一种GPCR靶向药物筛选系统及其构建和应用的制作方法

文档序号：15857019发布日期：2018-11-07 11:09阅读：286来源：国知局

本发明涉及一种gpcr靶向药物筛选系统及其构建和应用。

背景技术

g蛋白偶联受体(gprotein-coupledreceptors，gpcrs)家族是人类中最庞大的膜蛋白家族，也是当前研究最成功的药物靶标之一，迄今已有34％左右的上市药物以gpcr为靶点^1-3。据统计，2011至2015年期间，靶向gpcr的药物销量占全球市场的27％，销售额达到8900亿美金^2，4。尽管gpcr在所有成药性靶点中占比最大，但仍有四分之三的gpcr成员尚未被开发成药物靶点；目前只有约80种gpcr分子具有相对应的小分子药物^5，6。因此，基于重大疾病导向的gpcr配体研发需求十分迫切。gpcr靶向药物筛选面临的挑战之一就是创新的高通量药物筛选体系的构建。我们拟研发构建高通量、通用的、高稳定性的、基于活体细胞的gpcrs靶向药物筛选系统。

gpcr新型配体的发现与鉴定在新药研发过程中起到关键性作用，用于gpcr配体高通量筛选的方法应该具有稳定、非放射性、低成本、通用的、操作简单等特性⁷。传统常用的方法大多都是基于g蛋白依赖的功能分析。但这类方法受g蛋白种类的限制，并不是适用于所有gpcr，大大限制了筛选范围，并且检测方法繁琐，成本较高⁸。b.l.roth等人开发了名为presto-tangogpcr靶向药物筛选系统，该方法是是基于β-arrestin的招募，原理是当激动型配体l与gpcr结合，激活相应的gpcr，即可招募β-arrestin蛋白到受体的c端，而β-arrestin后面连接的tev剪切酶，会同时被招募过来，进而剪切带有gpcr载体的下游tev位点，释放tta入核，激活下游tta依赖的tre启动子，在该启动子下游连接上报告基因，通过检测报告基因，从而反应gpcr激活情况⁹。该种方法的优势在于适用于所有gpcr，并且灵敏度高，检测信号强，表明基于tango系统的gpcr靶向药物筛选的方法更有望成为研发创新药物的有力工具。

值得关注的是，传统的gpcr-tango系统的构建是通过瞬时转染的方法完成，不能长期在细胞的基因组中存在，一段时间后会发生丢失，系统存在不稳定性；这样就限制了药物筛选的时效性及可靠性。因此，亟需新的技术手段构建长期稳定表达的筛选系统。

转座子(transponson)也被称为转座元件，是指可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。作为有效的转基因工具，转座子可以将外源基因导入宿主基因组等基因编码操作¹⁰。piggybac(pb)转座子属于dna转座子的一种，是一种可移动的遗传元素，并通过“剪切-黏贴”转座模式进行转座，即转座酶(pbase)切割pb转座子两端反向重复序列(invertedterminalrepeat，itr)末端的ttaa序列，将转座子从原始基因座切下来，然后插入到基因组新的ttaa位点上。b转座系统作为一种新的基因转移手段，由于具有高转座活性、转座安全、稳定与无痕移除等特性而备受关注，在分子医学研究中具有较好的应用前景^11，12。现在piggybac系统已经被成功地用于基因组研究、基因治疗、干细胞诱导和诱导后分化等研究领域，是基因编码的有力工具^13-15。

由于现有的tango系统具有不稳定、成本高、操作繁琐等缺点；并且其最终检测的体系并不是基于活体细胞，不能直接反应待测配体的细胞毒性；显而易见，这就使得其不能作为长期且广泛使用的筛选系统。因此构建gpcr靶向药物的高通量、高稳定性、活体筛选系统势在必行。

参考文献

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技术实现要素：

本发明的目的是提供构建一种新的gpcr靶向药物筛选系统及其构建和应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种gpcr靶向药物筛选系统(piggybac-tango)，其特征在于，包括：将β-arrestin和烟草蚀纹病毒蛋白酶(tevprotease)连接组成的pb-β-arrestin-tevnia；以及将tet应答元件和gfp连接组成的pb-tre-gfp。

优选地，所述的pb-β-arrestin-tevnia以及pb-tre-gfp均以piggybac为载体，插入的目的基因为多拷贝，提高信噪比。

优选地，所述的pb-β-arrestin-tevnia以及pb-tre-gfp均以piggybac为载体，插入的目的基因的形式为稳定插入，具有稳定性。

优选地，所述的pb-β-arrestin-tevnia和pb-tre-gfp序列分别为seqidno.2和seqidno.5。

优选地，该系统的报告基因为gfp，结果可视化。

优选地，所述的gpcr靶向药物筛选系统还包括adora1受体质粒。

优选地，所述的gpcr靶向药物筛选系统(piggybac-tango)还包括gpcr通过烟草蚀纹病毒蛋白酶(tevprotease)切割位点与四环素反式作用因子tta组成的gpcr-tev-tta。

本发明还提供了能够表达piggybac-tango系统的细胞系的构建方法，其特征在于，包括：以piggybac转座子为载体，将pb-β-arrestin-tevnia及pb-tre-gfp导入细胞株基因组中并进行整合，得到能够表达piggybac-tango系统的细胞系。

本发明还提供了上述的piggybac-tango系统或能够表达piggybac-tango系统的细胞系在gpcr靶向药物筛选中的应用。

本发明的策略是：采用piggybac转座子将外源基因高效导入细胞株基因组中，整合效率高并可长期稳定表达。piggybac转座子介导的整合形式是多拷贝，这样也大大增强了检测信号，提高了灵敏度及信噪比。报告基因为gfp，结果可视化，操作简便，节省实验成本，并且在活体细胞上检测，可反应待测配体的细胞毒性。

本发明的gpcr靶向药物筛选系统piggybac-tango，其特征为高稳定性、多拷贝形式和基于活细胞筛选。所述的gpcr靶向药物筛选系统(piggybac-tango)以piggybac转座子介导，将外源基因高效导入细胞株基因组，整合效率高并可长期稳定表达。piggybac转座子介导的外源基因整合为多拷贝形式，放大检测信号，提高信噪比。报告基因为gfp，结果可视化，节省实验操作及成本。药物筛选系统为活细胞检测，可以反应待测配体的细胞毒性。

本发明针对以往系统的限制，构建的gpcr靶向药物筛选系统体现出的特点包括：(1)高稳定性(组成元件插入基因组中，可长期稳定表达)、(2)高灵敏度(外源基因整合形式是多拷贝，检测信号被放大)、(3)信噪比高、(4)低成本(不需要检测试剂)、(5)活体检测(可以反应待测配体的细胞毒性)。

实验结果表明，本发明的piggybac-tango系统具有以下优势：

(1)piggybac-tango系统具有高稳定性。

(2)piggybac-tango系统检测信号被放大，提高灵敏度及信噪比。

(3)piggybac-tango系统结果可视化，检测步骤简便，实验成本低。

(4)piggybac-tango系统在活体细胞上检测，可反应待测配体的细胞毒性。

附图说明

图1为piggybac-tango系统模式图；

图2为piggybac-tango系统元件示意图；

图3为元件2和3鉴定结果图；

(a)为元件2鉴定琼脂糖凝胶电泳图和测序结果图；

(b)为元件3鉴定琼脂糖凝胶电泳图和测序结果图；

图4为piggybac-tango系统在293t细胞稳定表达的琼脂糖凝胶电泳图和测序结果图；

图5为piggybac-tango系统验证结果图；

图6为piggybac-tango系统在4个单克隆细胞系稳定表达的琼脂糖凝胶电泳图；

图7为piggybac-tango系统在4个单克隆细胞系验证结果图；

图8为β-arrestin和gfp在4个单克隆细胞系表达拷贝数结果图。

具体实施方式

如下通过实施例对本发明做进一步解释说明。所描述的实施例仅用于说明本发明的特征，不因此限制本发明。他人一些非本质替换或改进在本发明的保护范围内。实施例中未注明厂商的试剂或仪器均可通过市场购买获得。未详细注明的实验方法，按照常规条件或试剂厂商推荐的方法实施。

以下实施例所用的质粒ac133-carpiggybactransposonvector(seqidno：1)，可按照下述文献记载的制备方法制备：zhu，x.，prasad，s.，gaedicke，s.，hettich，m.，firat，e.，andniedermann，g.(2015).patient-derivedglioblastomastemcellsarekilledbycd133-specificcartcellsbutinducethetcellagingmarkercd57.oncotarget6，171-184.

以下实施例所用的293t细胞的cdna可按照下述的制备方法制备：

1)rna提取：将293t细胞(购自atcc)接种于12孔板中，待贴壁后，加入1mltrizol(life，15596018)吹打，静置5min后吹打混匀并转入1.5ml离心管中，向离心管中加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，室温孵育2-3min，12000×g，4℃离心15min。离心后液体分为三层，小心吸取300μl上层液体，转移至新的ep管内。加入等量异丙醇混匀，室温静置10min。12000×g，4℃离心10min，去上清，加入1ml75％乙醇清洗，上下混匀6-8次。完全吸除乙醇，加入20μlnuclease-free水溶解，检测rna浓度。

2)rna反转录：使用的是反转录试剂盒(toyobo，fsq-301)，具体步骤如下：首先将440μl的4×dnmastermix与8.8μl的gdnaremover混合，把rna在65℃条件下热变性5min进行变性，立即置于冰上冷却。按以下反应去除基因组dna：2μl的4×dnmastermix，0.5μg的rnatemplate，nuclease-freewater补齐至8μl。将以上反应在冰上配制，轻轻混匀，之后在37℃条件下温育5分钟。之后进行逆转录反应，在之前的反应液中加入2μl的5×rtmastermixii，轻轻混匀，按以下温度进行反应：

37℃，15min

50℃，5min

98℃，5min

4℃，持续

反应结束后，293t细胞的cdna制备完成。

实施例

如图1所示，一种gpcr靶向药物筛选系统piggybac-tango，包括以piggybac为载体，将β-arrestin和烟草蚀纹病毒蛋白酶(tevprotease)连接组成pb-β-arrestin-tevnia；以piggybac为载体，将tet应答元件和gfp连接组成pb-tre-gfp。

上述的gpcr靶向药物筛选系统piggybac-tango的构建方法为：

1.piggybac-tango系统质粒的构建：

(1)构建嘌呤霉素(puromycin)筛选标记的pb-β-arrestin-tevnia质粒，策略为将ac133-carpiggybactransposonvector(seqidno：1)作为骨架，通过xbai(neb，r0145s)和ecori(neb，r3101l)双酶切获得线性化pb-t2a-puro载体。采用搭桥pcr的方法，设计搭桥引物，以f1，r1为引物(表1)，以293t细胞的cdna为模板，使用maxsuper-fidelitydnapolymerase(vazyme，p505-d3)进行pcr扩增，体系如下：

在热循环仪中，98℃热启动，58℃进行退火，72℃延伸，共反应35个循环，4℃保持。扩增出来的pcr产物经过下述步骤纯化：加入三倍体积的pcr-a(axygen：ap-pcr-250g)，并过柱，12000转/分钟离心1分钟；弃废液，加入500μlw2(ap-pcr-250g)，离心1分钟；空转1分钟，加入20μl灭菌水洗脱，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定获得片段β-arrestin。

以f2，r2为pcr引物(表1)，以tevnia(seqidno：2，金斯瑞生物科技有限公司(http：//www.genscript.com.cn/)合成)为模板，使用maxsuper-fidelitydnapolymerase(vazyme，p505-d3)进行pcr扩增，体系如下：

以片段β-arrestin和片段tevnia为模板，正向引物f1(表1)带有xbai酶切位点，反向引物r2(表1)带有ecori酶切位点，进行搭桥pcr，使用maxsuper-fidelitydnapolymerase(vazyme，p505-d3)进行pcr扩增，体系如下：

将线性化pb-t2a-puro载体与β-arrestin-tevnia一同用xbai和ecori做酶切，通过t4连接酶(neb，m0202s)连接获得质粒pb-β-arrestin-tevnia-t2a-puro(图2，seqidno：3)。将上述步骤获得的连接产物转化dh5α感受态细胞，并涂amp+平板(50μg/ml)，并挑取克隆。以酶切位点上下游100-300bp左右设计引物t1-f、t1-r、t2-f以及t2-r(表1)并合成，通过pcr及常规测序的方法鉴定获得阳性克隆，凝胶电泳及测序结果如图3a所示。

(2)构建潮霉素(hygromycin)筛选标记的pb-tre-egfp质粒，策略为以

pb-tre-nls-3xflag-cas9-p2a-hygro为载体(seqidno：4，金斯瑞生物科技有限公司(http：//www.genscript.com.cn/)合成)，通过xmai(neb，r0180s)和bamhi(neb，r0136s)双酶切获得线性化pb-tre-t2a-hygro载体。设计正向引物f3带有xmai酶切位点，反向引物r3带有bamhi酶切位点(表1)，以oct4-ires-egfp-pgk-neo(seqidno：5，addgene，48681)为模板，使用maxsuper-fidelitydnapolymerase(vazyme，p505-d3)进行pcr扩增，体系如下：

在热循环仪中，98℃热启动，58℃进行退火，72℃延伸，共反应35个循环，4℃保持。扩增出来的pcr产物经过下述步骤纯化：加入三倍体积的pcr-a(axygen：ap-pcr-250g)，并过柱，12000转/分钟离心1分钟；弃废液，加入500μlw2(ap-pcr-250g)：，离心1分钟；空转1分钟，加入20μl灭菌水洗脱，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定获得片段egfp。将线性化的pb-tre-p2a-hygro载体与egfp一同用xmai和bamhi做酶切，通过t4连接酶(neb，m0202s)连接获得质粒pb-tre-egfp-p2a-hygro(图2，seqidno：6)。将上述步骤获得的连接产物转化dh5α感受态细胞，并涂amp+平板(50μg/ml)，并挑取克隆。以酶切位点上下游150-300bp左右设计并引物t3-f、t3-r、t4-f以及t4-r(表1)并合成，通过pcr及常规测序的方法鉴定获得阳性克隆，凝胶电泳及测序结果如图3b所示。

2.稳定表达piggybac-tango系统的293t细胞系构建

我们将piggybac-tango系统中元件2和3对293t细胞进步电转，具体操作如下：

1)hek293t细胞(来自atcc)复苏，在10cm培养皿(corning，430167)中培养，培养基为混有10％的胎牛血清(gemini，100525)，1％双抗(life，15140122)的dmem(hyclone，sh30243.01)。培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。多次传代后当细胞密度为70-80％时，进行消化离心，用5mlpbs重悬，并计数。

2)根据sfcellline4dxkitl(lonza-amaxa，v4xc-2024)的操作步骤，取出1×10⁶个细胞于无菌1.5mlep管中，200×g常温离心10min。

3)电转体系：100μl

枪头吹打，温和混匀细胞，避免气泡。

4)缓慢将细胞混悬液加入电转杯底部，轻拍赶出气泡，放入电转仪中，使用ds150程序，进行电转。

5)结束后，立即将细胞混悬液转移至预先放入培养箱中预热的6cm皿中进行培养。培养基为混有10％的胎牛血清，1％双抗的dmem。

6)电转后24h，加嘌呤霉素2μg/ml(invivogen，ht-pr-1)，处理2周，期间正常传代换液。设置293t对照组，对照组细胞没有存活，电转组存活细胞扩大培养，期间培养基为混有10％的胎牛血清、1％双抗、嘌呤霉素2μg/ml的dmem。

7)将以上细胞扩大培养后(2-3周)，通过流式分选去除表达绿色荧光背景较强的细胞群体。

8)将细胞接种于10cm培养皿，当细胞浓度为80％时，用10％血清的dmem培养基换液，培养2小时使细胞状态恢复最佳。转染的质粒为ptet-onadvanced(clontech，631069)，将24μg质粒混在1.5ml的opti-mem(gibco，11058021)培养基，涡旋混匀。将60μl的lipofectamine2000转染试剂(thermo，11668019)混入1.5ml的opti-mem培养基，涡旋混匀，分别静置5分钟。

9)将混有质粒的opti-mem加入混有lipofectamine2000的opti-mem，慢速速吹打混匀，静置20分钟。

10)将以上混合的opti-mem缓慢滴入10cm培养皿中。

11)转染6小时后用10％fbs的dmem换液，并同时加入2μg/ml的强力霉素。

12)24h后，观察荧光，并通过流式分选收集表达绿色荧光的细胞，并扩大培养，培养基为混有10％的胎牛血清、1％双抗、嘌呤霉素2μg/ml的dmem。

3.piggybac-tango系统的验证

1)将以上细胞扩大培养直至绿色荧光消失。

2)取部分细胞，胰蛋白酶消化后收集在1.5ml离心管中，加入500ul组织裂解液(裂解液的成分为50mmkcl，1.5mmmgcl2，10mmtrisph8.0，0.5％nonidetp-40，0.5％tween20，100μg/mlproteasek)和5ul蛋白酶k(yeasen，10401es60，10ug/ul)后置于55℃水浴，过夜裂解后，用苯酚-氯仿法抽提基因组dna，并测定浓度。

3)根据之前设计的t1、t2、t3、t4的正反引物进行pcr，通过凝胶电泳以及常规测序确定piggybac-tango系统中元件2和3已经成功插入293t细胞基因组中，结果如图4所示。

4)待基因型确定后，将细胞铺24孔板，细胞密度在70％-80％时使用lipo2000转染adora1受体质粒(addgene，1000000068，为gpcr通过烟草蚀纹病毒蛋白酶(tevprotease)切割位点与四环素反式作用因子tta组成gpcr-tev-tta)，6-8小时后，换液。

5)转染24小时后，加入5μmneca(adora1受体的激动剂，sigma，e2387)。

6)24小时后，观察荧光情况，结果为neca激活adora1受体后，成功引起β-arrestin的招募及tev的切割，从而启动egfp的表达。以上结果证明，我们成功制备了高质量的piggy-tango-293t系统(图5)

7)采用流式分选技术，将表达绿色荧光细胞进行单细胞分选，并接种于96孔板中。并扩大培养，分别提取基因组，进行基因型鉴定。通过凝胶电泳以及常规测序确定单克隆细胞系cella，cellb，cellc，celld均稳定表达piggybac-tango系统中元件2和3(图6)。

8)根据上述鉴定结果，将以上4个单克隆细胞系进行adora1转染，24h后，5μm激动剂neca过夜处理。结果如图7，adora1转染后，低背景，基本与空白组一致。加入激动剂neca后，激活受体adora1，从而使得egfp表达。以上结果证明，我们成功制备了高质量，高稳定性的piggy-tango系统，并且成功制备了piggy-tango系统的单克隆细胞系。

9)根据验证结果，分别提取四个单克隆细胞系的rna，并进行反转录获得cdna，之后进行q-pcr，考察不同单克隆细胞系piggy-tango报告基因的拷贝数，结果如图8，单克隆细胞系celllinea，celllineb，celllinec，celllined报告基因的拷贝数相对于正常293t细胞系相比分别为38，17，15，34。表明，piggy-tango报告系统报告基因的表达基因为多拷贝，从而增强检测信号，提高信噪比。

综上，本发明的策略以用于成功构建gpcr靶向药物筛选系统-piggy-tango，该系统所体现的特点为：(1)高稳定性(利用piggybac将组成元件插入基因组中，可长期稳定表达)；(2)高灵敏度(外源基因整合形式是多拷贝，检测信号被放大)；(3)信噪比高；(4)低成本(不需要检测试剂)；(5)活体检测(可以反应待测配体的细胞毒性)。piggybac-tango系统是gpcr靶向药物研发的有效工具。

表1引物序列

序列表

<110>上海科技大学

<120>一种gpcr靶向药物筛选系统及其构建和应用

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>7857

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

actcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggata60

catatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaa120

agtgccacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaa180

atcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaa240

tagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaac300

gtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaa360

ccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccct420

aaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaa480

gggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgc540

gtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattc600

aggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctg660

gcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtca720

cgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcctcgttcattcacgtttttgaacccgtg780

gaggacgggcagactcgcggtgcaaatgtgttttacagcgtgatggagcagatgaagatg840

ctcgacacgctgcagaacacgcagctagattaaccctagaaagataatcatattgtgacg900

tacgttaaagataatcatgtgtaaaattgacgcatgtgttttatcggtctgtatatcgag960

gtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacacttacatactaata1020

ataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaacaaaaactcaa1080

aatttcttctataaagtaacaaaacttttatgagggacagcccccccccaaagcccccag1140

ggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgagccgcccggggctccgctc1200

cggtccggcgctccccccgcatccccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacgg1260

ggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcaga1320

cacctggggggatacggggaaaaggcctccacggccaaggatctgcgatcgctccggtgc1380

ccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcgg1440

caattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgta1500

ctggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgt1560

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