雌激素受体ER-α36抗原多肽及其单克隆抗体的制作方法

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及4种er-α36特异性抗原多肽和1种特异抗er-α36蛋白的单克隆抗体。

背景技术：

雌激素受体er-α36是新发现的一种雌激素受体亚型主要表达在细胞膜上，介导非基因组雌激素信号通路，并且能抑制传统的雌激素信号通路，在细胞的正常生理和疾病发生及发展过程中起到至关重要的作用。其表达水平与癌症的一些生物学指标如淋巴结转移、肿瘤细胞分化和肿瘤分期及分级有着密切联系。

在临床回顾性研究中发现，709例乳腺癌样本中，约70％都检测到er-α36的表达，更重要的是，在因缺少er-α66表达而归属于雌激素受体阴性的乳腺癌样本中，有41％检测出er-α36的表达。此外，er-α36在白血病、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌中都有所表达。因此，er-α36及其介导的信号通路在这些癌症，尤其是乳腺癌的发生和发展过程中，可能发挥着重要作用。显示出开发针对er-α36的检测试剂和抗肿瘤药物的迫切性和重要性。

er-α36主要表达在细胞膜上和细胞质中，不同于er-α66主要存在于细胞核中。这种表达模式将有利于针对er-α36抗体药物的开发。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供4种er-α36特异的抗原多肽。

本发明的另一目的是提供能与er-α36蛋白特异性结合的单克隆抗体。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

首先筛选合适的多肽序列，er-α36蛋白共有310个氨基酸，经过对其进行穿膜区域、保守区域等多方面的研究，最终筛选确定4种多肽序列作为抗原。

优选地，4种多肽序列如下所示：

her-α36-1：eydptrpfse(seqno.6)

her-α36-2：qgkcvegmve(seqno.4)

her-α36-3：shveakkril(seqno.7)

her-α36-4：ifgnkwfprv(seqno.8)

该抗er-α36单克隆抗体的制备方法如下：

(1)er-α36抗原多肽化学合成，与klh(keyholelimpethemocyanin，血蓝蛋白)偶联后混合免疫balb/c小鼠；

(2)杂交瘤细胞株制备与筛选：取免疫小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，培养，采用间接elisa方法检测筛选，得到能分泌单克隆抗体clone4e11的杂交瘤细胞株；

(3)单克隆抗体clone4e11的鉴定和可变区基因扩增：收集clone4e11的杂交瘤细胞沉淀，使用rna柱提取试剂盒提取总rna，使用反转录试剂盒(thermo)以rna为模板，oligo(dt)为引物，反转录合成cdna第一链。以cdna第一链为模板，使用抗体可变区通用引物pcr扩增vh、vl基因，获得重链和轻链可变区产物片段，将获得的序列翻译成氨基酸序列得到clone4e11抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqno.9所示，重链可变区的氨基酸序列如seqno.10所示。

(4)单克隆抗体clone4e11的制备：将clone4e11的重链vh和轻链vk基因分别克隆到真核表达载体中，载体质粒中分别带有重链igg2b(seqno.11)和轻链κ链(seqno.12)的恒定区基因，提取载体质粒，转染，使用proteina亲和柱纯化得到所述单克隆抗体clone4e11。

本发明扩增得到的单克隆抗体能够特异性地识别er-α36蛋白，将这个单克隆抗体命名为clone4e11。elisa实验结果表明该抗体具有较高的亲和力，可用于er-α36蛋白及上述多肽的检测，具有高特异性、高灵敏度的优点，在临床检测和实验研究中将会广泛应用。

附图说明

图1为er-α66及其异构体氨基酸序列比对示意图，其中p03372-1为er-α66；p03372-2为er-α66255-366氨基酸缺失的变体；p03372-3为er-α46，1-173位氨基酸缺失；p03372-4为1-173位氨基酸缺失，458-595位氨基酸被取代。

图2为计算机软件分析蛋白结构和抗原设计位点；

图3为clone4e11单克隆抗体sds-page电泳图；

图4为重链和轻链可变区pcr产物电泳图；

图5为基于包埋细胞的elisa方法比较不同抗体的亲和力。

具体实施方式

本发明详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊说明均为常规实验方法和试剂。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。

实施例1.er-α36抗原多肽设计

以er-α36蛋白为研究对象，蛋白立体结构如图2所示。er-α36是erα的剪接变异体，与其它er-α结构有所不同，氨基酸序列对比示意图如图1所示，er-α36缺乏转录激活域但保留了er-α66的dna结合、二聚体及配体结合域，其c端最后的138个氨基酸由er-α基因的外显子7编码，外显子8被额外的独特的27个氨基酸序列的c末端取代。

通过蛋白质软件对er-α66全长氨基酸序列进行分析，在其中与er-α36重叠位置分析胞内和胞外段序列，筛选寻找适合作为抗原肽段的位置，约10个氨基酸长度，在保守区内，筛选条件需要兼顾亲水性、表露性、柔韧性、免疫原性及结构分析，经过大量筛选，发明人得到表1中的6个氨基酸序列。

表1

对以上得到的6个序列，考察其α-螺旋、β-转角、亲水性以及抗原指数，最后选择其中2个作为抗原肽段(seqno.4和seqno.6)；同时考虑在蛋白c端关键特异27个氨基酸区域内寻找新的抗原设计位点，最后在该区域两端各选定1段序列作为抗原肽段。以上获得的4个肽段设计位置确保了能涵盖蛋白c端关键特异27个氨基酸区域及其临近lbd区域。将选择的氨基酸序列进行抗原表位等特性预测，应用iedb(immuneepitopedatabase，iedb)，同时通过蛋白质软件和proteinblast分析确定。4个肽段名称和序列如下所示：

her-α36-1：eydptrpfse(seqno.6)

her-α36-2：qgkcvegmve(seqno.4)

her-α36-3：shveakkril(seqno.7)

her-α36-4：ifgnkwfprv(seqno.8)

实施例2制备抗er-α36蛋白的单克隆抗体

(1)多肽合成与动物免疫

根据实施例1设计的抗原多肽进行化学合成，使用碳化二亚胺法将多肽偶联于载体蛋白klh，制备步骤如下：取30mg多肽和50mgedc.hcl分别加入0.5ml去离子水充分溶解，混合后4℃搅拌反应30min；将5mgklh溶于1ml去离子水中，将其缓慢滴加入搅拌反应液中，调节ph至7.4，4℃搅拌反应过夜；维持温度和ph值不变，采用透析法纯化反应液，收集终产物分装于-20℃保存。采用光谱法测定产物的吸光值，计算偶联率和浓度。

动物免疫：选择6-8周龄的balb/c小鼠，按照每只注射量100ug计算，与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化，进行皮下多点注射。二、三次免疫以后小鼠尾静脉采血，收集血清，间接elisa法检测抗体滴度，选择效价高(1:5000以上)的小鼠进行加强免疫后准备细胞融合。

(2)制备杂交瘤细胞系

选择小鼠骨髓瘤sp2/0细胞株用含10％胎牛血清的dmem培养基培养，细胞呈半贴壁状态，保持对数生长状态传代3代后，收集细胞，计算活细胞数。取加强免疫3天后的小鼠，收集小鼠脾细胞，制备单细胞悬液，计算活细胞数，与对数生长期的sp2/0细胞按5:1比例混合，在peg1450介导下进行融合，稀释后加入96孔板培养。使用hat和ht培养基进行选择性培养，观察细胞生长状态，直至杂交瘤细胞团生长到足够大小，取上清采用间接elisa法检测。设待检样品a450的值为p，阴性对照a450值为n，当p/n>2.0时判为阳性，p/n<1.5判为阴性。最终筛选到4个分泌阳性抗体的细胞孔，上清样品滴度如下表所示。对所得4个阳性克隆株进行亚克隆，采用有限稀释法(一般稀释至0.8个细胞/孔)，使一部分孔板中仅有单个细胞生长分裂，当细胞覆盖大于10％孔底时，吸取培养基上清使用elisa法检测抗体滴度。经过3次亚克隆筛选，有3个阳性克隆细胞孔的抗体滴度逐渐降低，亚克隆阳性率低于70％，无法稳定分泌抗体；仅有一株分泌特异性抗体的细胞株(4e11)，3次亚克隆后阳性率约为80％，进行扩大培养用于扩增抗体基因。

表2

实施例3单克隆抗体clone4e11的鉴定和可变区基因扩增

采用小鼠抗体亚类鉴定试剂盒检测细胞培养上清液，结果显示，clone4e11的抗体亚型为igg2b。

收集clone4e11的杂交瘤细胞沉淀(细胞数1x10⁶以上)，使用rna柱提取试剂盒(qiagen)提取总rna，使用反转录试剂盒(thermo)以rna为模板，oligo(dt)为引物，按照说明书步骤操作，反转录合成cdna第一链。以cdna第一链为模板，使用抗体可变区通用引物pcr扩增vh、vl基因，获得重链和轻链可变区产物片段；使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图3所示，扩增出的vh和vl片段约350bp，与理论大小相符。胶回收纯化试剂盒回收目的片段，将非功能vk基因产物使用限制性内切酶bcivi去除，分别将产物克隆至pmd18-t载体，采用热激法转化大肠杆菌e.colitop10，挑取单克隆菌落培养，提取质粒测序；使用imgt/v-quest数据库进行测序结果比对，进一步分析，将获得的序列翻译成氨基酸序列。clone4e11抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqno.9所示，重链可变区的氨基酸序列如seqno.10所示。

实施例4clone4e11全长抗体的制备

将clone4e11的重链vh和轻链vk基因分别克隆到真核表达载体中，载体质粒中分别带有重链igg2b和轻链κ链的恒定区基因。

使用去内毒素质粒提取试剂盒提取载体质粒，经0.22μm过滤器过滤除菌，测定dna浓度。将hek-293f细胞按1x10⁶cells/ml的密度接种到30ml培养基；按照1:1比例混合质粒dna与线性pei转染试剂，室温孵育5min，加入细胞中，37℃，8％co2摇床培养箱内培养，从转染后第5天开始，每天取样检测细胞密度和细胞活率，当细胞活率降至20％左右，收全部样品。使用proteina亲和柱纯化样品，上柱液和柱平衡液为1xpbs缓冲液，柱层析洗脱液为0.1m柠檬酸(ph2.7)，洗脱中和液为1mtris-hcl(ph8.0)，将收集到的纯化产物使用蛋白超滤离心管置换浓缩到1xpbs缓冲液，所得抗体进行分装冻存。将纯化后的抗体进行sds-page电泳鉴定，纯度在90％以上，抗体蛋白条带如图4所示。

实施例5基于包埋细胞的elisa方法比较不同抗体的亲和力

使用含5％胎牛血清的ham’sf12培养基培养人乳腺癌细胞sum159，将细胞用胰酶消化后计数，1x10⁴/孔铺于96孔板中，培养48小时后，待细胞覆盖率>80％，弃去培养上清液，加入预冷的pbs缓冲液轻柔冲洗一次，弃去pbs，每孔加入50ul含0.05％戊二醛的pbs，静置10min固定细胞，使用预冷的pbs清洗两次后加入含20％胎牛血清的pbs进行封闭，4℃静置过夜。次日，使用预冷的pbs清洗96孔板，待用。

选择已知的抗er-α36鼠源单克隆抗体3c11(专利号wo2014/146575a1)和兔多克隆抗体pab8586(文章出处z.wang,x.zhang,p.shen,b.w.loggie,y.chang,t.f.deuel,avariantofestrogenreceptor-{alpha},her-{alpha}36:transductionofestrogen-andantiestrogen-dependentmembrane-initiatedmitogenicsignaling,procnatlacadsciusa103(24)(2006)9063-9068.外包公司制备：alphadiagnosticinternational(sanantonio,tx,usa))作为阳性对照，选择鼠源igg作为阴性对照；将4e11抗体和对照样品分别加入封闭液进行梯度稀释，作为一抗加入准备好的细胞板中，温育洗涤，加入辣根酶标记的二抗，温育洗涤，加入底物液，显色，450nm处读取od值。

elisa结果如图5所示，杂交瘤细胞株clone4e11分泌的单克隆抗体能够特异性识别sum159细胞表达的er-α36蛋白，且结合能力强与已知的单克隆抗体和多克隆抗体。可开发成er-α36特异性免疫诊断试剂，并为开发针对er-α36的抗体药物提供有力基础。

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<110>青岛珅奥基生物工程有限公司

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<223>er-α36特异的氨基酸序列

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