本发明涉及分子生物学技术，具体的说是一种长牡蛎engrailed2启动子及其重组表达载体及应用。
背景技术：
：在软体动物早期发育研究中，目前尚无可用的启动子。软体动物engrailed为具有homedomain的转录因子，在神经系统及贝壳的发育过程中起重要作用。engrailed启动子可以在贝类幼虫中驱动报告基因的表达，为软体动物的发育研究提供便利。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种长牡蛎engrailed2启动子及其重组表达载体及应用。为实现上述目的，本发明采用技术方案为：一种长牡蛎engrailed2启动子，启动子为seqidno.1所示的碱基序列。所述启动子为与seqidno.1所示的碱基序列具有80％或80％以上同源性的碱基序列，且具有启动子功能。一种长牡蛎engrailed2启动子的应用，所述启动子在制备重组表达载体中的应用。一种长牡蛎engrailed2启动子的应用，所述启动子在贝类幼虫中启动目的基因表达。所述目的基因为可在细胞中转录或翻译的功能基因或rna序列，如编码蛋白的各种功能基因(如egfp)、反义rna或其它具有调节功能的长rna序列(如lnrna)，在本例应用中是egfp。含所述的长牡蛎engrailed2启动子的重组表达载体。一种含长牡蛎engrailed2启动子的重组表达载体的应用，所述重组表达载体在贝类幼虫中启动目的基因表达中的应用。本发明所具有的优点：通过注射重组表达载体，启动目的基因，实现目的基因在贝类幼虫中的表达。附图说明图1为本发明实施例提供的pegfp-1质粒示意图。图2为本发明实施例提供的pegfp-1质粒中的多克隆位点图。图3为本发明实施例提供的注射重组载体的笠贝早期幼虫中engrailed2启动子驱动gfp表达的结果图，其中，绿色荧光出现在幼虫中。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步解释说明。实施例1启动子扩增：使用海洋动物组织基因组dna提取试剂盒(tiangen，目录号：dp324)提取长牡蛎(crassostreagigas)基因组dna，根据长牡蛎基因组数据库(http://www.oysterdb.com)设计长牡蛎基因启动子特异性引物。(上游引物cgeng2pmf，加16碱基的载体pegfp-1同源末端1，下游引物cgeng2pmr，加16碱基的载体pegfp-1同源末端2)以上述提取的长牡蛎的gdna为模板，使用premixtaqtm(lataqtmversion2.0)(takara，目录号：rr900q)聚合酶进行pcr扩增。如表1所示。表1基因启动子扩增的pcr体系组成体积premixtaq(lataqversion2.0)25μldna模板2μl上游引物cgeng2pmf(10μm)2μl下游引物cgeng2pmr(10μm)2μl超纯水19μlpcr扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸2min30s，进行35个反应循环；72℃延伸7min。上游引物cgeng2pmf：cgcgggcccgggatcccgtgtaaaaggttcggacg，其中下划线代表16碱基的载体pegfp-1同源末端1；下游引物cgeng2pmr：ggcgaccggtggatccgtattttaaagataaacaaagatttc，其中下划线代表16碱基的载体pegfp-1同源末端2。pcr扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为2000bp左右的条带，使用thermoscientific的genejetgelextractionkit(目录号：k0692)进行纯化回收，即得cgeng2启动子碱基序列如序列表1所示。实施例2cgeng2::gfp重组载体构建：将pegfp-1质粒(中国科学院海洋研究所张晓军提供，该质粒还可从优宝生物(http://www.youbio.cn/)订购，货号：vt1106，其碱基序列如序列2中所示)用bamhi酶切线性化，将如上述得到的pcr回收产物cgeng2启动与线性化的pegfp-1进行in-fusion连接(in-fusionhdcloningkit，takara，目录号：638909)，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子测序(如cgeng2启动子序列所示)，证明准确，具体为：in-fusion连接体系：组成体积pcr回收产物(cgeng2启动子)1.5μl超纯水3.5μl线性化pegfp-13μlinfusionmix2μl总体积10μl将上述记载的两片段按照上述表中记载的连接体系混合，50℃水浴中连接15min，经过连接后用感受态细胞dh5α进行转化。取出-80℃保存感大肠杆菌受态，立即静置于冰中；将适量体积的待转化dna(每100μl感受态加入50ngdna，体积不要超过感受态细胞体积的5％)与感受态轻轻混匀，冰上静置20min；42℃热激90s，然后冰上放置2-3min。加入900μl的lb液体培养基(不含抗生素)，37℃150rpm振荡培养1-1.5h；5000rpm离心3min，弃上清，用100μllb液体培养基重悬浮菌体。将重悬液涂于卡那霉素抗性lb平板上，37℃倒置培养12-20h。选取单菌落，进行菌落pcr鉴定。空载质粒的产物大小约为100bp，重组载体产物长度约为2100bp。鉴定用引物：pegfp-1-f,cgagctcaagcttcgaattctg；pegfp-1-r,cgccgtccagctcgaccag。获得含有pegfp-1+cgeng2表达载体的重组大肠杆菌，命名为cgeng2::gfp(参见图1)。对cgeng2::gfp表达载体中的cgeng2启动子进行测序，测序结果如cgeng2启动子所示。测序结果表明，获得的cgeng2::gfp重组表达载体中cgeng2启动子序列正确。用无内毒素质粒小提中量试剂盒(目录号：dp118-02)从大肠杆菌cgeng2::gfp中提取重组载体cgeng2::gfp。实施例3软体动物面盘幼虫中gfp的表达将提取的重组载体cgeng2::gfp配置成注射液：重组载体50ng/ul,酚红0.05％。将性成熟的笠贝放入70ml新鲜海水的培养杯中(每杯一只)，待其产卵排精后，分别收集精子和卵细胞。将收集的卵细胞转入盛有5ml新鲜海水的培养皿中，放置于解剖镜下。将显微注射仪(warner，目录号：pli-100a)输入气压维持在200pa。用microloader(eppendorf，目录号：5242956003)吸取0.5ul注射液注入注射针femtotipii(eppendorf，目录号：5242957000)，将注射针连接于注射仪。设置注射参数：输入气压200pa，平衡气压3pa，注射压力15pa，注射时间0.08s。注射体积依据酚红颜色指示，不超过卵体积的5％。将注射后的卵转移至12孔培养板，加入5ml新鲜海水，按体积5％的比例加入备好的精子，室温受精一小时后将精子洗脱，重新加入5ml新鲜海水。培养20hpf后检测重组载体的的表达情况，拍照记录(参见图3)。由图3可见注射重组载体的笠贝早期幼虫gfp表达(绿色荧光)，证明该重组载体可以在贝类幼虫中启动目的基因表达。engrailed2启动子序列：该启动子名称cgiengrailed2,或简称cgeng2启动子cgtgtaaaaggttcggacgctcttgttattaattatttactaatcaacaaaactttaatgaaaggttaattttatgctttgtataacatgccgttaaaaacagatacgggcattgtttacaacatatcacgcattgctatctaaacaaaggtctcgtgtcaacatgtggcaaagatggaatatagattttatcttaaatgtttgtttaaacacttttgatatcctacggtaatagtaaacagttaggtaatcctttaacatcttgttaattttggcagattgttccggaaggtgtgaaaaggattttcgttaaattttaatgctcccctaatttttttggttagttttttgttagttttttttttctcttcacaactttaatgctcatacacggaggaaacatgcacatgcatccattggtttgaattaatttcatcgtaatatattacaatgggattggaacaagttctaaatcttatgtagctctctcctcatacaataactgacatcaaaaatgttcgcatgtaaatgagatatattcactattaaagctttcttaaaaaatgtaaattaattacattaaagattcaaaatgaaatattctatattcttaaaaatagaacataaaaacttctgaattaatgtaaggaaaaaatgtaacaactttataaaatcaggttatattcacttgcatctgacaacatacaaacagaatatgtccatgtgtggtagcattatgtttggtatgagtatatgattgataaaaacgagagaagtcaaagaagtgggtctaaaaattcaaagacatgggcaagtatattgtttcccctttgctaaatacttgatgtgttgcaaacaaaaatgacattgacttttcccacacaagatttgtgcaagttaattgccatagctttagatggaatatgatattgcaaaatattataattgatatttctctgcgcgtggctcagtttacaaaatttaaaaaaaaaataaagtgcaaccttgtttagataacagggaggtcgacggaatctctttttgacaactaatattttgcgagagtgttaatttaaattggatttcaatgtcattaatcatgatctgccagttttatgaaatgaaaatacaagtacttcagttctatttgtaaattaacgtattaattttgatatccattaagggtattcattggaagttaatataaagctattcatcgctaatacagagttattagcaaaatactgacgatatgagaatcttttgtgaacacatgagaaaaattttagtcaaagccgcagattatttaaagtctttgatatttagttaatatgaccaatgcccatgtcatatttccattttacatacaaagtaaaagttcttatataatttgtttatctcacttttttctctccatttgtcaaagtcataaataaataaatcaaagaagcctgaaattgcactgttttaatgttaggtgaggtaacggaacccataaaacttccagtttgtattttcttcctacttccgcataatggcgattacccgggatattgtaccgggctaatatctagcgtaatgatgtgaagtgatcaatcaaatgtgtgccaaacacgaatcgatgattgtttacaaagtgttaacaccattgtcattacaactcgctacggacccaatgccatcttctcttcctgcgggcatgcttcatcaacagagtcttttggacgcttcaagtcccgcccactttcttgttaaaccccgcctttatctcacttggtttccataagaacgtacgaatttcgagtacatctttataccacttgaatgctaattcaaggtcaatagaatagcattgtgaacaagcttttaaaattttttaattcatttctaacagaaatctttgtttatctttaaaatacpegfp-1载体序列：tagttattactagcgctaccggactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaagcggccgcgactctagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaaggcgtaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtcctgaggcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaagatcgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccctagggggaggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaaggaacccgcgctatgacggcaataaaaagacagaataaaacgcacggtgttgggtcgtttgttcataaacgcggggttcggtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccattggggccaatacgcccgcgtttcttccttttccccaccccaccccccaagttcgggtgaaggcccagggctcgcagccaacgtcggggcggcaggccctgccatagcctcaggttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgccatgcat。序列表<110>中国科学院海洋研究所<120>一种长牡蛎engrailed2启动子及其重组表达载体及应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1919<212>dna<213>cgeng2启动子(cgiengrailed2)<400>1cgtgtaaaaggttcggacgctcttgttattaattatttactaatcaacaaaactttaatg60aaaggttaattttatgctttgtataacatgccgttaaaaacagatacgggcattgtttac120aacatatcacgcattgctatctaaacaaaggtctcgtgtcaacatgtggcaaagatggaa180tatagattttatcttaaatgtttgtttaaacacttttgatatcctacggtaatagtaaac240agttaggtaatcctttaacatcttgttaattttggcagattgttccggaaggtgtgaaaa300ggattttcgttaaattttaatgctcccctaatttttttggttagttttttgttagttttt360tttttctcttcacaactttaatgctcatacacggaggaaacatgcacatgcatccattgg420tttgaattaatttcatcgtaatatattacaatgggattggaacaagttctaaatcttatg480tagctctctcctcatacaataactgacatcaaaaatgttcgcatgtaaatgagatatatt540cactattaaagctttcttaaaaaatgtaaattaattacattaaagattcaaaatgaaata600ttctatattcttaaaaatagaacataaaaacttctgaattaatgtaaggaaaaaatgtaa660caactttataaaatcaggttatattcacttgcatctgacaacatacaaacagaatatgtc720catgtgtggtagcattatgtttggtatgagtatatgattgataaaaacgagagaagtcaa780agaagtgggtctaaaaattcaaagacatgggcaagtatattgtttcccctttgctaaata840cttgatgtgttgcaaacaaaaatgacattgacttttcccacacaagatttgtgcaagtta900attgccatagctttagatggaatatgatattgcaaaatattataattgatatttctctgc960gcgtggctcagtttacaaaatttaaaaaaaaaataaagtgcaaccttgtttagataacag1020ggaggtcgacggaatctctttttgacaactaatattttgcgagagtgttaatttaaattg1080gatttcaatgtcattaatcatgatctgccagttttatgaaatgaaaatacaagtacttca1140gttctatttgtaaattaacgtattaattttgatatccattaagggtattcattggaagtt1200aatataaagctattcatcgctaatacagagttattagcaaaatactgacgatatgagaat1260cttttgtgaacacatgagaaaaattttagtcaaagccgcagattatttaaagtctttgat1320atttagttaatatgaccaatgcccatgtcatatttccattttacatacaaagtaaaagtt1380cttatataatttgtttatctcacttttttctctccatttgtcaaagtcataaataaataa1440atcaaagaagcctgaaattgcactgttttaatgttaggtgaggtaacggaacccataaaa1500cttccagtttgtattttcttcctacttccgcataatggcgattacccgggatattgtacc1560gggctaatatctagcgtaatgatgtgaagtgatcaatcaaatgtgtgccaaacacgaatc1620gatgattgtttacaaagtgttaacaccattgtcattacaactcgctacggacccaatgcc1680atcttctcttcctgcgggcatgcttcatcaacagagtcttttggacgcttcaagtcccgc1740ccactttcttgttaaaccccgcctttatctcacttggtttccataagaacgtacgaattt1800cgagtacatctttataccacttgaatgctaattcaaggtcaatagaatagcattgtgaac1860aagcttttaaaattttttaattcatttctaacagaaatctttgtttatctttaaaatac1919<210>2<211>4151<212>dna<213>pegfp-1载体序列(pegfp-1)<400>2tagttattactagcgctaccggactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcg60acggtaccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctg120ttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttc180agcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatc240tgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggc300gtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgcc360atgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaag420acccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggc480atcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagc540cacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatc600cgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacaccccc660atcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctg720agcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgcc780gggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaagcggccgcgactctagatcataa840tcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccc900tgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttata960atggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgc1020attctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaaggcgtaaattgtaagcgtt1080aatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaatag1140gccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgtt1200gttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcga1260aaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttg1320gggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagct1380tgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggc1440gctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgctt1500aatgcgccgctacagggcgcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccct1560atttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctga1620taaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtcctgaggcggaaagaaccagctgtgga1680atgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaa1740gcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggca1800gaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgc1860ccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattt1920tttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgag1980gaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaagatcgatcaagagacaggatgaggatcg2040tttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagagg2100ctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccgg2160ctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaat2220gaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgca2280gctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccg2340gggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgat2400gcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaa2460catcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctg2520gacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatg2580cccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtg2640gaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctat2700caggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgac2760cgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgc2820cttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgc2880ccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcg2940gaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagt3000tcttcgcccaccctagggggaggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaaggaa3060cccgcgctatgacggcaataaaaagacagaataaaacgcacggtgttgggtcgtttgttc3120ataaacgcggggttcggtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccatt3180ggggccaatacgcccgcgtttcttccttttccccaccccaccccccaagttcgggtgaag3240gcccagggctcgcagccaacgtcggggcggcaggccctgccatagcctcaggttactcat3300atatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcc3360tttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcag3420accccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgct3480gcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctac3540caactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttc3600tagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcg3660ctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggt3720tggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgt3780gcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagc3840tatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggca3900gggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttata3960gtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcagggg4020ggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgct4080ggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtatta4140ccgccatgcat4151当前第1页12