本公开涉及生物
技术领域：
，具体地，涉及一种检测马尔堡病毒用引物探针组及试剂盒和检测方法。
背景技术：
：马尔堡出血热是由马尔堡病毒(marburgvirus,marv)引起的，可经人与人之间的亲密接触传播，传染性强，病死率高。自1967年马尔堡出血热首次暴发和确认来，已有40年的流行史，期间有3次大规模暴发。马尔堡出血热以其高传染性的暴发流行和高致死性，使得人们日益关注马尔堡出血热对人类健康和公共卫生安全的潜在威胁。马尔堡出血热的初期症状与疟疾、sars、流感或黄热病等相似，晚期症状与埃博拉出血热、拉沙热、肾综合征出血热、登革热等类似，单靠临床症状难以与其他病原体鉴别诊断，因此马尔堡病毒需要通过实验室手段确诊。常用的方法有病毒分离、电镜观察、常规pcr、elisa等方法。传统检测方法中，病毒分离培养是检测金标准，但同时存在以下缺点：1、马尔堡病毒培养须在p4实验室进行，对实验条件要求高；2、细胞培养检测结果判定受主观因素干扰较大；3、从接种病毒到出现明显的细胞病变需要较长时间；4、同一时期无法处理大量样本。而免疫学检测中，其elisa检测的灵敏度较低，且难以避免“窗口期”问题，不能反映病毒早期感染，复制状态及预后信息，常造成假阴性结果，延误病情。目前国内外均建立了采用pcr技术对马尔堡病毒进行快速检测的方法。虽然实时荧光pcr有较高的敏感性和特异性，但是常用的pcr检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，且耗时较长，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。因此，基于疫情的快速暴发、传播范围广的特点，建立灵敏度高、特异性强、检测时间短、检测成本低、操作简单方便、器材要求不高的马尔堡病毒检测技术，对病例的快速识别和疫情的传播控制具有非常重要意义。对公共卫生和疫情防控具有重要的价值意义。技术实现要素：本公开的目的是解决现有技术中不能对马尔堡病毒进行快速、灵敏和特异检测的缺陷，提供一种马尔堡病毒的检测引物探针和试剂盒，并建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)技术的马尔堡病毒的快速、灵敏、特异、简便的检测方法。为了实现上述目的，本公开的第一个方面提供重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒用引物探针组，其中，包括具有seqidno.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有seqidno.3所示核苷酸序列的探针；其中，seqidno.3所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有fam发光基团，第20位碱基后连接脱碱基位点，第22位碱基标记淬灭基团bhq1。本公开的第二个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总rna；(2)以所述总rna为模板，并使用本公开第一个方面所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；(3)收集检测通道荧光信号，得到检测结果；若fam荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有马尔堡病毒。对于临床样本，若fam、vic通道均无扩增曲线，提示假阴性结果。本公开的第三个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。本发明的有益效果在于：本公开建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测马尔堡病毒的检测方法，能够实现形态学、免疫学以及实时荧光检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：(一)耗时短逆转录重组酶聚合酶扩增技术(rt-rpa)不需将rna转化为cdna再进行扩增反应，只需要将rpa体系与逆转录酶混合，构建rt-rpa反应体系，就可直接以rna为模板，实现逆转录与检测过程的一体化。整个反应20min即可完成，而rt-pcr、real-timepcr、lamp等技术仅逆转录过程就需要30min的时间，整个反应需要60-90min才可完成。(二)对仪器平台要求低rpa反应可在常温下进行，不需要配备专门的热循环扩增仪，更好的实现了马尔堡病毒的现场应急检测。(三)特异性好rpa可识别引物结合区的snp，使得其对非检测目标有极强的辨识能力，而lamp和普通real-timepcr则无法识别snp，这使得rpa检测的特异性明显优于lamp和real-timepcr。本发明所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性。所有引物探针都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括汉坦病毒、汉城病毒、安第斯病毒、辛德毕斯病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒等的核酸，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。(四)最低检出限本发明所建立的检测方法的最低检出限可达到5拷贝/反应。(五)成本较低本发明所建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测马尔堡病毒的方法在操作性上降低了人力成本和时间成本。该方法无需复杂高端仪器，反应条件仅为一步39℃，无需复杂操作。(六)预防假阴性结果本发明反应体系中添加的检测内质控引物，可以有效的提示因为操作失误、pcr抑制物等原因造成的假阴性检测结果。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下内容对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开的一种实施方式提供了重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒用引物探针组，其中，包括具有seqidno.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有seqidno.3所示核苷酸序列的探针；其中，seqidno.3所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有fam发光基团，第20位碱基后连接脱碱基位点，第22位碱基标记淬灭基团bhq1。本公开的引物探针组选择特异性的检测基因或保守序列，需要保证引物探针区段能够全面覆盖马尔堡病毒。而且设计过程中要充分考虑避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，而由于rpa对引物长度要求为30-38nt，探针最长45nt，这样的序列容易在恒温条件下产生大量的引物二聚体从而影响实验效果，因此也对引物的设计提出了更高的要求，以保证后期不同引物探针同时扩增的概率。最终获得本公开提供的一套特异的引物探针序列(详见表1)。表1马尔堡病毒rpa检测引物探针汇总表检测马尔堡病毒的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3所示。检测内质控的上下游引物和探针的核苷酸序列分别由seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6所示。seqidno.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有vic发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团bhq1。依据vic荧光通道有无扩增曲线，排除临床样本中假阳性结果。在本公开的一种实施方式中，涉及一种重组酶聚合酶扩增(pra)检测马尔堡病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总rna；(2)以所述总rna为模板，并使用本公开所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；(3)收集检测通道荧光信号，得到检测结果；a)若fam荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有马尔堡病毒。b)对于临床样本，若fam、vic通道均无扩增曲线，提示假阴性结果。在本公开的一种实施方式中，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5μm，每条探针的最终使用浓度各自为0.08-0.15μm。在本公开的一种实施方式中，rpa反应的条件包括在37-42℃下恒温扩增20-30min。在本公开的一种特别优选的实施方式中，为了提高反应的灵敏度及特异性，rpa反应的条件包括在39℃下恒温扩增20min。本公开的检测方法的直接目的不是获得诊断结果和健康状况，而只是对已经脱离人体或动物体的样品进行检测，所获得的仅仅是作为中间结果的信息。本公开还提供了一种重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒的试剂盒，所述试剂盒含有前述rpa检测引物探针组。在本公开的一种实施方式中，所述试剂盒还包括阳性内质控、逆转录酶、反应体系缓冲液、dna重组酶、dna聚合酶、单链结合蛋白、3’-5’核酸外切酶、dntp和水中的至少一种。以下，通过实施例进一步详细说明本公开。以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在上海生工生物技术有限公司合成。实施例1引物及探针的合成委托试剂公司合成表2所示的引物探针组。表2检测马尔堡病毒的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3所示。seqidno.3所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有fam发光基团，第20位碱基后连接脱碱基位点，第22位碱基标记淬灭基团bhq1。检测内质控的上下游引物和探针的核苷酸序列分别由seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6所示。seqidno.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有vic发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团bhq1。实施例2特异性验证对实施例1中设计的马尔堡病毒特异性引物对和探针进行评估和验证，主要评估特异性、最低检出限和覆盖度。特异性评估：选择体外转录汉坦病毒、汉城病毒、安第斯病毒、辛德毕斯病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒核酸作为特异性评估核酸。每个样本总核酸浓度为0.001ng/μl，将上述每个样本核酸混合作为特异性的评估模板，进行rpa的扩增。rpa反应体系配制：总体系50μl，向含有rpa冻干酶粉的0.2mltwistampexo(货号：taexo02kit)反应管中加入再水化缓冲液29.5μl，醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)，引物各2μl(10μm)，探针0.5μl(10μm)，逆转录酶1μl(200u/μl)，模板5μl，剩余用水补足。rpa反应的反应条件：选择fam作为报告基团，rpa反应程序如下：39℃10s，39℃10s，39℃10s(收集荧光)，40个循环。rpa反应结果判断：空白对照和阴性对照成立，否则视实验结果无效；若fam通道有扩增曲线，则seqidno.1-2的引物对和seqidno.3的探针有非特异性扩增。结果显示，fam通道无非特异性扩增，引物探针特异性好。实施例3最低检出限验证最低检出限评估：用限制性内切酶spei和pvuii酶切重组有马尔堡病毒基因序列的标准品质粒，将其线性化并进行体外转录；选取初始浓度为105拷贝/μl转录产物，将其梯度稀释为104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、10拷贝/μl、2拷贝/μl和1拷贝/μl。体系配制和rpa反应条件同实施例2特异性评估。使得在反应体系中，病毒的浓度分别为5×104拷贝/体系、5×103拷贝/体系、5×102拷贝/体系、50拷贝/体系、10拷贝/μl和5拷贝/体系。rpa反应结果判断：空白对照和阴性对照成立，否则视实验结果无效；若fam通道有扩增曲线，则seqidno.1-2的引物对和seqidno.3的探针可检测出该浓度的模板。结果显示本试剂盒对于目标的最低检出限均达到了5拷贝/体系(即1拷贝/μl)。实施例4覆盖度验证选择10株体外转录的马尔堡病毒核酸作为覆盖度评估用模板。体系配制和rpa反应条件同实施例2特异性评估。rpa反应结果判断：空白对照和阴性对照成立，否则视实验结果无效；若fam通道有扩增曲线，则seqidno.1-2的引物对和seqidno.3的探针可检测出该模板。结果显示本发明试剂盒对10株体外转录的马尔堡病毒株均可覆盖性的检出。实施例5试剂盒的保存期试验以100拷贝/μl的重组有马尔堡病毒基因序列的标准品质粒作为评估用模板。在第0天时，分装成10份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。保存期检测结果如表3所示。表3保存期试验结果保存期马尔堡病毒rnasep第0天++第10天++第15天++第30天++第60天++第90天++第120天++第150天++第180天++第360天++由表3可知，试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，实验结果表明该试剂盒的保存期至少为一年。对比例1(1)引物和探针的合成根据表4所示的序列合成引物和探针，检测马尔堡病毒。表4对检测马尔堡病毒的对比的引物探针汇总表(2)特异性验证选择体外转录汉坦病毒、汉城病毒、安第斯病毒、辛德毕斯病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒核酸作为特异性评估核酸。每个样本总核酸浓度为0.001ng/μl，将上述每个样本核酸混合作为特异性的评估模板，进行rt-rpa的扩增。rt-rpa反应体系配制、rt-rpa的反应程序、反应结果判断均与实施例2中的特异性验证相同。结果显示，登革热病毒有弱阳性扩增信号，其他病原体反应结果均为阴性。(3)最低检出限验证最低检出限评估：用限制性内切酶spei和pvuii酶切重组有马尔堡病毒基因序列的标准品质粒，将其线性化并进行体外转录；选取初始浓度为105拷贝/μl转录产物，将其梯度稀释为104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、10拷贝/μl、2拷贝/μl和1拷贝/μl。反应体系、反应条件和结果判断与实施例3中的最低检出限验证相同。结果显示对比例对马尔堡病毒的最低检出限为100拷贝/体系。(4)覆盖度验证选择10株体外转录的马尔堡病毒核酸作为覆盖度评估用模板。体系配制、rt-rpa反应条件和结果判定同实施例4覆盖度评估。结果显示对比例试剂对10株体外转录的马尔堡病毒株有4株的漏检。经过实施例和对比例的比较可以看出，本发明所建立的检测方法可以一次性的检测马尔堡病毒，本试剂盒的敏感性高，对于样本中的痕量核酸检测能力较强。本试剂盒在具备优异特异性的同时，并不损失敏感性和覆盖度，最低检出限和覆盖度的数据明显优于对比例。以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。序列表<110>北京卓诚惠生生物科技股份有限公司<120>一种检测马尔堡病毒的引物、探针及试剂盒<130>7072abt<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>35<212>dna<213>artificialsequence<400>1actgcycctcatgttcgtaataagaaggtgatatt35<210>2<211>32<212>dna<213>artificialsequence<400>2cagcaaaccyccttctagaagatctccaagat32<210>3<211>39<212>dna<213>artificialsequence<400>3tttattgcatctattatctgttacagatactaacctgat39<210>4<211>33<212>dna<213>artificialsequence<400>4atcaagaccaattaaaattttaactagattaac33<210>5<211>35<212>dna<213>artificialsequence<400>5tttctgtctttggaaaaactgcaacaacatcatag35<210>6<211>47<212>dna<213>artificialsequence<400>6cggatccatctcactgcaatgttttgagagtcatacttcttcaaggg47<210>7<211>37<212>dna<213>artificialsequence<400>7gttagaattgggtacaaaacctactgctcctcatgtt37<210>8<211>35<212>dna<213>artificialsequence<400>8cacacaacgtcagcaaacccccttctagaagatct35<210>9<211>39<212>dna<213>artificialsequence<400>9ccctgagtttattgcatctattactgattacagatacta39当前第1页12