代的麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比，酶活提高。
在本发明的一种实施方式中，所述嗜酸热硫化叶菌(s.acidocaldarius)。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于嗜酸热硫化叶菌(s.acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第81位置的甘氨酸(gly)变成丝氨酸(ser)，突变体命名为g81s。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第263位置的谷氨酸(glu)变成甘氨酸(gly)，突变体命名为e263g。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(phe)变成缬氨酸(val)，突变体命名为f284v。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第432位置的甘氨酸(gly)变成天冬氨酸(asp)，突变体命名为g432d。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第439位置的苏氨酸(thr)变成丙氨酸(ala)，突变体命名为t439a。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第583位置的苯丙氨酸(phe)变成亮氨酸(leu)，突变体命名为f583l。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第585位置的谷氨酰胺(gln)变成精氨酸(arg)，突变体命名为q585r。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第586位置的甘氨酸(gly)变成天冬氨酸(asp)，突变体命名为g586d。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第611位置的异亮氨酸(ile)变成苏氨酸(thr)，突变体命名为i611t。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第615位置的丝氨酸(ser)变成甘氨酸(gly)，突变体命名为s615g。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(phe)变成缬氨酸(val)，同时将第439位置的苏氨酸(thr)变成丙氨酸(ala)，得到f284v/t439a。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(phe)变成缬氨酸(val)，同时将第586位置的甘氨酸(gly)变成天冬氨酸(asp)，得到f284v/g586d。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第439位置的苏氨酸(thr)变成丙氨酸(ala)，同时将第586位置的甘氨酸(gly)变成天冬氨酸(asp)，得到t439a/g586d。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第439位置的苏氨酸(thr)变成丙氨酸(ala)，同时将第585位置的谷氨酰胺(gln)变成精氨酸(arg)，得到t439a/q585r。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第432位置的甘氨酸(gly)变成天冬氨酸(asp)，同时将第586位置的甘氨酸(gly)变成天冬氨酸(asp)，得到g432d/g586d。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第81位置的甘氨酸(gly)变成丝氨酸(ser)、将第284位置的苯丙氨酸(phe)变成缬氨酸(val)、将第615位置的丝氨酸(ser)变成甘氨酸(gly)，得到g81s/f284v/s615g。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(phe)变成缬氨酸(val)、将第439位置的苏氨酸(thr)变成丙氨酸(ala)、将第586位置的甘氨酸(gly)变成天冬氨酸(asp)，得到f284v/t439a/g586d。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第81位置的甘氨酸(gly)变成丝氨酸(ser)、将第284位置的苯丙氨酸(phe)变成缬氨酸(val)、将第439位置的苏氨酸(thr)变成丙氨酸(ala)、将第615位置的丝氨酸(ser)变成甘氨酸(gly)，得到g81s/f284v/t439a/s615g。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第81位置的甘氨酸(gly)变成丝氨酸(ser)、将第284位置的苯丙氨酸(phe)变成缬氨酸(val)、将第586位置的甘氨酸(gly)变成天冬氨酸(asp)，得到将第615位置的丝氨酸(ser)变成甘氨酸(gly)g81s/f284v/g586d/s615g。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第263位置的谷氨酸(glu)变成甘氨酸(gly)、将第284位置的苯丙氨酸(phe)变成缬氨酸(val)、将第583位置的苯丙氨酸(phe)变成亮氨酸(leu)、将第611位置的异亮氨酸(ile)变成苏氨酸(thr)、将第615位置的丝氨酸(ser)变成甘氨酸(gly)，得到e263g/f284v/f583l/i611t/s615g。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含有编码突变体的基因的质粒载体。
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞。
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清液即为麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的粗酶液。
所述质粒载体，在本发明的一种实施方式中，是pet系列、puc系列或pgex中的任意一种。
所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
本发明提供了一系列在宿主菌中酶活提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体。在适当的培养条件下，突变体g81s、e263g、f284v、g432d、t439a、f583l、q585r、g586d、i611t、s615g、f284v/t439a、f284v/g586d、g432d/g586d、t439a/q585r、t439a/g586d、g81s/f284v/s615g、f284v/t439a/g586d、g81s/f284v/t439a/s615g、g81s/f284v/g586d/s615g、e263g/f284v/f583l/i611t/s615g麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活分别为野生酶的1.2倍、1.1倍、2.1倍、1.2倍、2.1倍、1.2倍、1.1倍、1.4倍、1.19倍、1.17倍、3.1倍、2.4倍、1.6倍、2.4倍、2.7倍、3.2倍、3.4倍、3.8倍、3.6倍、4.0倍。
具体实施方式
实施例1：野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶的表达
从实验室前期保藏的甘油管中，接种trey/pet24a/bl21(de3)于lb液体培养基(含100mg/l卡那霉素)生长8h，按5％接种量将种子接入tb液体发酵培养基(含100mg/l卡那霉素)。大肠杆菌在37℃培养2h后，加入0.01mmol·l-1终浓度的iptg(异丙基硫代-β-d半乳糖苷)进行诱导，并在25℃摇床继续培养发酵24h后，将一定体积发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，菌体沉淀用20mmol·l-1ph8.0na2hpo4-nah2po4缓冲液重新悬浮，混匀。用超声波细胞粉碎机破碎菌体悬浮液的细胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：ψ6工作探头，工作时间10min，工作2s停3s，工作功率为20％)，然后12000rpm离心10min，离心后上清即为发酵胞内粗酶液。
实施例2：麦芽寡糖基海藻糖合成酶单突变体的制备及表达
(1)突变体的制备
根据sulfolobusacidocaldarius麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因序列，分别设计并合成引入g81s、e263g、f284v、g432d、t439a、f583l、q585r、g586d、i611t、s615g突变的引物，对麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因trey进行定点突变，分别测序确认麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，得到单突变麦芽寡糖基海藻糖合成酶。
定点突变体编码基因的pcr扩增：利用快速pcr技术，以携带编码野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因的表达载体trey/pet-24a(+)为模板。
引入g81s突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-cgcataccattggcctgagcatcattcag-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-ctgaatgatgctcaggccaatggtatgcg-3’(下划线为突变碱基)
引入e263g突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-gggtttccaggagggactgaaactgaac-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-gttcagtttcagtccctcctggaaaccc-3’(下划线为突变碱基)
引入f284v突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-ctatagcaatctgctggttaacttcaaccagg-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-cctggttgaagttaaccagcagattgctatag-3’(下划线为突变碱基)
引入g432d突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-caaaagcgtcgtgacaaaattaccctgaatgc-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-gcattcagggtaattttgtcacgacgcttttg-3’(下划线为突变碱基)
引入t439a突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-caaaattaccctgaatgcggcgagcacccatg-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-catgggtgctcgccgcattcagggtaattttg-3’(下划线为突变碱基)
引入f583l突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-ccggtattccggacctctatcaaggc-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-gccttgatagaggtccggaataccgg-3’(下划线为突变碱基)
引入q585r突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-ccggacttctatcgaggcaccgaaatc-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-gatttcggtgcctcgatagaagtccgg-3’(下划线为突变碱基)
引入g586d突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-ccggacttctatcaagacaccgaaatctgg-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-ccagatttcggtgtcttgatagaagtccgg-3’(下划线为突变碱基)
引入i611t突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-gaagctgcatgagaccctggagaaaagc-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-gcttttctccagggtctcatgcagcttc-3’(下划线为突变碱基)
引入s615g突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-catgagatcctggagaaaggcaagaagttc-3’(下划线为突变碱基)
反向引物：5’-gaacttcttgcctttctccaggatctcatg-3’(下划线为突变碱基)
pcr反应体系均为：5×psbuffer10μl，dntpsmix(2.5mmol·l-1)4μl，正向引物(10μmol·l-1)1μl，反向引物(10μmol·l-1)1μl，模板dna1μl，primerstarhs(5u/μl)0.5μl，加入蒸馏水至50μl。
pcr扩增程序设定为：首先，94℃预变性5min；然后进入30个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸7min50s；最后72℃延伸10min，4℃保温。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
在验证正确的pcr产物中加入dpni，37℃，水浴2h，降解模板，之后转化e.colijm109感受态细胞，将转化产物涂布于含有含100mg/l卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养10～12h，挑取阳性克隆，lb液体培养基培养8-10h,。测序正确的突变体，从甘油管接种至lb培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，得到能够表达突变体g81s、e263g、f284v、g432d、t439a、f583l、q585r、g586d、i611t、s615g的重组菌株。
(2)突变体的表达
突变体表达过程如实施例1所述。
实施例3麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活力分析
酶活定义：每分钟相当于转化一微摩尔葡萄糖变为非还原性糖所需要的酶量。
酶活测定方法：预热：取1.9ml的0.2％麦芽糊精溶液(de9～13ph6.0磷酸缓冲液)于具塞试管中，置于60℃水浴锅中预热10min。反应：加入0.1ml稀释后的发酵胞内粗酶液，振荡均匀，准确计时10min，加入3mldns，振荡均匀，终止反应。煮沸7min，冷却。测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15ml，混匀。在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。
野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶(wt)和突变体摇瓶培养24hod600nm及酶活力列于表1，结果表明，所有突变体的酶活均高于野生型。
表1野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和单突变体酶的摇瓶od600nm及酶活力
实施例4：麦芽寡糖基海藻糖合成酶双突变体的制备和表达及酶活力分析
分别以实施例2构建的突变体f284v、t439a、g432d的质粒作为双突变的模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速pcr技术，对携带编码突变体f284v、t439a、g432d的基因的质粒进行定点突变，构建双突变体f284v/t439a、f284v/g586d、t439a/g586d、t439a/q585r、g432d/g586d。分别测序确认麦芽寡糖基海藻糖合成酶双突变体的编码基因是否正确，并将测序结果正确的质粒导入大肠杆菌中进行表达，得到双突变麦芽寡糖基海藻糖合成酶。
野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶(wt)和双突变体的摇瓶培养24h的od600nm及酶活力列于表2，结果表明，各个突变体的酶活均高于野生型。
表2野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和双突变体酶的摇瓶od600nm及酶活力
实施例5：麦芽寡糖基海藻糖合成酶三突变体的制备和表达及酶活力分析
以实施例2和4构建的突变体f284v、f284v/t439a的质粒作为三突变的模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速pcr技术，对携带编码突变体f284v、f284v/t439a的基因的质粒进行定点突变，构建三突变体g81s/f284v/s615g、f284v/t439a/g586d。测序确认麦芽寡糖基海藻糖合成酶三突变体的编码基因是否正确，并将测序结果正确的质粒导入大肠杆菌中进行表达，得到三突变麦芽寡糖基海藻糖合成酶。
野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶(wt)和三突变体的摇瓶培养24h的od600nm及酶活力列于表3，结果表明，各个突变体的酶活均高于野生型。
表3野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和三突变体酶的摇瓶od600nm及酶活力
实施例6：麦芽寡糖基海藻糖合成酶四突变体的制备和表达及酶活力分析
以实施例5构建的三突变体g81s/f284v/s615g的质粒作为四突变体的模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速pcr技术，对携带编码突变体g81s/f284v/s615g的基因的质粒进行定点突变，构建四突变体g81s/f284v/t439a/s615g、g81s/f284v/g586d/s615g。分别测序确认麦芽寡糖基海藻糖合成酶四突变体的编码基因是否正确；并将测序结果正确的质粒导入大肠杆菌中进行表达，得到四突变麦芽寡糖基海藻糖合成酶。
野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶(wt)和四突变体的摇瓶培养24h的od600nm及酶活力列于表4，结果表明，各个突变体的酶活均高于野生型。
表4野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和四突变体酶的摇瓶od600nm及酶活力
实施例7：麦芽寡糖基海藻糖合成酶五突变体的制备和表达及酶活力分析
以实施例2构建的突变体f284v的质粒作为五突变体的模板，并根据实施例2设计的定点突变的引物，使用快速pcr技术，对携带编码突变体f284v的基因的质粒进行定点突变，构建五突变体e263g/f284v/f583l/i611ts615g。测序确认麦芽寡糖基海藻糖合成酶五突变体的编码基因是否正确；并将测序结果正确的质粒导入大肠杆菌中进行表达，得到五突变麦芽寡糖基海藻糖合成酶。
野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶(wt)和五突变体的摇瓶培养24h的od600nm及酶活力列于表5，结果表明，五突变体的酶活为野生酶的4倍。
表5野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和五突变体酶的摇瓶od600nm及酶活力
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<110>江南大学
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gggtttccaggagggactgaaactgaac28
<210>5
<211>28
<212>dna
<213>人工序列，用于pcr
<400>5
gttcagtttcagtccctcctggaaaccc28
<210>6
<211>32
<212>dna
<213>人工序列，用于pcr
<400>6
ctatagcaatctgctggttaacttcaaccagg32
<210>7
<211>32
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<213>人工序列，用于pcr
<400>7
cctggttgaagttaaccagcagattgctatag32
<210>8
<211>32
<212>dna
<213>人工序列，用于pcr
<400>8
caaaagcgtcgtgacaaaattaccctgaatgc32
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<213>人工序列，用于pcr
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catgggtgctcgccgcattcagggtaattttg32
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