一种抗EGFR单克隆抗体制剂的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，提供了一种稳定的抗egfr单克隆抗体制剂。
背景技术：
：表皮生长因子受体（egfr）也称作c-erbb1/her1，其家族成员都是生长因子受体酪氨酸激酶，它们在细胞表面与特异的生长因子或天然配体相互作用，如与egf或tgfα相互作用，由此活化受体酪氨酸激酶。已发现的该家族第一个成员是表观分子量为165kd的糖蛋白。egfr在调节肿瘤细胞的生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移中具有重要的作用，同时在相当一部分的人类肿瘤中有表达。在很多恶性肿瘤中，egfr的表达往往与较差的预后和较低的生存率相关。由此可知，如果有药物能阻断egfr的活性，那将会抑制其磷酸化和信号传导，从而起到多重途径的抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。在一些研究中，egfr抑制剂与多种化疗药物和放疗药物联合作用于一些肿瘤株时，表现出累加和协同作用。egfr抑制剂主要包括单克隆抗体（mab）、酪氨酸激酶抑制剂、喹唑啉pyralo-/吡咯并-/吡啶并嘧啶、配体-毒素和免疫毒素联结物，以及反义核苷酸和egfr/配体主导的疫苗等。一些体内和体外实验显示抗egfr抗体成功的抑制了表达egfr的肿瘤细胞株的生长。在实体瘤的治疗中，一些抗egfr单克隆抗体单独应用或与传统治疗方法合并应用的治疗结果令人鼓舞。糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。蛋白质分子表面的糖链可对蛋白质分子的结构和功能产生深远的影响，糖基化作为重要的翻译后加工过程，对蛋白质的正确折叠、定位、免疫原性以及生物学活性有很大的影响。mab的糖基化聚糖结构与抗体效应功能之间密切相关，通过影响igg分子与fcrs、clq以及fcrn的结合而分别调节igg分子的抗体依赖细胞毒作用(adcc)、补体依赖的细胞毒作用(cdc)以及半衰期。糖基化作用还会影响mab的安全性特征，特别是非人源聚糖，具有潜在的免疫原性。存在于fab功能区的聚糖可以同时影响此类药物的安全性和有效性特征。糖基化修饰高度依赖于细胞表达系统和亚克隆选择，细胞培养过程中的诸多因素，如培养基的成分，培养条件均会影响糖基化，进而影响治疗性蛋白的生物学活性，疗效，免疫原性以及药代动力学。在当前已上市的治疗型单克隆抗体中，绝大多数是通过重组dna技术实现的，绝大多数应用体外细胞培养的技术。由于哺乳动物细胞结构、功能和基因表达调控的复杂性，外源基因在哺乳动物细胞中的表达与在原核生物中的表达存在较大差异，因而外源基因在哺乳动物细胞中高效表达所需的元件也不同于在原核生物细胞中的表达所需的元件。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mrna翻译及翻译后修饰等过程，翻译后修饰主要包括蛋白质的糖基化、磷酸化、寡聚体的形成以及蛋白质分子内或分子间二硫键的形成，翻译后修饰对于蛋白质的功能至关重要，要表达某些具有生物学功能的蛋白质如膜蛋白、抗体和具有特异性催化功能的酶有时必须在哺乳动物细胞中进行。cho细胞和小鼠骨髓瘤细胞(ns0,sp2/0)表达系统已经成为当前治疗性抗体和fc-融合蛋白的金标准哺乳动物工程细胞。据统计，目前已批准上市的治疗性单抗中,48%表达于cho细胞，而45%表达于鼠源细胞（21%ns0细胞，14%sp2/0细胞，10%杂交瘤细胞）。尽管多肽链的完整性在不同的表达系统和培养条件下看似不会发生变化，但糖基化类型的重大改变不容忽视。抗体、与其他蛋白质治疗剂一样都是复杂的分子，并且由于在哺乳动物特别是人类中的治疗有效剂量，通常不得在药物制剂中使用大量的抗体。蛋白质治疗剂的液体制剂应当保留蛋白质治疗剂的完整生物活性并保护蛋白质治疗剂的官能团在生产和贮存期限免于降解，蛋白质的降解途径可以涉及化学不稳定性或物理不稳定性。抗体药物制剂应当是长期稳定的、含有安全且有效量的药物制剂，由抗体的特殊结构及性质决定，抗体类药物在制备、保存、运输过程中需要能够使其稳定的环境。对于不同种类的蛋白质，不同种类的抗体，其理化性质和降解反应等都不同，因此，抗体类药物制剂的制剂缓冲液组合物配方也不尽相同。为了解决抗体药物的稳定性问题，使其在运输和贮藏过程中仍然保证有效性，很多抗体类药物制剂是以粉针剂的形式供给患者使用。但是，粉针剂在使用时需要使用无菌注射用水或是经过配制的使用于溶解抗体的液体制剂，这样使用会给患者带来不必要的麻烦。目前通过皮下（sc）注射是单克隆抗体治疗慢性疾病的一种优选实施方式，将抗体药物制备成预充针式的液体制剂，极大地方便患者携带及使用。但是，制剂中药物的含量、药物的物理性质、化学性质等因素都会影响制剂的有效性，需要合适的缓冲体系来确保药物治疗性能的同时，提高高浓度抗体制剂的稳定性。已经尝试了不同的配制剂策略以降低高浓度单克隆抗体液体溶液的粘度，用盐、氨基酸、或糖进行配制。糖和多元醇属于非特异性蛋白质稳定剂，其中蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇等最为常用。技术实现要素：具有seqidno：1所述核苷酸序列的轻链及seqidno：3所述核苷酸序列的重链的egfr单克隆抗体，经过基础培养基chom-b02和补充培养基chom-s01培养后，获得与现有egfr抗体panitumumab（vectibix）不同的糖型，使用现有技术中的制剂配方，产生沉淀、浑浊等现象，不符合中国药典所要求的制剂标准。因此，本发明提供：一种抗egfr单克隆抗体制剂，其特征在于，液体药物制剂，包括存在于缓冲液中的治疗有效剂量的抗egfr单克隆抗体h5a3。如上所述一种抗egfr单克隆抗体制剂，其特征在于，所述抗egfr单克隆抗体h5a3，具有seqidno：2所述氨基酸序列的轻链，及具有seqidno：4所述氨基酸序列的重链。如上所述一种抗egfr单克隆抗体制剂，其特征在于，所述的抗egfr单克隆抗体h5a3经过以下步骤培养获得：a）、一种抗egfr单克隆抗体具有seqidno：1所述核苷酸序列的轻链及具有seqidno：3所述核苷酸序列的重链；b）、利用步骤a）所得核苷酸片断构建重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆；c）、优化培养条件，采用基础培养基和补充培养基大规模培养，获得新型抗egfr单克隆抗体，分离纯化。如上所述一种抗egfr单克隆抗体制剂，其特征在于，所述的抗egfr单克隆抗体h5a3经过基础培养基chom-b02和补充培养基chom-s01培养获得。如上所述一种抗egfr单克隆抗体制剂，其特征在于，液体药物制剂，缓冲液ph5.8，包括：a）20mg/ml的h5a3，b）1.0mg/ml聚山梨酯80，c）80mg/ml海藻糖二水合物，d）6.8mg/ml醋酸钠三水合物，e）5.8mg/ml氯化钠。经过上述优化培养条件，大规模培养，分离纯化，获得抗egfr抗体h5a3抗体，采用此种方法生产的抗egfr抗体h5a3抗体表达量为3g/l，且使用基础培养基（chom-b02）和补充培养基（chom-s01）成本低。针对上述条件获得的抗egfr单克隆抗体的制剂不稳定性，本发明提供优选制剂配方：液体药物制剂，缓冲液ph5.8，包括：a）20mg/ml的h5a3，b）1.0mg/ml聚山梨酯80，c）80mg/ml海藻糖二水合物，d）6.8mg/ml醋酸钠三水合物，e）5.8mg/ml氯化钠。附图说明图1、panitumumab游离寡糖flr积分图图2、panitumumab样品寡糖保留时间及其结构、分子量、比例结果图3、panitumumab样品寡糖保留时间及其结构、分子量、比例结果图4、h5a3游离寡糖flr积分图图5、h5a3样品寡糖保留时间及其结构、分子量、比例结果图6、h5a3样品寡糖保留时间及其结构、分子量、比例结果图7、h5a3振荡实验外观趋势图图8、h5a3振荡实验蛋白含量趋势图图9、h5a3振荡实验不溶性颗粒（≥10μm）趋势图图10、h5a3振荡实验不溶性颗粒（≥25μm）趋势图图11、h5a3振荡实验sec-hplc/uplc聚合体含量趋势图图12、h5a3振荡实验粒径趋势图图13、样品s0的dsc扫描图谱图14、样品s1的dsc扫描图谱图15、样品s2的dsc扫描图谱图16、样品s3的dsc扫描图谱图17、样品s4的dsc扫描图谱图18、样品s5的dsc扫描图谱图19、样品s6的dsc扫描图谱。具体实施方式实施例1、抗egfr单克隆抗体h5a3的制备抗egfr单克隆抗体h5a3的制备方法，包括以下步骤：a）、将抗egfr单克隆抗体的轻重链核苷酸（轻链seqidno：1和重链seqidno：3）构建重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆；b）、优化培养条件，大规模培养，分离纯化，获得抗egfr单克隆抗体h5a3。（1）宿主细胞的选择与改造本发明选用治疗性抗体工业化生产应用更加广泛的cho细胞作为宿主细胞，并对cho-k1进行了适宜的改造。利用crispr/cas技术敲除了cho-k1的gs基因，获得的细胞系命名为cho-cr-gs-/-消除了内源性gs表达，因此更加有利于高表达细胞克隆的筛选。（2）转染宿主细胞筛选高表达克隆脂质体法共转染cho-cr-gs-/-，gs筛选系统加压筛选获得高效表达抗egfr单克隆抗体的稳定细胞克隆。经过多轮的转染及筛选，获得了表达量大于20pg/cell.day的细胞克隆。（3）无血清培养适应及培养条件的优化利用针对cho-cr-gs-/-通用型的基础培养基chom-b02（上海迈泰君奥生物技术有限公司商品），及补充培养基chom-s01（上海迈泰君奥生物技术有限公司商品）培养，即按细胞生长需要将一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和微量元素等组合成的基础培养基。基础培养基能够初步满足筛选获得的工程细胞的生长需要，为进一步提高工程细胞目的抗体的产量，对基础培养基进行了针对性的优化调整，包括添加基因工程重组生长因子，调整氨基酸的量。经过上述优化培养条件，大规模培养，分离纯化，获得抗egfr抗体h5a3抗体。采用此种方法生产的抗egfr抗体h5a3抗体表达量为3g/l，且使用基础培养基（chom-b02）和补充培养基（chom-s01）成本低。实验例1、对照样品糖基化分析采用lc/ms，ms/ms技术对panitumumab（vectibix）样品进行糖链的分析。（1）n糖的酶切及游离寡聚糖的制备取panitumumab样品0.5mg，用超滤管超滤浓缩，置换缓冲液，缓冲液为50mmol/l的碳酸氢铵溶液（ph：8.0），总体系为100ul，再将样品加入到1管pngasef中，37℃孵育24小时。（2）参照标准操作规程制备2-ab荧光标记的寡聚糖首先使用hilic固相萃取柱脱去溶液中的蛋白和盐，真空离心冻干；将冻干好的样品溶解在30%醋酸+70%dmso反应体系中，并加入2-ab至终浓度50mg/ml，氰基硼氢化钠至终浓度60mg/ml，65℃避光干浴4小时；最后，再使用hilic固相萃取柱除掉样品中多余的标记物，acquityuplcbehglycan1.7μm2.1×150mm柱后质谱分析。panitumumab游离寡糖flr积分图见图1，panitumumab样品寡糖保留时间及其结构、分子量、比例结果见图2和图3。结果：panitumumab样品中g0f糖型比例为36.79%，g1f糖型比例为16.21%，g1f‘糖型比例为21.90%，g2f糖型比例为7.84%，去核心岩藻糖糖型比例为9.45%，岩藻糖糖基化二天线寡糖比例为84.48%，样品中高甘露糖型比例为7.01%。实验例2、h5a3抗体糖基化分析采用lc/ms，ms/ms技术对h5a3单克隆抗体进行糖链的分析。（1）n糖的酶切及游离寡聚糖的制备取h5a3样品0.5mg，用超滤管超滤浓缩，置换缓冲液，缓冲液为50mmol/l的碳酸氢铵溶液（ph：8.0），总体系为100ul，再将样品加入到1管pngasef中，37℃孵育24小时。（2）参照标准操作规程制备2-ab荧光标记的寡聚糖首先使用hilic固相萃取柱脱去溶液中的蛋白和盐，真空离心冻干；将冻干好的样品溶解在30%醋酸+70%dmso反应体系中，并加入2-ab至终浓度50mg/ml，氰基硼氢化钠至终浓度60mg/ml，65℃避光干浴4小时；最后，再使用hilic固相萃取柱除掉样品中多余的标记物，acquityuplcbehglycan1.7μm2.1×150mm柱后质谱分析。h5a3游离寡糖flr积分图见图4，h5a3样品寡糖保留时间及其结构、分子量、比例结果见图5和图6。h5a3高甘露糖比例约为2.13%，h5a3岩藻糖基化二天线寡糖比例约为91.90%。h5a3的高甘露糖比例比对照品低约5个百分点。实验例3、振荡实验根据实施例1所述方法获得h5a3抗体，对该样品溶解在不同的制剂配方中，分组见表1。表1、样品处方信息（不同制剂配方分组）取样品于2~8℃，避光，250±50rpm，振荡器中振荡，检测样品外观、可见异物、不溶性微粒、sec聚合体含量、蛋白含量、活性及粒度。振荡实验结果趋势图显示：h5a3振荡实验外观趋势图见图7；h5a3振荡实验蛋白含量趋势图见图8；h5a3振荡实验不溶性颗粒（≥10μm）趋势图见图9；h5a3振荡实验不溶性颗粒（≥25μm）趋势图见图10；h5a3振荡实验sec-hplc/uplc聚合体含量趋势图见图11；h5a3振荡实验粒径趋势图见图12。各处方样品基本不受振荡时间影响，数据稳定，仅不溶性微粒项目分别有不同程度的增减，其中s0变化幅度最大，s2、s4相对变化小，比较平稳；通过比较各处方样品间的数据可见，振荡前和振荡后，s0在外观和不溶性微粒项目与其他处方均表现出显著差异，尤其是不溶性微粒，s0测定值明显高出很多，而其他各各处方不溶性微粒数较少，相互间差异不突显，而在粒径项目，不同处方间也展现出明显的差异，其中s1和s4粒径最大。实验例4、冻融实验取样品于-18℃以下，至25℃±2℃反复冻融，检测外观、可见异物、不容性微粒、sec聚合体含量、蛋白含量、活性及粒度。表2、冻融实验考察时间点及考察项目（s0）检测项目0h5c外观(ntu)有轻微乳光，5.8有轻微乳光，7ph5.8-渗透压(mosmol/kg)275-蛋白含量(g/l)19.9220.95不溶性微粒（≥10μm）24474851不溶性微粒（≥25μm）272374sec-hplc/uplc(%)0.80.9粒径（nm）11.9811.92可见异物不符合规定不符合规定生物活性(%)＋＋结合活性(%)＋＋表3、冻融实验考察时间点及考察项目（s1）检测项目0h5c外观(ntu)有轻微乳光，4.6有轻微乳光，5.0ph5.8-渗透压(mosmol/kg)537-蛋白含量(g/l)21.3321.28不溶性微粒（≥10μm）98157不溶性微粒（≥25μm）54sec-hplc/uplc(%)0.80.9粒径（nm）14.3514.52可见异物符合规定符合规定生物活性(%)＋＋结合活性(%)＋＋表4、冻融实验考察时间点及考察项目（s2）检测项目0h5c外观(ntu)有轻微乳光，5.1有轻微乳光，5.4ph5.8-渗透压(mosmol/kg)334-蛋白含量(g/l)21.0520.79不溶性微粒（≥10μm）160241不溶性微粒（≥25μm）42sec-hplc/uplc(%)0.81.0粒径（nm）12.3312.48可见异物符合规定符合规定生物活性(%)＋＋结合活性(%)＋＋表5、冻融实验考察时间点及考察项目（s3）检测项目0h5c外观(ntu)有轻微乳光，4.7有轻微乳光，5.0ph5.8-渗透压(mosmol/kg)442-蛋白含量(g/l)21.0220.78不溶性微粒（≥10μm）15894不溶性微粒（≥25μm）43sec-hplc/uplc(%)0.80.9粒径（nm）13.3013.50可见异物符合规定符合规定生物活性(%)＋＋结合活性(%)＋＋表6、冻融实验考察时间点及考察项目（s4）检测项目0h5c外观(ntu)有轻微乳光，4.8有轻微乳光，4.7ph5.8-渗透压(mosmol/kg)542-蛋白含量(g/l)21.4720.72不溶性微粒（≥10μm）12591不溶性微粒（≥25μm）24sec-hplc/uplc(%)0.90.9粒径（nm）14.3314.64可见异物符合规定符合规定生物活性(%)＋＋结合活性(%)＋＋表7、冻融实验考察时间点及考察项目（s5）检测项目0h5c外观(ntu)有轻微乳光，5.2有轻微乳光，5.3ph5.8-渗透压(mosmol/kg)336-蛋白含量(g/l)20.8420.27不溶性微粒（≥10μm）71151不溶性微粒（≥25μm）23sec-hplc/uplc(%)1.01.0粒径（nm）12.4112.61可见异物符合规定符合规定生物活性(%)＋＋结合活性(%)＋＋表8、冻融实验考察时间点及考察项目（s6）检测项目0h5c外观(ntu)有轻微乳光，4.9有轻微乳光，5.2ph5.8-渗透压(mosmol/kg)449-蛋白含量(g/l)21.2520.53不溶性微粒（≥10μm）178100不溶性微粒（≥25μm）15sec-hplc/uplc(%)1.01.0粒径（nm）13.5913.80可见异物符合规定符合规定生物活性(%)＋＋结合活性(%)＋＋冻融实验结果显示，各处方除外观和不溶性微粒外，基本不受影响，冻融5次后，s5在外观方面表现稳定，s4则在外观和不溶性微粒方面变化幅度均相对较小，更稳定；比较各处方样品间的数据亦可得知，冻融前与冻融后，s0变化最大，且外观和不溶性微粒数明显高很多，其他处方相互间差异不突显，而粒径项目呈现出与振荡实验同样的差异。实验例5、稳定性实验取样品s0~s6各供试制剂，用缓冲液稀释至蛋白含量为1mg/ml的溶液，进行稳定性测试，dsc仪器测定tm值。表9、热稳定性考察结果样品信息tm1值tm2值s070.5283.08s171.5883.85s270.6683.12s371.1783.52s471.5983.85s570.6083.16s670.9683.43从表9测定结果和dsc扫描图谱可知可知，s1和s4的tm值最高，其tm1值均比s0高出1℃，具有更佳的热稳定性。各实验结果显示，s1和s4处方中的海藻糖对溶液内的活性成分作用明显，增加分子粒径，使产品具有更好的热稳定性；而从振荡和冻融实验可见，相比于s1，s4在外观和不溶性微粒项目更不易受此两种条件的影响，展现出更好的稳定性。因此，最终选择s4作为抗egfr单克隆抗体h5a3的制剂处方，该处方为:聚山梨酯801g/l、海藻糖二水合物80g/l、乙酸钠三水合物6.8g/l、氯化钠5.8g/l，ph5.8。sequencelisting<110>泰州迈博太科药业有限公司<120>一种抗egfr单克隆抗体制剂<130>201610<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>708<212>dna<213>人工序列<400>1atggattttcaggtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcataatatcc60agaggagacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacaga120gtcaccatcacttgccaggcgagtcaggacatcagcaactatttaaattggtatcagcag180aaaccagggaaagcccctaaactcctgatctacgatgcatccaatttggaaacaggggtc240ccatcaaggttcagtggaagtggatctgggacagattttactttcaccatcagcagcctg300cagcctgaagatattgcaacatatttctgtcaacactttgatcatctcccgctcgctttc360ggcggagggaccaaggtggagatcaaacgtactgtggctgcaccatctgtcttcatcttc420ccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac480ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaac540tcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcacc600ctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccat660cagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt708<210>2<211>236<212>prt<213>人工序列<400>2metasppheglnvalglnilepheserpheleuleuileseralaser151015valileileserargglyaspileglnmetthrglnserproserser202530leuseralaservalglyaspargvalthrilethrcysglnalaser354045glnaspileserasntyrleuasntrptyrglnglnlysproglylys505560alaprolysleuleuiletyraspalaserasnleugluthrglyval65707580proserargpheserglyserglyserglythraspphethrphethr859095ileserserleuglnprogluaspilealathrtyrphecysglnhis100105110pheasphisleuproleualapheglyglyglythrlysvalgluile115120125lysargthrvalalaalaproservalpheilepheproproserasp130135140gluglnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasn145150155160phetyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleu165170175glnserglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysasp180185190serthrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyr195200205glulyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuser210215220serprovalthrlysserpheasnargglyglucys225230235<210>3<211>1305<212>dna<213>人工序列<400>3caggtgcagctgcaggagtccggccccggcctggtgaagccctccgagaccctgtccctg60acctgcaccgtgtccggcggctccgtgtcctccggcgactactactggacctggatccgg120cagtcccccggcaagggcctggagtggatcggccacatctactactccggcaacaccaac180tacaacccctccctgaagtcccggctgaccatctccatcgacacctccaagacccagttc240tccctgaagctgtcctccgtgaccgccgccgacaccgccatctactactgcgtgcgggac300cgggtgaccggcgccttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgtcctccgcc360tccaccaagggcccctccgtgttccccctggccccctgctcccggtccacctccgagtcc420accgccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctgg480aactccggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagtcctccggc540ctgtactccctgtcctccgtggtgaccgtgccctcctccaacttcggcacccagacctac600acctgcaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacgagcggaagtgctgcgtg660gagtgccccgccggcccctccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatg720atctcccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccccgag780gtgcagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagccccgg840gaggagcagttcaactccaccttccgggtggtgtccgtgctgaccgtggtgcaccaggac900tggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccgcccccatc960gagaagaccatctccaagaccaagggccagccccgggagccccaggtgtacaccctgccc1020ccctcccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttc1080tacccctccgacatcgccgtggagtgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaag1140accaccccccccatgctggactccgacggctccttcttcctgtactccaagctgaccgtg1200gacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctg1260cacaaccactacacccagaagtccctgtccctgtcccccggcaag1305<210>4<211>435<212>prt<213>人工序列<400>4glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu151015thrleuserleuthrcysthrvalserglyglyservalsersergly202530asptyrtyrtrpthrtrpileargglnserproglylysglyleuglu354045trpileglyhisiletyrtyrserglyasnthrasntyrasnproser505560leulysserargleuthrileserileaspthrserlysthrglnphe65707580serleulysleuserservalthralaalaaspthralailetyrtyr859095cysvalargaspargvalthrglyalapheaspiletrpglyglngly100105110thrmetvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphe115120125proleualaprocysserargserthrsergluserthralaalaleu130135140glycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrp145150155160asnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleu165170175glnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproser180185190serasnpheglythrglnthrtyrthrcysasnvalasphislyspro195200205serasnthrlysvalaspgluarglyscyscysvalglucysproala210215220glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet225230235240ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis245250255gluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalgluval260265270hisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnserthrphe275280285argvalvalservalleuthrvalvalhisglnasptrpleuasngly290295300lysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproalaproile305310315320glulysthrileserlysthrlysglyglnproarggluproglnval325330335tyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalser340345350leuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglu355360365trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro370375380metleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrval385390395400asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet405410415hisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuser420425430proglylys435当前第1页12