单克隆抗体9A及其应用的制作方法

本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种针对axl的单克隆抗体，另外，本发明还涉及该抗体的制备方法和用途。

背景技术：

癌症已经成为引发人类死亡的一个主要原因。一项研究数据表明，全球肿瘤的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势：2008年全球癌症的发病数达到1270万，预计到2030年将达到2030万；2008年由癌症引起的死亡数为760万，预计到2030年将增至1320万。2015中国癌症统计数据显示，根据对2000～2011年的癌症发病人数和死亡人数的数据趋势分析，结果表明预计2015年我国癌症新发病例数为429.2万例，死亡人数为281.4万例。随着癌症发病率和死亡率的增加，癌症已经成为促使我国居民疾病死亡的首要原因，成为非常重要的公共健康的问题。

化疗作为常规癌症治疗手段之一，在癌症治疗中发挥了重要作用，但是由于其特异性差，临床有较大的毒副作用，因此医护人员和研究人员正在寻求更好的治疗策略。分子靶向治疗相较于传统化学治疗，具有定向、定位的优势，可以减少患者用药剂量，减少毒副反应，提高治疗效果，现已成为全球癌症治疗领域的研究热点。近十年分子靶向药物的研究发展迅速，大量的生物靶向抗癌药物获得美国食品药品管理局批准上市。单克隆抗体药物以其特异性强、安全性高、毒性低、临床疗效好等优点成为肿瘤靶向治疗重点研究领域之一。

受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase，rtk)是细胞表面的跨膜受体，分为胞外段、跨膜区和胞内域，其中胞内域含有激酶活性，在正常和恶性细胞的信号转导中均发挥重要的作用。1991年，在慢性髓细胞白血病中发现了一个受体酪氨酸激酶亚家族——tam家族。tam家族成包括tyro-3、axl和mer，它们的配体均为生长停滞特异性基因6(growtharrest-specific6，gas6)所编码的蛋白分子。近年来，大量的研究显示，axl在多种恶性肿瘤中都高表达，包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和卵巢癌等。axl可以促进细胞生存、迁移、侵袭和转移，增强化疗敏感性。

近年来许多研究报道表明，在靶向和化疗药物治疗癌症患者的过程中，axl的超表达是导致靶向治疗和传统化疗耐药性产生的一个重要机制。目前已经在许多肿瘤中，如肺癌、乳腺癌、食道癌、胃肠道间质细胞瘤和急性粒细胞白血病等，观察到由于这种机制而产生的耐药性。来越多的证据表明，axl激酶在多种肿瘤细胞中参与由不同机制造成的耐药性，axl激酶的超表达已经成为癌症患者出现耐药性的一个重要原因。通过对axl受体酪氨酸激酶的抑制可以降低肿瘤细胞的促存活信号、阻滞肿瘤的侵袭能力，增加靶向药物治疗和化疗敏感度。这些优势的存在使得axl作为癌症治疗的靶点策略合理可行。

目前在研究中的axl靶向药物主要包括小分子酪氨酸激酶抑制剂和抗axl单克隆抗体等。

目前，已经报道了多种针对axl通路的小分子抑制剂，其中一些已经进入了临床试验阶段，例如r428、s49076、ly2801653以及mp-470、ski-606、mgcd265、asp2215、xl184等。r428(bgb324)是第一个以axl为治疗靶点并最早进入临床试验阶段的激酶抑制剂。r428可以抑制axl和akt的磷酸化，阻断下游信号通路。r428能够剂量依赖性地抑制高侵袭乳腺癌细胞mda-mb-231和4t1的生长。在4t1乳腺癌小鼠模型中，切除小鼠的乳腺后，经r428治疗，可抑制癌转移，延长小鼠生存期；此外，r428协同顺铂能够抑制肝癌转移；r428已进入了临床2期研究阶段。而靶向axl的抗体的研究才刚刚起步，目前正处于临床前研究的阶段。

综上所述，axl是癌症治疗和药物研发的潜在靶点。本研究的目的在于筛选靶向axl的功能性单克隆抗体。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种含有独特的互补决定区的针对axl的结合分子，该结合分子对axl蛋白具有显著的亲和作用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种分离的结合分子，所述结合分子包括：

(1)seqidno:1所示的重链cdr1、seqidno:2所示的重链cdr2、seqidno:3所示的重链cdr3；和/或

(2)seqidno:4所示的轻链cdr1、seqidno:5所示的轻链cdr2、seqidno:6所示的轻链cdr3。

作为本发明的一个方面，本发明的结合分子包括：

(1)重链可变区，所述重链可变区具有seqidno:7所示的氨基酸序列；和/或

(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有seqidno:8所示的氨基酸序列。

进一步，所述结合分子包括：

(1)重链，所述重链具有seqidno:13所示的氨基酸序列；和/或

(2)轻链，所述轻链具有seqidno:11所示的氨基酸序列。

本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，还可以是抗原结合片段，包括但不限于fab、f(ab’)、f(ab’)2、fv、dab、fd、互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与axl结合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。

本发明的结合分子也可以特异性结合axl蛋白的一或多个片段。对于治疗和/或预防由axl蛋白过表达诱导的疾病的方法而言，所述结合分子优选能特异性结合细胞表面蛋白质。

作为本发明的另一方面，本发明的结合分子还包括前面所述的结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合axl或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合axl蛋白或其蛋白片段。

功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酰化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机pcr介导的诱变，并且可包含天然以及非天然氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。

此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合axl蛋白或其片段。

所述功能变体还包含对高变区的修饰，高变区包含来自cdr的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。

本领域技术人员已知的计算机算法如gap或者bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错pcr、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。

本发明的功能变体对于axl具有亲和活性。所述亲和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语“结合分子”时，其也涵盖所述结合分子的功能变体。

本发明还提供了前面所述的结合分子的核酸分子。

所述核酸分子编码前面所述的结合分子。

进一步，所述核酸分子包括seqidno:9、seqidno:10、seqidno:14、seqidno:12所示的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列，或包括与seqidno:9、seqidno:10、seqidno:14、seqidno:12所示的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列至少在80％以上的核苷酸序列。

优选地，所述核酸分子包括seqidno:9、seqidno:10、seqidno:14、seqidno:12所示的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列。

具体明确，seqidno:7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是seqidno:9；seqidno:8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是seqidno:10；seqidno:13所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是seqidno:14；seqidno:11所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是seqidno:12。

本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。

一旦获得了有关的序列信息，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合分子(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合分子的序列中。

本发明还提供了一种包括前面所述的核酸分子的表达载体，除了前面所述的核酸分子之外，表达载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。

这些表达载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本发明还提供了一种含有前面所述的核酸分子或前面所述的表达载体的宿主细胞。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho,cos,293细胞、或bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞是cho。

用重组dna转化、转染宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化、转染方法包括但并不限于：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，以表达本发明的结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的结合分子优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。

本发明提供了一种包括前面所述的结合分子的药物组合物、检测产品、或诊断产品。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

本发明还提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个标记物可检测的部分/物质的分子。

本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。

包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否己经患有axl过表达诱导的疾病或者作为临床实验程序的一部分监测axl过表达诱导的疾病的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。

为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记结合分子的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。

进一步，所述检测产品或所述诊断产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述结合分子的能够检测出axl蛋白表达水平的检测产品或诊断产品均包括在本发明的范围之内。

本发明还提供了一种非诊断目的的检测axl蛋白水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取含有axl的样品；

(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的结合分子接触；

(3)检测样品与结合分子的免疫反应。

本发明还提供给了一种利用前面所述的宿主细胞产生本发明的结合分子的方法，所述方法包括在合适的条件下培养前面所述的宿主细胞并回收所述结合分子。

本发明还提供了一种通过上述方法产生的结合分子。所述结合分子是抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供了前面所述的结合分子在制备检测产品或诊断产品中的应用；所述检测产品是检测axl蛋白表达量的产品，所述诊断产品是诊断以axl蛋白过表达为表征的疾病的产品；优选地，以axl蛋白过表达为表征的疾病包括肿瘤、纤维化或肝硬化。

所述检测产品或诊断产品包括前面所述的结合分子；所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的结合分子能够检测出axl蛋白表达水平的检测产品或诊断产品均包括在本发明的范围之内。

本发明还提供了前面所述的结合分子在制备预防或治疗由axl蛋白过表达诱导的疾病的药物制剂中的应用；优选地，所述由axl蛋白过表达诱导的疾病包括肿瘤，或肿瘤耐药性。

所述肿瘤包括但不限于，乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、肝细胞癌、甲状腺癌、食管癌、慢性髓细胞白血病(cml)、急性髓细胞白血病(aml)、骨肉瘤、黑素瘤、头颈鳞状细胞癌。

所述由axl蛋白过表达诱导的肿瘤耐药性包括肺癌、乳腺癌、食道癌、胃肠道间质细胞瘤和急性粒细胞白血病等肿瘤中由于axl高表达而产生的耐药性。

本发明的公开的抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强的抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。

本发明的抗体可以被设计为在fc区域内包含修改，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。

本发明的抗体可以被设计的另一个修饰是聚乙二醇化。抗体可被聚乙二醇化从而，例如，增加抗体的生物(如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，该抗体或其片段通常在适合于一个或多个聚乙二醇(peg)集团连接到该抗体或抗体片段的条件下，与peg反应，如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物。优选地，该聚乙二醇化是通过与活性的peg分子(或类似的活性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应而实现。

本发明的结合分子可以单独应用或者于包含本发明的结合分子的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。

本发明的结合分子还可以与其他具有相同或者互补功能的药物联合应用，联合应用的效果可以是结合分子与其他药物功能之和，还可以远远大于结合分子与其他药物功能之和，这种情况表明该结合分子与其他药物之间产生了协同作用。

本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变性集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区(可变区中较保守的部分)，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与依赖于抗体的细胞毒性。

如本文中所用，“axl”和“axl蛋白”可互换地使用。

如本文所用，术语“载体”是指表达载体和非表达载体，并包括病毒和非病毒载体，其包括染色体外载体(如，多拷贝质粒)和整合载体(其设计为可并入宿主染色体)。

本文所述的“样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。

如本文所用，术语“分离的”是指从其天然环境中分离出的蛋白质(即，从至少一种其天然伴随的其它组分中分离)。

本发明的优点和有益效果：

本发明以axl蛋白细胞外结构域作为抗原，利用常规的抗体制备技术，获得高效价、高特异性及高亲和力的抗axl的单克隆抗体。由于该抗体效价高、特异性好、亲和力强，可直接作为抗axl类药物用于预防和治疗由axl过表达诱导的疾病。

附图说明

图1显示真核表达载体pcmv-163的物理图谱；

图2显示利用elisa检测9a抗体与抗原axl-fc的结合情况；

图3显示利用elisa检测9a抗体与抗原axl的结合情况；

图4显示利用流式分析技术检测9a抗体与a549细胞表面axl的结合情况。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1抗体筛选

为了避免个体免疫背景的偏向性，尽可能保证抗体库的多样性，利用淋巴细胞分离液分离100名成年健康人(男女各半)外周血及10例新生儿(男女各半)脐带血淋巴细胞，共收集2×10⁹个细胞。trizol法提取总rna，反转录为cdna，常规pcr方法扩增不同抗体亚型的可变区基因。根据抗体库载体pdf(军事医学科学院院刊，2008，32(4)：305-308，358.)信息，引入酶切位点bsshii、nhei和带有loxp511序列(序列为：sggstitsynvyytklsssgt(seqidno：15))的连接肽，通过重叠pcr方法拼接成scfv(单链抗体：vl-linker(含loxp511序列)-vh，上下游分别引入bsshii、nhei位点)形式(具体方法见《生物文库技术》，邵宁生等主编，军事医学科学出版社，2011年第一版)。电泳分离后，将所获得的scfv用bsshii、nhei酶切后克隆入同样酶切处理的pdf载体中，电穿孔转化大肠杆菌xl1-blue(agilenttechnology)。经sb培养液扩大培养后，加1×10¹³pfu辅助病毒vcsm13(biovectorntccinc.)感染，获得初级噬菌体抗体库，测定效价为8×10¹²cfu/ml。按比例(感染复数moi>200)混合初级抗体库和bs1365菌[基因型：f’kanreca1enda1grya96thi21δlacu169supe44hsdr17(λimm434x12cre)](biovectorntccinc.)，借助bs165菌表达的cre重组酶介导loxp/loxp511重组(具体方法参考：humantibodies.1999；9(1):67-77；jbiomolscreen.2014feb4；19(6):839-846.)，得到大容量重组抗体库。

利用哺乳动物细胞-中国仓鼠卵巢细胞cho-k1(ccl-61^tm)表达的人axl蛋白(人axl蛋白胞外段-人igg1fc段融合蛋白，命名为axl-fc，其中人axl的序列信息参考np_068713，人igg1fc片段的序列参考aeo21920.1)为靶点，筛选靶抗体。5％脱脂奶粉封闭axl-fc包被的免疫试管(maxisorp免疫试管，thermonunc)后，加入上述噬菌体抗体库，37℃孵育2h；弃去未结合的噬菌体，tbs-t洗液洗涤5遍，充分洗去非特异吸附噬菌体；加入1ml洗脱缓冲液(0.1mol/l甘氨酸-hcl，ph2.2)洗脱噬菌体并以40μl2mol/ltris溶液中和；加入对数期xl1-blue菌、sb培养基(sb培养液：胰蛋白胨30g，酵母提取物20g，mops10g，溶于950ml去离子水中，氢氧化钠调ph值至7.0，定容至1l，高压灭菌)及辅助噬菌体vcsm13进行扩增富集；重复该过程3-4轮，将洗脱下来的噬菌体感染新鲜制备的对数期xl1-blue菌涂培养板，37℃过夜培养后，随机挑取单克隆至96孔深孔板(corning)，扩大培养后进行phage-elisa(具体方法参考：军事医学科学院院刊，2008，32(4)：305-308，358。)，检测与抗原的结合特性；共鉴定165个克隆，其中48个特异性结合axl-fc的克隆中，9a结合活性最好。

将9a克隆送测序，所获得的可变区基因经http://www.abysis.org/在线分析，获得的9a克隆中，重链可变区序列如seqidno:7所示，其cdr1、cdr2、cdr3区氨基酸序列依次为seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3；轻链可变区序列为seqidno:8，其cdr1、cdr2、cdr3区氨基酸序列分别为seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6。编码所述重链可变区的核酸序列如seqidno:9所示；编码轻链可变区的核酸序列如seqidno:10所示。

实施例2抗体表达纯化

将获得的9a克隆可变区基因克隆入含有人igg恒定区基因的真核表达载体pcmv-163中，构建全抗体表达载体，其物理图谱如图1所示(真核表达载体pcmv-163的各个组成成分均为本领域已知的成分，按照所示次序重组而成)。全抗体称为9a抗体(轻链氨基酸序列为seqidno:11，核苷酸序列为seqidno:12；重链氨基酸序列为seqidno:13，核苷酸序列seqidno:14)。将获得的真核表达载体，通过使用expichotmexpressionsystem试剂盒(thermofisherscientific,#a29133)，将9a真核表达载体转染至cho-s细胞中，经过elisa试验利用羊抗人igg(kpl，#01-10-06)以及辣根酶标记的羊抗人igg(goatantihuman(hrp)，thermofisherscientific，#31412)进行双夹心elisa法检测上清中抗体的含量，以未转染上清作为阴性对照，人igg纯品作为标准品)，检测培养上清中抗体表达量，筛选获得表达量较高的单克隆细胞株。收集足够上清，利用常规的proteina亲和纯化目标抗体。

实施例3抗体结合活性分析

将靶抗原axl-fc包被elisa板条，1μg/ml，4℃过夜；pbst洗涤后，加入10％的胎牛血清，37℃封闭1小时；加入不同浓度的9a抗体，37℃反应1小时；pbst洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人fab二抗(goatanti-humanigg(fab')2-hrp，abcam)，37℃反应30分钟；pbst重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μltmb(ebioscience)，室温(20±5℃)避光放置1.5min；每孔加入100μl2nh2so4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取od值，分析抗体与靶抗原axl-fc结合能力。9a抗体能特异性识别靶抗原axl-fc；该识别活性呈显著的剂量依赖性，结果如图2所示。

实施例4抗体特异性识别靶抗原

将milk(牛奶)(北京博迈德生物技术有限公司)、bsa(bovogen)、cd19(北京义翘神州生物技术有限公司)、trop2(北京义翘神州生物技术有限公司)、bcma(北京义翘神州生物技术有限公司)、cd47(北京麦格珀尔生物科技有限公司)、cd38(北京义翘神州生物技术有限公司)、gas6(r&d)等各蛋白以及axl(acrobiosystems)分别包被elisa板条，1μg/ml，4℃过夜；pbst洗涤后，加入10％的胎牛血清，37℃封闭1小时；加入9a抗体，37℃反应1小时；pbst洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人igg二抗(goatanti-humanigg-hrp，thermofisherscientific)，室温反应30分钟；pbst重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μltmb(ebioscience)，室温(20±5℃)避光放置1.5min；每孔加入100μl2nh2so4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取od值，分析抗体与蛋白结合能力。

结果显示，9a抗体均能特异性识别靶抗原axl，但与milk(牛奶)、bsa、cd19、trop2、bcma、cd47、cd38、gas6等蛋白均无显著的结合反应；结果如图3所示。

实施例5抗体识别细胞表面抗原

利用流式分析技术检测a549细胞表面axl与9a的结合。收集对数生长期a549细胞，调整细胞密度到5×10⁶cell/ml，冰上预冷。含2％fbs预冷的生理盐水稀释9a抗体至20μg/ml。取100μl细胞，加入等体积前述稀释9a抗体，4℃避光反应30min。结束后，用含2％fbs预冷的生理盐水洗两次(6000rpm，45s)。用含2％fbs预冷的生理盐水按1：5稀释pe标记的小鼠抗人igg二抗(pemouseanti-humanigg，bdpharmingen)，取100μl重悬细胞，4℃避光反应30min。反应结束后，用含2％fbs预冷的生理盐水洗两次(6000rpm，45s)。用400μl1％多聚甲醛重悬细胞。流式细胞仪(bdcalibur)分析抗体与细胞表面抗原的结合能力。

结果显示，9a抗体能特异性识别a549细胞表面axl，结果如图4所示。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110>杭州尚健生物技术有限公司

<120>单克隆抗体9a及其应用

<160>15

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