一种无岩藻糖基化的单克隆抗体的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种无岩藻糖基化的单克隆抗体。

背景技术：

蛋白质糖基化是一种最为常见的翻译后修饰方式，是在糖基转移酶的作用下将寡糖转移至蛋白质，从而和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。哺乳动物糖中蛋白质的糖基化类型主要分为三种：即由一个或多个单糖单元构成的n-连接糖链、o-连接糖链和gpi糖基磷脂酰肌醇锚。糖基化修饰使得不同的蛋白质具有不同的标记，由于糖蛋白质量数和电荷数的差异，单个糖基化位点即可产生明显的异质性。糖蛋白的寡糖链结构多样，具有丰富的识别信息，因此涉及到许多生物调节和识别过程，包括受体识别、炎症及自身免疫疾病、信号传导及新陈代谢等过程。此外，治疗性蛋白的安全性、药效性和血清半衰期等特性也会受到其糖基化模式的影响。

作为最重要的一类治疗性蛋白，重组单克隆抗体药物的有效性也高度依赖于其正确的糖基化模式。目前所有批准用于治疗的单克隆抗体均为免疫球蛋白g(immunoglobuling,igg)，大部分为igg1。研究表明，人igg重链fc段的ch2区域内含有一个保守的n-连接糖基化位点asn-297。因此每个igg都可连接两个具有n-连接的二分支或多分支双触角复合型寡糖，包含30余种不同的糖链类型，使抗体表现出高度的异质性。糖链模式分析表明，人iggasn-297位点的n-糖链结构通常为多至两个半乳糖(gal)残基为末端的核心岩藻糖化二分支复合型核心结构。核心结构包括两个β-n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)和三个甘露糖(man)单元。根据末端gal残基的数量和连接方式，抗体的糖型可分为g0、g1和g2多种类型，部分为具有核心岩藻糖基化的，如g0f，g1f等。抗体fc段是细胞毒作用效应细胞配体结合位点，因此糖链结构的存在对于抗体介导的效应功能例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc)是至关重要的。

目前，美国和欧盟批准的抗体药物43％由cho细胞产生，50％来源于其它鼠源工程细胞(nso或者sp2/0)，只有7％是由大肠杆菌表达的非糖基化抗体。虽然早期试验证明ch0能够产生与人类血清抗体糖型一致的抗体，但大多数工程细胞株产生抗体的糖基化与人血清抗体仍然存在着差别。例如鼠源性动物细胞产生的抗体糖型很少存在平分型半乳糖苷修饰，其岩藻糖修饰比例很高，且半乳糖苷(g)化修饰程度也比人血清抗体低，因而其主要的类型为g0f，而人血清抗体糖基化类型主要为g1f，如罗氏公司研制的治疗b淋巴细胞瘤的抗人cd20嵌合单克隆抗体—利妥昔单抗(商品名为美罗华)，是利用哺乳动物细胞系表达生产的，其糖链结构主要为核心结构岩藻糖化的g0f糖型。近年来有很多研究表明，去除或降低岩藻糖基团可以明显增强治疗性抗体的adcc活性，在体内和体外均能表现出更高的效能。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有单克隆抗体所存在的上述缺陷，提供一种具有高体外生物活性的无岩藻糖基化的单克隆抗体。

为达到以上目的，本发明提供了一种无岩藻糖基化的单克隆抗体，所述单克隆抗体为人igg抗体，所述单克隆抗体的糖型核心结构以无岩藻糖化糖型为主。

优选地，所述单克隆抗体糖型核心结构的无岩藻糖化糖型比例占80％-100％以上。

优选地，所述单克隆抗体糖型核心结构的g2糖型占无岩藻糖化糖型30％-100％。

优选地，所述g2糖型单克隆抗体是其抗体的糖型核心结构上不含岩藻糖基团，且糖链末端具有2个半乳糖基团。

优选地，所述g2糖型单克隆抗体的糖型核心结构如式(i)所示的糖链结构：

优选地，所述单克隆抗体为抗cd20抗体。

优选地，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列如seqidno.1所示。

优选地，所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明提供了上述单克隆抗体在制备药物中的应用。

所述的药物为治疗表达cd20的癌症的药物。

所述的药物为治疗或诊断b淋巴细胞瘤的药物。

含有本发明所述单克隆抗体的药物也属于本发明保护范围。

本发明还提供了一种用于治疗癌症的组合物，其特征在于，所述组合物上述任意一项所述的单克隆抗体。

本发明还提供了上述单克隆抗体的生产方法是利用转基因动物进行乳腺表达生产。

优选地，所述的转基因动物是转基因奶牛。

本发明所提供的无核心岩藻糖化的单克隆抗体，比岩藻糖化单克隆抗体表现出更高的体内外生物活性，能够用于开发更有效的治疗性单克隆抗体药物。

附图说明

图1为抗cd20抗体糖型结构，图中glcnac：n-乙酰氨基葡萄糖；man：甘露糖；gal：半乳糖。

图2为本发明实施例3所述重组抗体抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(adcc)实验结果；其中：anti-cd20为重组抗体；rituxan为商业化美罗华作为阳性对照；herceptin为阴性对照。

图3为本发明实施例4所述小鼠体内药效学实验结果；其中：实验组为重组抗体；阳性对照为商业化美罗华；阴性对照为生理盐水。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。分子克隆操作方法参见《分子克隆实验克隆(第三版)》(科学出版社)，细胞操作方法参见《动物细胞培养——基本技术和特殊应用指南(原书第六版)》(科学出版社)。

实施例1无岩藻糖基化抗cd20抗体结构

本发明提供一种无岩藻糖基化的人igg单克隆抗体，其糖型核心结构以无岩藻糖化糖型为主，占50％-100％，其中g2糖型占无岩藻糖化糖型30％-100％，而g2糖型其抗体的糖型核心结构上不含岩藻糖基团，且糖链末端具有2个半乳糖基团。

本发明提供的无岩藻糖基化的单克隆抗体可以是任何一种人igg单克隆抗体，其中优选一种无岩藻糖基化抗cd20抗体，其重链氨基酸序列如seqidno.1所示，其轻链氨基酸序列如seqidno.2所示，其中重链上asn-320位点的糖链结构如图1所示。与美罗华单抗的主要糖型相比(美罗华抗人cd20抗体糖型结构中g0f、g1f和g2f等岩藻糖化糖型含量大于95％，而g0糖型等无岩藻糖化糖型占比小于5％)，本发明所提供的抗cd20单抗体的糖型核心结构以无岩藻糖化糖型为主，其中无岩藻糖化糖型比例占50％-100％，其中g2糖型占无岩藻糖化糖型30％-100％，而g2糖型其抗体的糖型核心结构上不含岩藻糖基团，且糖链末端具有2个半乳糖基团。

实施例2无岩藻糖基化抗cd20抗体表达与获得

利用实施例1所述的氨基酸序列seqidno.1和seqidno.2分别设计出抗人cd20抗体的重链基因序列和轻链基因序列，可采用商业化乳腺特异表达载体，如pbc1载体，也可以根据相关文献表达自行设计乳腺特异表达载体，重组单抗表达结构主要包括乳腺特异表达基因的上游调控区、重链基因序列或轻链基因序列，以及乳腺特异表达基因的下游调控区。本发明所提供的无岩藻糖基化抗cd20抗体以转基因动物乳腺表达生产，所选转基因奶牛、转基因羊、转基因兔、转基因猪和转基因牛。

以转基因奶牛为例，将上述的单抗重链基因乳腺表达载体和轻链基因乳腺表达载体按摩尔比1：1混合，将混合液电击转染或显微注射到奶牛成纤维细胞或输卵管上皮细胞，对转染后进行单细胞克隆化培养和扩展，以所转染的载体序列设计引物，通过pcr分子检测，获得重链基因和轻链基因同时整合的转基因细胞，以转基因细胞为核供体进行核移植操作，借助显微操作仪将转基因细胞核移植到事先已去核的牛卵母细胞，获得重链基因和轻链基因共整合的转基因胚胎，采用奶牛繁育生产中广泛应用的非手术法胚胎移植技术，将转基因胚胎移植到代孕奶牛体内，妊娠到期后获得重链基因和轻链基因共整合的转基因奶牛，转基因奶牛性成熟后，采用奶牛繁育生产中广泛应用的人工授精技术对转基因奶牛进行配种，转基因奶牛经过妊娠产犊，后续转基因奶牛的生产也采用人工授精技术。从转基因奶牛所产牛奶中纯化出重组单抗，即利用ge公司的proteina分离获得纯度95％以上的重组单抗(操作方法参见产品说明书)，经氨基酸测序鉴定，确定重组单抗的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列分别与seqidno.1和seqidno.2一致，表明转基因奶牛所生产的重组单抗即为重组抗人cd20抗体。

实施例3重组无岩藻糖基化抗cd20抗体糖型鉴定

通过lc-ms方法比较实施例2制得的重组抗体与美罗华之间寡糖链的类型及含量。向上述完整重组抗体样品中加入pngasef，充分混匀后37℃孵育24小时，再加入冰乙醇至终浓度为75％，冰浴20分钟后，过hilic柱，冻干，向冻干的糖中加入50微升的2-ab标记液，震荡待糖全部溶解后65℃避光孵育5小时，过hilic柱后冻干重溶，上机；通过一级质谱精确分子量确定游离寡糖的类型；通过面积归一化法计算主要糖形的含量。

经分析，转基因奶牛所表达的重组抗人cd20抗体糖型结构中，岩藻糖化糖型含量小于0-15％，而无岩藻糖化糖型单抗占比为80-100％，且g2糖型(糖型核心结构上不具有岩藻糖基团，且糖链末端具有2个半乳糖基团)单抗占无岩藻糖化糖型的比例为30-100％，而对照美罗华则以g0f、g1f和g2f等岩藻糖化糖型为主，占95％以上，而无岩藻糖化糖型占比不到5％。

实施例4无岩藻糖基化抗cd20抗体adcc实验

选取daudi和raji细胞(购自北京协和医科大学基础医学研究所细胞中心)作为靶细胞，daudi和raji细胞是两种体外培养的b淋巴瘤细胞，这两种细胞表面均含有cd20抗原分子，被广泛用于抗cd20抗体的细胞活性检测。重组单抗(试验组)，市售的美罗华(阳性对照组)和生理盐水(阴性对照组)。

离心收集靶细胞，用assaybuffer重悬清洗后再离心弃上清待用。用adccbuffer调整靶细胞密度至4×浓度即2×10⁵/ml，按每孔50μl铺到96孔板中，加入抗体与靶细胞共孵育30分钟。将效应细胞nk/92/cd16a(158v/v)加入孵育的实验孔板继续孵育6小时。孵育结束后，低转速离心使所有细胞沉到板底后，吸取50μl上清至新的96孔板，加入50μlldh检测液后在室温度孵育30分钟。在flexstation3上检测ldh反应的od值，检测波长为od492nm，背景波长为od650nm。量效曲线采用graphpadprismversion6.0的sigmoidaldose-reponse(variableslope)进行分析。如图2所示，实施例2制得的重组抗cd20单抗和美罗华单抗均对靶细胞引起样品浓度依赖的adcc效应(抗体依赖的细胞介导细胞毒性作用)，阴性对照herceptin对daudi不能引起有效的adcc效应。重组单抗的adcc效应比美罗华(rituxan)要高，与前面糖基化预测结果相一致。

实施例5重组抗体小鼠体内药效学实验

扩增raji细胞，按4×10⁶细胞量/只小鼠，分别进行30只scid小鼠的尾静脉注射，建立模型。将小鼠随机分为3组，每组10只小鼠，立即开始给药治疗，药物包括实施例2所生产的重组单抗(试验组)，市售的美罗华(阳性对照组)和生理盐水(阴性对照组)注射剂量为100ug/mouse。监测小鼠生存情况。实验于分组给药后66天结束。如图3所示，生理盐水阴性对照组小鼠由于后肢瘫痪，分别于给药后14、17、18、19、21、22天进行动物安乐死。美罗华阳性对照组小鼠于给药后17天、43天分别发现一只小鼠后肢瘫痪安乐死。受试抗体药组无小鼠瘫痪和安乐死，对raji淋巴癌系统性模型具有很好的效果。重组抗体小鼠体内药效学实验表明，本发明实施例2制得的无岩藻糖基化抗cd20抗体可用于治疗表达cd20的癌症，包括b细胞淋巴瘤等。

实施例6重组抗体人源fc受体亲和力测定

通过表面等离子共振法(surfaceplasmonresonance,spr)检测2种fc受体(humancd16a(158phe)及humancd16a(158val))(购自北京百普赛斯生物科技有限公司)和实施例2制得的重组抗体之间的亲和力。固定有fc受体蛋白(humancd16a(158phe)及humancd16a(158val))的通道作为检测通道，未固定fc受体蛋白的通道作为对照通道，过程如下：(1)表面平衡：hbs-ep缓冲液，以10μl/min的流速平衡芯片表面5min；(2)表面活化：注射‘nhs+edc’1：1混合液，以10μl/min的流速活化芯片表面7min；(3)耦联蛋白：注射fc受体蛋白(稀释在10mm醋酸钠(ph5.0)缓冲液中)，以10μl/min的流速耦联约7min；对照通道省略此步骤；(4)表面封闭：注射乙醇胺，以10μl/min的流速封闭表面7min。亲和力分析实验的检测温度为25℃，缓冲体系为hbs-ep。实验采用多循环测定法，每个循环分为系列浓度分析物注射至芯片表面监测结合解离信号以及芯片再生两步步骤，结果如表1，结果表明，本发明实施例2制得的重组anti-cd20抗体与两个fc受体的亲和力均高于美罗华与相应受体的亲和力。

表1重组抗体与人源fc受体亲和力测定结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>无锡科捷诺生物科技有限责任公司;北京济福霖生物技术有限公司

<120>一种无岩藻糖基化的单克隆抗体

<130>khp161110419.3q

<160>2

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