本发明属于酸奶发酵剂技术领域，尤其涉及一种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备工艺及其在酸奶发酵剂冻干粉中的应用。
背景技术
直投式酸奶发酵菌是目前市场上主流的商用酸奶发酵菌。直投式酸奶发酵菌一般由保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜热乳杆菌等几种菌株混合组成，其特点是活菌含量高、发酵活力强，可直接投放进牛奶或奶粉溶液中发酵酸奶而不经过传统的转代培养。这其中，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是主要的发酵菌种，但这两种菌一般不能单独用作酸奶发酵菌，单独使用时对最终酸奶的质地和风味存在较大的缺陷，如：凝乳时间长、酸度不够、粘度不足、香味不足等。因此，市场上的主流直投式酸奶发酵菌一般都必须含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。
目前市场上的主流直投式酸奶发酵菌的制备一般都是将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌单独发酵制备成冻干粉，然后再将冻干粉按照一定比例混合。采用这种方法需要经过两次发酵，两次真空冷冻干燥和一次混合，生产成本较高。混菌发酵工艺最大的挑战批次之间的发酵稳定性。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备工艺及其在酸奶发酵剂冻干粉中的应用，充分利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的共生关系，通过一次发酵制备直投式酸奶发酵菌。
本发明通过如下技术方案实现上述目的：。
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备方法，包括以下步骤：
s1，混合菌种的制备：混合菌种由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成，以甘油管的形式保存，每毫升菌液的活菌比例为：嗜热链球菌活菌数：保加利亚乳杆菌活菌数＝10:1；
s2，保加利亚乳杆菌菌种的制备：保加利亚乳杆菌菌种以甘油管的形式保存；
s3，种子培养基:脱脂乳粉：10％；
s4，发酵培养基：麦芽糖：1％-5％、葡萄糖2％-5％、乳糖2％-10％、脱脂乳粉3％-8％、乳清粉1％-10％、硫酸镁0.1％-1％、硫酸锰0.01％-1％、吐温80：0.1％-1％、生物素0.1％-1％；
s5，培养基灭菌：种子培养基121℃灭菌5分钟，放凉待用，发酵培养基115℃灭菌30分钟，待温度冷却至37℃以下时接种。
具体的，在步骤s1中，每只甘油管含3ml菌液，每毫升菌液的活菌含量为：3*109cfu-6*109cfu。
具体的，在步骤s2中，每只甘油管含2ml菌液，每毫升菌液的活菌含量为3*108cfu-6*108cfu。
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备方法制备的酸奶发酵剂冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
s1，混菌种子培养：从混合菌种的甘油管中吸取一定量的菌液，按照10％的接种比例，接入试管种子培养基中，于37℃培养5-24小时，试管种子培养基以此方法传三代，然后将培养好的第三代试管种子培养基以10％的接种量接入三角瓶种子培养基中，于37℃培养5-24小时，然后将三角瓶种子培养基以10％的接种量接入发酵罐种子培养基中，以慢转速于37℃培养5-24小时，发酵罐种子培养好以后，即为发酵混菌种子；
s2，保加利亚乳杆菌菌种的培养：从保加利亚乳杆菌的甘油管中，吸取一定量的菌液，按照10％的接种比例，接入试管种子培养基中，于37℃培养5-24小时，试管种子培养基以此方法传三代，然后将培养好的第三代试管种子培养基以10％的接种量接入三角瓶种子培养基中，于37℃培养5-24小时，然后将三角瓶种子培养基以10％的接种量接入发酵罐种子培养基中，以慢转速于37℃培养5-24小时，发酵罐种子培养好以后，即为保加利亚乳杆菌种子；
s3，将步骤1培养好的混菌种子，按照3％-5％的比例接入发酵培养基中；
s4，发酵培养基接种好以后，发酵罐设置发酵温度为37℃，转速50-100rmp，发酵初始ph用氢氧化钠调整为6.0；
s5，发酵过程中，当ph降低至5.5时，补加氨水，用氨水控制ph恒定在5.5；
s6，发酵过程中，记录氨水的添加速度，当氨水的添加速度变慢时，将保加利亚乳杆菌菌种按照5％的比例接入发酵罐中，此即为二次接种，二次接种时，向发酵罐中添加0.2％的碳酸钠；
s7，二次接种后，依旧在37℃条件下，转速50-100rpm培养，调整发酵罐ph控制在5.0；
s8，待再次观测到氨水补加速度变慢，发酵罐菌浓大于10亿cfu/ml时，终止发酵，放罐进行发酵液的后处理。
具体的，在步骤s7中，当发酵罐ph降低至5.0时，补加氨水将发酵罐ph稳定控制在5.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
到达发酵终点时：发酵罐中的菌浓大于10亿cfu/ml，经过后期的浓缩冻干处理后，形成的酸奶发酵菌冻干粉的菌浓大于1000亿cfu/g；能让发酵液中的嗜热链球菌活菌量：保加利亚乳杆菌活菌≈10:1，批次之间很稳定，将发酵液中的活菌后期浓缩冻干处理后，形成的酸奶发酵菌冻干粉的产酸能力很稳定，形成的酸奶结构状态和风味很稳定；采用本工艺发酵，每毫升发酵液在42℃条件下发酵1公斤市售纯牛奶，4小时酸度可达到82°t(吉尔涅尔度)；用发酵液经后期真空冷冻干燥制成的冻干粉，每25克在42℃条件下发酵1吨市售纯牛奶4小时酸度可达到80.5°t(吉尔涅尔度)，完全达到了商用直投式酸奶发酵菌的发酵能力；相比传统的单株菌的发酵工艺可以节省一次发酵、一次冻干和一次混料的生产成本；最后浓缩制得的酸奶发酵菌冻干粉，菌种之间的相容性更好，用于发酵酸奶时，启动速度更快；采用了二次接种方法，第二次接种时加入了碳酸钠，能更快的缩短二次接种的保加利亚乳杆菌的潜伏期；二次接种的保加利亚乳杆菌能促进嗜热链球菌的二次生长，在相同的培养条件下最终让发酵液达到更高的菌浓；作为对比，如果用嗜热链球菌或保加利亚乳杆菌单菌株发酵，用上诉种子培养基、发酵培养基和培养条件，最终发酵液的菌浓小于10亿cfu/ml。
具体实施方式
以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备方法，包括以下步骤：
s1，混合菌种的制备：混合菌种由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成，以甘油管的形式保存；每只甘油管含3ml菌液，每毫升菌液的活菌含量为：4.5*109cfu，每毫升菌液的活菌比例为：嗜热链球菌活菌数：保加利亚乳杆菌活菌数＝10:1；
s2，保加利亚乳杆菌菌种的制备：保加利亚乳杆菌菌种以甘油管的形式保存；每只甘油管含2ml菌液，每毫升菌液的活菌含量为4.5*108cfu；
s3，种子培养基:脱脂乳粉：10％；
s4，发酵培养基：麦芽糖：3％、葡萄糖4％、乳糖6％、脱脂乳粉5％、乳清粉5％、硫酸镁0.6％、硫酸锰0.5％、吐温80：0.6％、生物素0.6％；
s5，培养基灭菌：种子培养基121℃灭菌5分钟，放凉待用；发酵培养基115℃灭菌30分钟，待温度冷却至37℃以下时接种。
根据保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备方法制备的酸奶发酵剂冻干粉，酸奶发酵剂冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
s1，混菌种子培养：从混合菌种的甘油管中吸取一定量的菌液，按照10％的接种比例，接入试管种子培养基中，于37℃培养5小时，试管种子培养基以此方法传三代；然后将培养好的第三代试管种子培养基以10％的接种量接入三角瓶种子培养基中，于37℃培养5小时；然后将三角瓶种子培养基以10％的接种量接入发酵罐种子培养基中，以慢转速于37℃培养5小时，发酵罐种子培养好以后，即为发酵混菌种子；
s2，保加利亚乳杆菌菌种的培养：从保加利亚乳杆菌的甘油管中，吸取一定量的菌液，按照10％的接种比例，接入试管种子培养基中，于37℃培养5小时，试管种子培养基以此方法传三代；然后将培养好的第三代试管种子培养基以10％的接种量接入三角瓶种子培养基中，于37℃培养5小时；然后将三角瓶种子培养基以10％的接种量接入发酵罐种子培养基中，以慢转速于37℃培养5小时，发酵罐种子培养好以后，即为保加利亚乳杆菌种子；
s3，将步骤1培养好的混菌种子，按照5％的比例接入发酵培养基中；
s4，发酵培养基接种好以后，发酵罐设置发酵温度为37℃，转速50rmp，发酵初始ph用氢氧化钠调整为6.0；
s5，发酵过程中，当ph降低至5.5时，补加氨水，用氨水控制ph恒定在5.5；
s6，发酵过程中，记录氨水的添加速度，当氨水的添加速度变慢时，将保加利亚乳杆菌菌种按照5％的比例接入发酵罐中，此即为二次接种，二次接种时，向发酵罐中添加0.2％的碳酸钠；
s7，二次接种后，依旧在37℃条件下，转速50rpm培养，调整发酵罐ph控制在5.0，当发酵罐ph降低至5.0时，补加氨水将发酵罐ph稳定控制在5.0；
s8，待再次观测到氨水补加速度变慢，发酵罐菌浓大于10亿cfu/ml时，终止发酵，放罐进行发酵液的后处理。
采用本工艺发酵，每毫升发酵液在42℃条件下发酵1公斤市售纯牛奶，4小时酸度可达到80°t(吉尔涅尔度)；用发酵液经后期真空冷冻干燥制成的冻干粉，每25克在42℃条件下发酵1吨市售纯牛奶4小时酸度可达到75°t(吉尔涅尔度)，完全达到了商用直投式酸奶发酵菌的发酵能力。
实施例2：
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备方法，包括以下步骤：
s1，混合菌种的制备：混合菌种由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成，以甘油管的形式保存；每只甘油管含3ml菌液，每毫升菌液的活菌含量为：3*109cfu，每毫升菌液的活菌比例为：嗜热链球菌活菌数：保加利亚乳杆菌活菌数＝10:1；
s2，保加利亚乳杆菌菌种的制备：保加利亚乳杆菌菌种以甘油管的形式保存；每只甘油管含2ml菌液，每毫升菌液的活菌含量为6*108cfu；
s3，种子培养基:脱脂乳粉：10％；
s4，发酵培养基：麦芽糖：1％、葡萄糖5％、乳糖2％、脱脂乳粉8％、乳清粉1％、硫酸镁1％、硫酸锰0.01％、吐温80：1％、生物素0.1％；
s5，培养基灭菌：种子培养基121℃灭菌5分钟，放凉待用；发酵培养基115℃灭菌30分钟，待温度冷却至37℃以下时接种。
根据保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备方法制备的酸奶发酵剂冻干粉，酸奶发酵剂冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
s1，混菌种子培养：从混合菌种的甘油管中吸取一定量的菌液，按照10％的接种比例，接入试管种子培养基中，于37℃培养24小时，试管种子培养基以此方法传三代；然后将培养好的第三代试管种子培养基以10％的接种量接入三角瓶种子培养基中，于37℃培养24小时；然后将三角瓶种子培养基以10％的接种量接入发酵罐种子培养基中，以慢转速于37℃培养24小时，发酵罐种子培养好以后，即为发酵混菌种子；
s2，保加利亚乳杆菌菌种的培养：从保加利亚乳杆菌的甘油管中，吸取一定量的菌液，按照10％的接种比例，接入试管种子培养基中，于37℃培养24小时，试管种子培养基以此方法传三代；然后将培养好的第三代试管种子培养基以10％的接种量接入三角瓶种子培养基中，于37℃培养24小时；然后将三角瓶种子培养基以10％的接种量接入发酵罐种子培养基中，以慢转速于37℃培养24小时，发酵罐种子培养好以后，即为保加利亚乳杆菌种子；
s3，将步骤1培养好的混菌种子，按照3％的比例接入发酵培养基中；
s4，发酵培养基接种好以后，发酵罐设置发酵温度为37℃，转速100rmp，发酵初始ph用氢氧化钠调整为6.0；
s5，发酵过程中，当ph降低至5.5时，补加氨水，用氨水控制ph恒定在5.5；
s6，发酵过程中，记录氨水的添加速度，当氨水的添加速度变慢时，将保加利亚乳杆菌菌种按照5％的比例接入发酵罐中，此即为二次接种，二次接种时，向发酵罐中添加0.2％的碳酸钠；
s7，二次接种后，依旧在37℃条件下，转速100rpm培养，调整发酵罐ph控制在5.0，当发酵罐ph降低至5.0时，补加氨水将发酵罐ph稳定控制在5.0；
s8，待再次观测到氨水补加速度变慢，发酵罐菌浓大于10亿cfu/ml时，终止发酵，放罐进行发酵液的后处理。
采用本工艺发酵，每毫升发酵液在42℃条件下发酵1公斤市售纯牛奶，4小时酸度可达到84°t(吉尔涅尔度)；用发酵液经后期真空冷冻干燥制成的冻干粉，每25克在42℃条件下发酵1吨市售纯牛奶4小时酸度可达到85°t(吉尔涅尔度)，完全达到了商用直投式酸奶发酵菌的发酵能力。
实施例3：
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备方法，包括以下步骤：
s1，混合菌种的制备：混合菌种由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成，以甘油管的形式保存；每只甘油管含3ml菌液，每毫升菌液的活菌含量为：6*109cfu，每毫升菌液的活菌比例为：嗜热链球菌活菌数：保加利亚乳杆菌活菌数＝10:1；
s2，保加利亚乳杆菌菌种的制备：保加利亚乳杆菌菌种以甘油管的形式保存；每只甘油管含2ml菌液，每毫升菌液的活菌含量为3*108cfu；
s3，种子培养基:脱脂乳粉：10％；
s4，发酵培养基：麦芽糖：5％、葡萄糖2％、乳糖10％、脱脂乳粉3％、乳清粉10％、硫酸镁0.1％、硫酸锰1％、吐温80：0.1％、生物素1％；
s5，培养基灭菌：种子培养基121℃灭菌5分钟，放凉待用；发酵培养基115℃灭菌30分钟，待温度冷却至37℃以下时接种。
根据保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备方法制备的酸奶发酵剂冻干粉，酸奶发酵剂冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
s1，混菌种子培养：从混合菌种的甘油管中吸取一定量的菌液，按照10％的接种比例，接入试管种子培养基中，于37℃培养16小时，试管种子培养基以此方法传三代；然后将培养好的第三代试管种子培养基以10％的接种量接入三角瓶种子培养基中，于37℃培养16小时；然后将三角瓶种子培养基以10％的接种量接入发酵罐种子培养基中，以慢转速于37℃培养16小时，发酵罐种子培养好以后，即为发酵混菌种子；
s2，保加利亚乳杆菌菌种的培养：从保加利亚乳杆菌的甘油管中，吸取一定量的菌液，按照10％的接种比例，接入试管种子培养基中，于37℃培养16小时，试管种子培养基以此方法传三代；然后将培养好的第三代试管种子培养基以10％的接种量接入三角瓶种子培养基中，于37℃培养16小时；然后将三角瓶种子培养基以10％的接种量接入发酵罐种子培养基中，以慢转速于37℃培养16小时，发酵罐种子培养好以后，即为保加利亚乳杆菌种子；
s3，将步骤1培养好的混菌种子，按照4％的比例接入发酵培养基中；
s4，发酵培养基接种好以后，发酵罐设置发酵温度为37℃，转速80rmp，发酵初始ph用氢氧化钠调整为6.0；
s5，发酵过程中，当ph降低至5.5时，补加氨水，用氨水控制ph恒定在5.5；
s6，发酵过程中，记录氨水的添加速度，当氨水的添加速度变慢时，将保加利亚乳杆菌菌种按照5％的比例接入发酵罐中，此即为二次接种，二次接种时，向发酵罐中添加0.2％的碳酸钠；
s7，二次接种后，依旧在37℃条件下，转速80rpm培养，调整发酵罐ph控制在5.0，当发酵罐ph降低至5.0时，补加氨水将发酵罐ph稳定控制在5.0；
s8，待再次观测到氨水补加速度变慢，发酵罐菌浓大于10亿cfu/ml时，终止发酵，放罐进行发酵液的后处理。
采用本工艺发酵，每毫升发酵液在42℃条件下发酵1公斤市售纯牛奶，4小时酸度可达到82°t(吉尔涅尔度)；用发酵液经后期真空冷冻干燥制成的冻干粉，每25克在42℃条件下发酵1吨市售纯牛奶4小时酸度可达到80.5°t(吉尔涅尔度)，完全达到了商用直投式酸奶发酵菌的发酵能力。
上述实施例中，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵制备工艺及其在酸奶发酵剂冻干粉中的应用具有如下有益效果：
到达发酵终点时：发酵罐中的菌浓大于10亿cfu/ml，经过后期的浓缩冻干处理后，形成的酸奶发酵菌冻干粉的菌浓大于1000亿cfu/g；能让发酵液中的嗜热链球菌活菌量：保加利亚乳杆菌活菌≈10:1，批次之间很稳定，将发酵液中的活菌后期浓缩冻干处理后，形成的酸奶发酵菌冻干粉的产酸能力很稳定，形成的酸奶结构状态和风味很稳定；相比传统的单株菌的发酵工艺可以节省一次发酵、一次冻干和一次混料的生产成本；最后浓缩制得的酸奶发酵菌冻干粉，菌种之间的相容性更好，用于发酵酸奶时，启动速度更快；采用了二次接种方法，第二次接种时加入了碳酸钠，能更快的缩短二次接种的保加利亚乳杆菌的潜伏期；二次接种的保加利亚乳杆菌能促进嗜热链球菌的二次生长，在相同的培养条件下最终让发酵液达到更高的菌浓；作为对比，如果用嗜热链球菌或保加利亚乳杆菌单菌株发酵，用上诉种子培养基、发酵培养基和培养条件，最终发酵液的菌浓小于10亿cfu/ml。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。