用于治疗癌症的化合物、组合物及其用途的制作方法

本公开一般性涉及医学和癌症治疗领域。本发明更具体地涉及新化合物，其是异银杏黄素(isoginkgetin)的衍生物并且各自通常用作药物。特别地，本发明涉及这些新化合物在增加对象中癌细胞对(抗原)肽、优选先驱翻译产物(pioneertranslationproducts，ptp)源性抗原的呈递、通常是产生和呈递并诱导或刺激对象的免疫应答中的用途。所述免疫应答通常针对肿瘤抗原，更一般而言针对所述对象所患的癌性肿瘤。

本公开还涉及这样的化合物的用途，特别是用于制备药物组合物和/或允许或改善有需要的对象的癌症治疗效率的用途。本发明的每种化合物确实可以有利地与至少一种不同的抗癌剂、通常是化疗药物、和/或与放射疗法联合用于对象治疗癌症、预防癌症转移和/或预防癌症复发。

本发明还公开了预防或治疗对象的癌症、癌症转移和/或癌症复发的方法。另外，本发明提供了适合用于制备本发明的组合物和/或实施本文中描述的方法的试剂盒。

背景技术：

所有有核细胞均通过i类主要组织相容性复合体(mhc-1)途径在它们的表面呈递抗原肽(ap)。ap的长度为8至10个氨基酸并反映了固有的细胞活性(caron等人)。因为它们的呈递指导了免疫细胞、主要是细胞毒性cd8⁺t细胞(ctl)和cd4⁺t辅助细胞对潜在危险元素的监视，所以ap是目前开发的治疗性抗癌疫苗的靶标。尽管有希望，但靶向肿瘤相关抗原(taa)的治疗性疫苗的临床试验结果未达到它们的预期。主要的失败与免疫抑制机制和抗原选择达不到最佳有关(mellman等人；burg等人)。驱动肿瘤免疫选择而且与不良预后相关的重要事件之一是肿瘤细胞对mhci类抗原呈递的丧失或下调(watson等人；liu等人)。这些最后可由于mhci类通路的成分的缺陷而逃脱ctl和自然杀伤细胞的识别(leone等人)。随着mhci类抗原呈递的总体减少，在细胞表面呈递的抗原的性质，称为mhcii类免疫肽组(mip)，对于免疫识别至关重要。在已鉴别出特异性taa并用免疫疗法靶向的癌症中，例如乳腺癌中的her/neu或结肠癌中的cea，这种taa表达在肿瘤细胞表面的丧失导致免疫逃避(lee等人；kmieciak等人)。为了解决这个问题，当前的策略旨在扩大所靶向的癌症肽的范围和恢复mhc抗原呈递。

为了了解mip的动力学，可以重点关注mhci类呈递途径的ap的来源。首先认为内源性ap严格地来自衰老蛋白质的降解。然而，提示可替选来源的模型已经挑战了这一概念。1996年，j.yewdell小组介绍了缺陷性核糖体产物(drip)的概念(yewdell等人，1996)，最初被描述为由于其构象不稳定而迅速降解的产物。最近，发明人从不同的角度探索了这一概念，表明ap的主要来源源自于在内含子被剪接之前发生并且与全长蛋白的翻译事件无关的先驱翻译事件(apcher等人，2011)。因此，产生的非规范肽可以源自于内含子序列、3’或5’utr区域以及可替选阅读框。这些多肽被描述为先驱翻译产物(ptp)。ptp的发现提示存在复杂的翻译核机制，其目的部分在于通过为mhci类途径生成相关且合适的多肽来塑造mip。而且，ptp似乎在癌症发展的动力学中发挥作用。当在小鼠中接种时，已显示出在其表面呈递ptp源性抗原的癌细胞可被特异性t细胞识别，导致肿瘤生长降低。此外，含有模型表位的纯化ptp当作为肽疫苗注射到小鼠中时，有效地促进抗癌免疫应答(duvallet等人)。

前体mrna(pre-mrna)剪接是在细胞核中由剪接体催化的，剪接体是一种保守且动态的多蛋白复合体，由五个小核rna(snrna)u1、u2、u4、u5和u6组成，所述小核rna是与超过200个蛋白的复合体。越来越多的研究报道了在许多造成异常肿瘤细胞增殖和进展的癌症中，所述剪接体复合体的失调必然导致异常的剪接模式。自2011年以来，已经在包括骨髓单核细胞白血病、粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌或多发性骨髓瘤的几种癌症中报道了频发的剪接体突变。

发明人现在在此描述了用于在对象中治疗癌症、预防癌症转移和/或预防癌症复发的新化合物。

技术实现要素：

发明人首次产生并在此描述了用作药物的下式的化合物

其中r¹和r²独立地选自na、h、-ch3、-ch2-ch3、-ch2-ch＝ch3、n-ch2-ch2-ch3、p(o)(o-ch2-ch3)2、p(o)(oh)2或p(o)(ona)2并且其中r¹、r²、r³、r⁴和r⁵不同时是h，其中当r²是p(o)(ona)2或p(o)(oh)2并且r³、r⁴和r⁵中的每一个都是h时，r¹不是-ch3，以及其中当r²是-ch3并且r³、r⁴和r⁵中的每一个都是h时，r¹不是-ch3或h；

并且其中r³、r⁴和r⁵独立地选自h、ch3、-ch2-ch3、-ch2-ch＝ch3和cnh2n+1，其中n＝3-10。

该化合物及其立体异构体或及其药学上可接受的盐，可以有利地用作药物。

在一个优选实施方式中，本发明涉及一种特定的式(i)化合物，其中r¹是na，r²是p(o)(ona)2，并且r³、r⁴和r⁵中的每一个都是h(在本文中也通常标识为“ip2”或更具体地标识为“ip2-6na”)：

在另一个优选实施方式中，本发明涉及一种特定的式(i)化合物，其中r¹是h，r²是p(o)(ona)2，并且r³、r⁴和r⁵中的每一个都是h(在本文中也通常标识为“ip2”或更具体地标识为“ip2-4na”)：

在本文所述的一个优选方面，式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)，或其立体异构体或药学上可接受的盐，用于在对象中治疗癌症、预防癌症转移和/或预防癌症复发。

进一步描述了式(i)的化合物、优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)在诱导或增加癌细胞呈递、通常是产生和呈递(抗原)肽、优选先驱翻译产物(ptp)源性抗原中的体内、体外或离体用途。

式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)，允许医生通过刺激对象的免疫系统来预防或控制、优选减少癌细胞增殖。它还有利地能够增加其他癌症治疗的有效性。发明人在此证明，该化合物还能够降低转移和/或癌症复发的风险。

本文还描述了一种组合物，其包含这样的式(i)化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)，和药学上可接受的载体，优选与待同时、分别或顺序地使用的至少一种不同的抗癌剂一起。这样的组合物通常用于在对象中治疗癌症、预防癌症转移和/或预防癌症复发。

本文还描述了一种用于治疗对象的癌症的方法，所述方法包括给所述对象施用化合物、通常为式(i)的化合物、优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)、或如本文所述的组合物的步骤。

还描述了一种试剂盒，其包含在不同容器中的式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)，以及优选地至少一种不同的抗癌剂，及其用途，特别是在制备如本文所述的组合物中的用途。

具体实施方式

发明人产生了一种双黄酮类(biflavonoid)异银杏黄素衍生物，其在本发明的上下文中首次描述并被标识为“式(i)的化合物”：

其中r¹和r²独立地选自na、h、-ch3、-ch2-ch3、-ch2-ch＝ch3、n-ch2-ch2-ch3、p(o)(o-ch2-ch3)2、p(o)(oh)2或p(o)(ona)2并且其中r¹、r²、r³、r⁴和r⁵不同时是h，其中当r²是p(o)(ona)2或p(o)(oh)2并且r³、r⁴和r⁵中的每一个都是h时，r¹不是-ch3，以及其中当r²是-ch3并且r³、r⁴和r⁵中的每一个都是h时，r¹不是-ch3或h；

并且其中r³、r⁴和r⁵独立地选自h、ch3、-ch2-ch3、-ch2-ch＝ch3和cnh2n+1，其中n＝3-10，优选n＝3-8。

“羟甲基”是指式-ome的基团，其中me表示甲基(-ch3)。

“醇钠(sodiumhydroxide)”是指式-ona的基团，其中na表示钠。

其中n＝3-10的cnh2n+1基团是指作为饱和、直链或支链脂族基团的“烷基”基团。它包括例如丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基基团。优选地，n为3-8或3-6。

一种特定的式(i)化合物，其中r¹是na、r²是p(o)(ona)2并且r³、r⁴和r⁵中的每一个都是h，在本文中也通常标识为“ip2”分子，或更具体地标识为“ip2-6na”或为8-(2-甲氧基-5-(5-氧化-4-氧代-7-(膦酰氧基)-4h-色烯-2-基)苯基)-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧化-4-氧代-4h-色烯-7-基磷酸酯钠：

另一种特定的式(i)化合物，其中r¹是h、r²是p(o)(ona)2并且r³、r⁴和r⁵中的每一个都是h，在本文中也通常标识为“ip2”分子，或更具体地标识为“ip2-6na”或为5-羟基-8-(5-(5-羟基-4-氧代-7-(膦酰氧基)-4h-色烯-2-基)-2-甲氧基苯基)-2-(4-甲氧基苯基)-4-氧代-4h-色烯-7-基磷酸酯钠：

式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)，及其立体异构体或其药学上可接受的盐，可有利地用作药物。

用在本文中时，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合于与对象的组织接触、或可施用于对象而相对于合理的效益/风险比没有过度的毒性或其他并发症的组合物、化合物、盐等。例如，药学上可接受的盐包括钠盐、钾盐、盐酸盐、铵盐、乙酸盐等。

发明人在此证明，式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)，可以有利地用作积极的抗癌免疫调节剂。

发明人考察了在人和小鼠癌细胞系中表达的ptp源性抗原模型的抗原呈递，并观察到在体外用异银杏黄素、更优选为ip2处理它们增加了该抗原的呈递。另外，他们还表明，用溶解在dmso中的所述异银杏黄素体内处理带有肉瘤的小鼠，以免疫依赖性方式减慢肿瘤生长。为了改善其效应，他们测试了可溶于水的异银杏黄素衍生物ip2并意外地观察到，它是远比异银杏黄素本身更有效的癌症生长抑制剂。由于在免疫缺陷的nu/nu小鼠中，所述天然产物和所述衍生物对肿瘤生长没有效应，因此他们得出结论，它们的效应取决于免疫应答。这些结果表明，可以调节ptp源性抗原的呈递，并且发明人为市场开发提供了一种新的有前景的分子：ip2剪接抑制剂或式(i)的化合物，其与异银杏黄素的其他衍生物相反，可用于提升抗癌应答和治疗癌症。

在本文所述的一个优选方面，式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)，用于在对象中治疗癌症、预防癌症转移和/或预防癌症复发。

在本文所述的另一个优选方面，式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)，用于在有需要的对象中刺激抗癌免疫应答。

在又一个优选方面，式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)，用于诱导或增加癌细胞呈递，通常是产生和呈递先驱翻译产物(ptp)源性抗原。

本发明的化合物可由技术人员通过公知的方法例如半合成或全合成来获得。用于产生式(i)化合物的方法的一个示例在本文的实验部分中描述，并在图5进一步示出(式(i)的化合物对应于图5的化合物“2”和“2’”)，其在本文中一般标识为“ip2”)。式(i)的化合物是本身在自然界中不能被发现的人造产物。

式(i)的化合物通常可以从双黄酮类异银杏黄素制备，双黄酮类异银杏黄素已被描述为mrna剪接的通用抑制剂并通常从银杏树——ginkobilobal.的叶子提取。提取异银杏黄素的方法尤其是在kang等人(1990)和在lee等人(1995)中描述，所述文献的公开内容通过引用并入本文。

式(i)的化合物也可以通过使用常规化学反应的化学合成来制备。

本发明的又一个目的是式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)(或其立体异构体或药学上可接受的盐)，在降低癌症或患有癌症的对象对于不同的抗癌剂、通常是不同的化疗剂的抗性中的用途。

本文还描述了根据本发明的式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)(或其立体异构体或药学上可接受的盐)，或包含这样的化合物和药学上可接受的载体的组合物，与至少一种不同的抗癌剂、通常是不同的化疗药物、和/或与放射疗法联合，用于在对象中治疗癌症、预防癌症转移和/或预防癌症复发。

术语“对象”是指任何对象，优选哺乳动物。

哺乳动物的实例包括人类和非人类动物，例如但不限于，驯养的动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、非人类灵长类动物(例如猴子)、兔子、和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。所述治疗优选用于有需要的人，不论其年龄或性别。

术语“对象”通常指示患者，特别是患有肿瘤的患者。除非本公开中另作说明，否则所述肿瘤是癌性或恶性肿瘤。在一个特定的方面，所述对象是正在经历癌症治疗例如化学疗法和/或放射疗法的对象，或处于癌症发展风险、或怀疑处于癌症发展风险中的对象。

所述对象是例如患有癌症并对癌症治疗、通常对化学疗法有抗性的人。

所述对象可以已经暴露于完整常规治疗方案的一部分，例如暴露于全部治疗方案的至少一个周期，例如全部治疗方案的两个周期。

所述癌症或肿瘤可以是任何种类的癌症或瘤形成。所述肿瘤通常是实体肿瘤，特别是上皮、神经外胚层或间充质来源的。所述癌症还通常选自上皮细胞癌(carcinoma)、肉瘤、淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、母细胞瘤、白血病和多发性骨髓瘤，优选地选自上皮细胞癌、肉瘤、母细胞瘤、淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。所述癌症可以是转移性癌症或不是。

所述癌症可以，例如，选自但不限于：慢性粒细胞性白血病，急性淋巴母细胞性白血病，费城染色体阳性急性淋巴母细胞性白血病(ph⁺all)，霍奇金氏病，霍奇金氏或非霍奇金淋巴瘤，鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，神经胶质瘤，胃肠癌，肾癌，卵巢癌，肝癌，结直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，前列腺癌，甲状腺癌，神经母细胞瘤，脑癌，中枢神经系统癌症，胰腺癌，多形性胶质母细胞瘤，宫颈癌，胃癌，膀胱癌，恶性肝细胞瘤，乳腺癌，结肠上皮细胞癌(coloncarcinoma)，头颈癌，胃癌，生殖细胞肿瘤，小儿肉瘤，横纹肌肉瘤，尤文氏肉瘤，骨肉瘤，软组织组织肉瘤，鼻窦nk/t细胞淋巴瘤，骨髓瘤，黑色素瘤，多发性骨髓瘤，急性粒细胞性白血病(aml)，和慢性淋巴细胞性白血病。

在一个优选实施方式中，所述癌症选自肺癌、乳腺癌、泌尿生殖癌(例如前列腺癌、膀胱癌、睾丸癌、宫颈癌或卵巢癌)和肉瘤(例如骨肉瘤或软组织肉瘤，包括小儿软组织肉瘤，神经母细胞瘤，骨髓瘤和黑色素瘤)。

更优选地，所述癌症选自黑色素瘤、肺癌(包括非小细胞肺癌(或nsclc)和小细胞肺癌(或sclc))和乳腺癌。

更加优选地，所述上皮细胞癌是黑色素瘤或肺癌。

在一个方面，所述癌症是肺癌，通常是小细胞肺癌或非小细胞肺癌。

在另一个方面，所述癌症是白血病，通常是急性粒细胞性白血病(aml)或慢性淋巴细胞性白血病。

在又一个方面，所述癌症是结肠癌，通常是结肠上皮细胞癌。所述癌症也可以是结直肠癌。

在又一个方面，所述癌症是小儿癌症，通常是小儿肉瘤、淋巴瘤、白血病、神经母细胞瘤、脑癌或中枢神经系统癌症。

在本文所述的一个特定方面，所述抗癌剂选自化疗剂、免疫检查点阻滞剂和抗癌疫苗(在本文中也标识为“癌症疫苗”)。这些药剂通常被认为是治疗癌症的“常规”药剂。

化疗剂通常是选自例如抗肿瘤/细胞毒性抗生素、烷化剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、基于铂(platin)的组分、特异性激酶抑制剂、激素、细胞因子、抗血管生成剂、抗体、dna甲基转移酶抑制剂和血管破坏剂。

所述抗肿瘤剂或细胞毒性抗生素可例如选自蒽环类(例如，阿霉素、柔红霉素、亚德里亚霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、戊柔比星)、放线菌素、博莱霉素、丝裂霉素c、普卡霉素和羟基脲)。

所述烷基化剂可例如选自二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、替莫唑胺、白消安、n-亚硝基-n-甲基脲(mnu)、卡莫司汀(bcnu)、洛莫司汀(ccnu)、司莫司汀(meccnu)、福莫司汀、链脲佐菌素、达卡巴嗪、米托唑胺、噻替派、丝裂霉素、地吖醌(azq)、丙卡巴肼、六甲三聚氰胺和尿嘧啶氮芥。

所述抗代谢物可例如选自嘧啶类似物(例如氟嘧啶类似物、5-氟尿嘧啶(5-fu)、氟尿苷(fudr)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)、吉西他滨卡培他滨)；嘌呤类似物(例如硫唑嘌呤、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁、克拉屈滨、氯法拉滨)；叶酸类似物(例如甲氨蝶呤、叶酸、培美曲塞、氨基蝶呤、雷替曲塞、甲氧苄啶、乙胺嘧啶)。

所述拓扑异构酶抑制剂可例如选自喜树碱，伊立替康、托泊替康、安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐和替尼泊苷。

所述有丝分裂抑制剂可例如选自紫杉烷类[紫杉醇(pg-紫杉醇和dha-紫杉醇)多西他赛拉洛他赛(larotaxel)、卡巴他赛、ortataxel、替司他赛(tesetaxel)或taxoprexin]；纺锤体毒物或长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛或长春氟宁)；甲苯达唑；和秋水仙碱。

所述基于铂的组分可例如选自铂(platinum)、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、沙铂(satraplatin)和四硝酸三铂triplatin。

所述特异性激酶抑制剂可例如选自braf激酶抑制剂，例如维罗非尼(vemurafenib)；mapk抑制剂(例如，达拉菲尼)；mek抑制剂(例如，曲美替尼)；和酪氨酸激酶抑制剂，例如伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、舒尼替尼或卡波替尼(carbozantinib)。

他莫昔芬，一种抗芳香化酶或一种抗雌激素药物，通常也可用于激素疗法的环境中。

在免疫疗法的背景下可用的细胞因子选自例如il-2(白介素-2)、il-11(白介素-11)、ifn(干扰素)α(ifna)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。

所述抗血管生成剂可选自例如贝伐珠单抗、索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼和依维莫司。

所述抗体，特别是单克隆抗体(mab)，可选自抗cd20抗体(抗泛b细胞抗原)，抗her2/neu(人表皮生长因子受体-2/neu)抗体；靶向癌细胞表面的抗体(例如利妥昔单抗和阿仑单抗)；靶向生长因子的抗体(例如贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗和曲妥珠单抗)；激动性抗体(例如抗icos抗体、抗ox40单抗、抗41bb单抗)；和免疫偶联物(例如90y-替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、131i-托西莫单抗(tositumomab)或ado-曲妥珠单抗美坦新)。

dna甲基转移酶抑制剂可例如选自2'-脱氧-5-氮胞苷(dac)、5-氮胞苷、5-氮杂-2'-脱氧胞苷、1-[β]-d-阿拉伯呋喃糖基-5-氮杂胞嘧啶和二氢-5-氮杂胞苷。

血管破坏剂可例如选自黄酮乙酸衍生物、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(dmxaa)和黄酮乙酸(faa)。

其他化疗药物包括蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、dna链断裂化合物(例如替拉扎明)、硫氧还蛋白还原酶的核糖核苷酸还原酶二者的抑制剂(例如xcytrin)和thl免疫应答的增强剂(例如胸腺法新)。

在一个优选实施方式中，所述化疗药物或药剂选自抗肿瘤/细胞毒性抗生素、烷化剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、基于铂的成分、特异性激酶抑制剂、抗血管生成剂、抗体和dna甲基转移酶抑制剂。

免疫检查点阻滞剂通常是靶向免疫检查点的抗体。这样的免疫检查点阻滞剂可有利地选自抗ctla4(伊匹单抗和替西木单抗)、抗pd-1(纳武单抗和派姆单抗(pembrolizumab))、抗pd-l1(阿特珠单抗、度伐鲁单抗和阿维单抗)、抗pd-l2和抗-tim3。

所述癌症疫苗可例如选自包含(抗原)肽、特别是ptp的疫苗组合物；人乳头瘤病毒(hpv)疫苗(如和)；刺激针对前列腺酸性磷酸酶(pap)的免疫应答的疫苗sipuleucel-t；溶瘤病毒；和talimogenelaherparepvec(t-vec或)。

在另一个特定方面，(“常规”)癌症治疗是辐射(在本文中也标识为“放射疗法”)。放射疗法通常涉及选自x射线(“xr”)、伽马射线和/或uvc射线的射线。

癌症学家根据要预防或治疗的具体癌症来选择可包括几种抗癌剂的治疗。

特定的黑色素瘤是常规用伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、ifnα、达卡巴嗪、braf抑制剂、达拉菲尼、曲美替尼、索拉非尼、替莫唑胺、电化学疗法、tnfα和/或福莫司汀治疗的黑色素瘤。

在一个特定实施方式中，所述黑色素瘤是对先前描述的细胞毒性常规疗法有抗性的黑色素瘤。

特定的乳腺癌是在切除乳腺肿瘤的手术步骤之前或之后，优选在这样的手术步骤之前，用蒽环类、紫杉烷、曲妥珠单抗、抗parp(聚(adp-核糖)聚合酶)、抗pi3k(磷酸肌醇3-激酶)、mtor(雷帕霉素的哺乳动物靶标)抑制剂、长春瑞滨、吉西他滨、抗雌激素和/或抗芳香化酶常规治疗的乳腺癌。

在一个特定实施方式中，所述乳腺癌是对先前描述的常规疗法有抗性的乳腺癌。

一种特定的肺癌是用xr与铂或培美曲塞(permetrexed)常规治疗的肺癌。

一种特定的早期nsclc是用紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、依托泊苷、紫杉烷、阿瓦斯汀[抗vegf(血管内皮生长因子)抗体]、厄洛替尼和/或吉非替尼常规治疗的nsclc。在一个特定实施方式中，所述肺癌对常规疗法有抗性。

本公开还涉及本发明的式(i)的化合物、优选“ip2”用于制备药物组合物或药物的用途，所述组合物能够在有需要的对象中通过刺激所述对象的免疫系统来治疗癌症或改善癌症疗法的效率。本发明的化合物特别可以有利地与至少一种前面所述的不同抗癌剂或任何其他治疗活性化合物、和/或与放射疗法联合，用于在对象中治疗癌症、预防癌症转移和/或预防癌症复发。

因此，本文还描述了一种组合物，其包含通常作为组合制剂的式(i)化合物、优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)和药学上可接受的载体，优选与至少一种不同的抗癌剂一起，供同时、分别或依次用于治疗所述癌症。

本文还描述了(i)预防或治疗癌症的方法，(ii)提高癌症对抗癌剂的敏感性的方法，和(iii)降低癌症对于抗癌剂的抗性的方法，每种所述方法均包括向有需要的对象施用有效量、通常是治疗有效量的至少一种式(i)的化合物，优选“ip2”化合物(ip2-6na或ip2-4na)，或上述定义的药物组合物，优选与传统上用于预防或治疗如本文所述的癌症的抗癌剂一起(作为组合制剂)。

在另一个特定方面，所述方法还包括施用有效量的另一种治疗活性化合物，用于预防或治疗癌症或癌症治疗副作用。

用于本文中时，“治疗”是指试图改变被治疗对象的自然病程的治疗性干预，并且可以出于预防(预防性)或治愈性目的而进行。希望的治疗效应包括但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理后果、降低疾病进展速度、改善或缓和疾病状态、以及缓解或改善预后。在优选的实施方式中，本发明的组合物和方法用于延迟癌症的发展或减慢癌症的进展，通常是肿瘤生长。

通常，所述治疗将诱导所述对象的免疫系统的治疗性应答，通常是cd4⁺和/或cd8⁺t细胞应答。

诱导t细胞应答在本文中通常是指引发针对某种抗原的t细胞应答。在所述诱导之前，所述t细胞反应不存在、或低于检测水平或不起作用。增强t细胞应答在本文中是指与所述增强之前针对某种抗原的t细胞的的总体作用相比，使所述t细胞的总体作用更高和/或更有效。例如，在所述增强之后，可以生成更多针对所述抗原的t细胞。结果，额外生成的t细胞的作用增加了针对所述抗原的总体作用。可替选地，所述增强可以包括增加t细胞针对所述抗原的作用。所述t细胞可以例如与所述抗原更强和/或更快速地反应。当然，所述增强的结果可以是生成额外的t细胞连同增加所述t细胞的作用。或者所述增强可以仅仅包含生成额外的t细胞或增加t细胞的作用。

本文所述的另一个目的涉及在对象中产生免疫应答的方法，所述免疫应答通常针对特异性靶标，优选肿瘤抗原或者癌症/肿瘤细胞或组织，所述方法包括向所述对象注射本发明的式(i)的化合物或包含通常为有效量的这样的化合物的本发明组合物。

治疗性免疫应答的检测可以由技术人员借助诸如elisa、elispot、迟发型超敏反应、细胞内细胞因子染色和/或细胞外细胞因子染色等技术轻松地确定。

用于本文中时，“有效量或剂量”或“治疗有效量或剂量”是指本发明的化合物的量，所述量在对象中预防、去除、减慢癌症或者减轻或延迟一种或几种由所述疾病引起或与所述疾病有关的症状或病症、或在对象中诱导可测量的免疫应答，所述对象优选是人。本发明的化合物及其药物组合物的有效量，更一般地是给药方案，可由本领域技术人员确定和调整。可以通过使用常规技术并通过观察在类似情况下获得的结果来确定有效剂量。本发明的化合物的治疗有效剂量将取决于要治疗或预防的疾病、其严重性、施用途径、涉及的任何联合疗法、患者的年龄、体重、一般医疗状况、病史等而变化。

通常，对人类患者而言，向患者施用的所述化合物的量可以范围从约0.01毫克/千克至500毫克/千克体重。在一个特定的实施方式中，本发明的药物组合物包含0.1mg/kg至100mg/kg的本发明化合物，例如0.5mg/kg至10mg/kg。

在一个特定的方面，本发明的化合物可以通过肠胃外途径、口服途径、或者静脉内(iv)、肿瘤内(it)或腹膜内(ip)注射施用于对象。本发明的化合物或纳米粒子可以在连续几天期间，例如在连续2至10天期间，优选连续3至6天，每天(一天1次)施用于对象。可以在1、2、3、4、5、6或7周期间、或者每两或三周或每个月、每两个月或每三个月重复所述治疗。或者，可以进行几个治疗周期，任选在两个治疗周期之间有中断期，例如1、2、3、4或5周。本发明的化合物可以，例如，每周一次、每两周一次或每月一次以单剂施用。所述治疗可每年重复治疗一次或几次。

剂量以本领域技术人员可以确定的适当间隔施用。选择的量将取决于多种因素，包括施用途径、施用期限、施用时间、所选的式(i)化合物或与所述化合物联合使用的各种产品的清除速率、患者的年龄、体重和身体状况以及他/她的病史、以及医学中已知的任何其他信息。

施用途径可以通过各种途径进行。例如，它可以是口服的或肠胃外的。它通常通过全身注射例如静脉内、肌内、腹膜内、肿瘤内、皮下注射等进行。所述药物组合物适应一种或几种上述途径。所述药物组合物优选通过注射或通过静脉内输注合适的无菌溶液或以液体或固体剂量的形式经由消化道施用。

药物组合物可以配制为在药物相容性溶剂或媒剂中的溶液，或配制为以本领域已知的方式含有固体媒剂的丸剂、片剂、胶囊剂、粉剂、栓剂等，有可能通过提供持续和/或延迟释放的剂型或装置。对于这种类型的制剂，有利地使用诸如纤维素、脂质、碳酸盐或淀粉之类的试剂。

可以用于所述制剂(液体和/或注射剂和/或固体)的试剂或媒剂是赋形剂或惰性媒剂，即药学上无活性的和无毒的媒剂。

可以提及，例如，与药学用途相容并且为本领域技术人员已知的盐水、生理、等渗和/或缓冲溶液。所述组合物可以含有一种或多种选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的试剂或媒剂。

适合于口服施用的本发明制剂可以是以离散单位的形式，如各含有预定量的所述活性成分的胶囊、小袋剂、片剂或锭剂；以粉末或颗粒的形式；以在水性液体或非水性液体中的溶液或悬液的形式；或以水包油乳液或油包水乳液的形式。

适合于肠胃外施用的制剂方便地包含所述活性成分的无菌油性或水性制剂，其优选与接受者的血液等渗。每个这样的制剂也可以含有其他药学上相容的且无毒的助剂，例如稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、染料、乳化剂或调味物质。

本发明的制剂包含活性成分，式(i)的化合物，优选“ip2”，与药学上可接受的载体并任选地与其他活性或治疗成分结合。所述载体在与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害的意义上必须是“可接受的”。安全有效地施用大多数这些抗癌剂的方法是本领域技术人员已知的。另外，它们的施用在标准文献中有描述。

本发明的另一个目的是一种试剂盒，其在不同的容器中包含至少一种本发明的式(i)的化合物，优选为“ip2”，和优选至少一种不同的抗癌剂，通常为化学治疗药物。所述试剂盒还可以包含用于制备本发明的组合物的说明书，用于实施任何一种本文所述的方法例如在对象中预防或治疗癌症、预防或治疗癌症转移和/或预防或治疗癌症复发的说明书。

在一个特定的实施方式中，本发明涉及本发明的试剂盒在制备如本文所述的组合物中的用途。

在另一个特定实施方式中，所述试剂盒适合于实施任何一种本文描述的方法，特别是在对象中治疗癌症、预防癌症转移和/或预防癌症复发的方法。

本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分和附图中公开，所述实验部分和附图应被认为仅仅是说明性的。

附图说明

图1：异银杏黄素处理增加癌细胞中内含子源性抗原的抗原呈递。

用2.5μm和6.25μm异银杏黄素处理(a)人黑色素瘤细胞系a375、(b)人肺癌细胞系a549、(c)正常肺成纤维细胞细胞系mrc5后的b3z特异性t细胞活化。(d)用6.25μm和15μm异银杏黄素处理小鼠黑色素瘤细胞系b16f10后的b3z特异性t细胞活化。(e)用15μm和25μm异银杏黄素处理小鼠肉瘤细胞系mca205后的b3z特异性t细胞活化。

图2：异银杏黄素处理增加癌细胞中内含子源性抗原的抗原呈递。

用6.25μm、15μm和25μm异银杏黄素处理预先用(a)珠蛋白-sl8-内含子构建体、(b)珠蛋白-sl8-外显子构建体、(c)卵清蛋白构建体转染的mca205细胞后的b3z特异性t细胞活化。用6.25μm、15μm和25μm异银杏黄素处理预先用(d)珠蛋白-sl8-内含子构建体、(e)珠蛋白-sl8-外显子构建体、(f)卵清蛋白构建体转染的b16f10细胞后的b3z特异性t细胞活化。数据以平均值±sem给出。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(未配对学生t检验)。

图3：异银杏黄素处理在体内减慢肿瘤生长。

(a)实验设置。(b)mca205珠蛋白-sl8-内含子细胞被皮下接种在小鼠侧肋。五天和十五天之后，腹膜内注射6mg/kg、12mg/kg或18mg/kg异银杏黄素。每3至4天评估肿瘤大小，直到第27天。每条线表示每组6只小鼠的以面积(mm²)计的肿瘤大小。数据以平均值±sem给出。*p<0.05(anova与tukey多重比较检验比较所有组)。

图4：异银杏黄素衍生物ip2在体外有效增加内含子源性抗原的mhci类呈递，并以免疫依赖性方式降低体内肿瘤生长。

用15μm、25μm和35μm(a)ip2或(b)im2p2、(c)产物10处理表达内含子源性sl8抗原的mca205细胞后的b3z特异性t细胞活化。(d)mca205珠蛋白-sl8-内含子细胞被皮下接种在c56bl/7小鼠侧肋。五天和十五天之后，腹膜内注射pbs或18mg/kg异银杏黄素、ip2或m2p2。每3至4天评估肿瘤大小，直到第27天。每条线表示每组6只小鼠的以面积(mm²)计的肿瘤大小。数据以平均值±sem给出。*p<0.05，**p<0.01(anova与tukey多重比较检验比较所有组)。(e)mca205珠蛋白-sl8-内含子被皮下接种在nu/nu裸鼠侧肋。五天和十五天之后，腹膜内注射pbs、18mg/kg异银杏黄素或ip2。每3至4天评估肿瘤大小，直到第27天。每条线表示每组6只小鼠的以面积(mm²)计的肿瘤大小。数据以平均值±sem给出。

图5：异银杏黄素衍生物的合成方案。

图6：异银杏黄素衍生物的合成方案。

图7：剪接抑制增加了癌细胞中外显子和内含子源性抗原mhc-1呈递。

与(a)人黑色素瘤a375、人肺癌a549或正常人肺成纤维细胞mrc5细胞系共同培养后的b3zsl8-特异性t细胞活化，这些细胞系全部瞬时表达内含子源性sl8肽和h2-k^b分子并用2.5μm或6.25μm异银杏黄素上游处理18小时；或与(b)小鼠肉瘤mca205或小鼠黑色素瘤b16f10细胞系共同培养后的b3zsl8-特异性t细胞活化，这两种细胞系均瞬时表达内含子源性sl8肽并用6.25μm、15μm或25μm异银杏黄素上游处理18小时。与mca205或b16f10细胞共同培养后的b3z活化，所述mca205或b16f10细胞均瞬时表达不需要剪接的(c)外显子源性sl8肽或(d)ovacdna构建体并用6.25μm、15μm或25μm异银杏黄素上游处理18小时。在每种条件下添加游离sl8肽，以确保在非饱和条件下进行t细胞测定，并在结果中考虑了mhc-1分子的表达。每个图都是代表至少四个独立实验的图。

数据以平均值±sem给出。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(未配对学生t检验)。

图8：h2-k^b分子在细胞表面的表达。

在用(a)异银杏黄素处理的mca205和b16f10细胞上的h2-k^b表达的流式细胞术分析。在用(b)异银杏黄素处理的a375、a549和mrc5细胞上瞬时表达的h2-k^b表达的流式细胞术分析。

图9：异银杏黄素剪接抑制剂以免疫依赖性方式降低携带内含子源性sl8的肿瘤的生长。

(a)实验设置。皮下接种在免疫感受态c57bl/6小鼠的侧肋的下列细胞的生长：(b)肉瘤mca205或(c)黑色素瘤b16f10细胞，二者都稳定表达珠蛋白-sl8-内含子构建体，或(d)mca205野生型(wt)或(e)b16f10wt细胞，所述小鼠在接种后第5、10和15天腹膜内注射12mg/kg或18mg/kg的异银杏黄素。每3至4天评估肿瘤大小，直到达到既定的伦理终点。每条线表示每组6只小鼠的以面积(mm²)计的肿瘤大小。皮下接种在免疫缺陷的nu/nu裸鼠侧肋的(f)mca205珠蛋白-sl8-内含子、(g)b16f10珠蛋白-sl8-内含子、(h)mca205wt或(i)b16f10wt肿瘤的以面积(mm²)计的大小，所述裸鼠在接种后第5、10和15天腹膜内注射18mg/kg的异银杏黄素。呈现的是达到终点的前一天的数据。

数据以平均值±sem给出。*p<0.05，**p<0.01(anova与tukey多重比较检验比较所有组。

图10：异银杏黄素衍生物ip2和m2p2(在本文中也标识为“im2p2”)的合成和活性。

(a)异银杏黄素、(b)ip2(ip2-6na和ip2-4na)以及(c)m2p2化合物的分子结构。(d)b16f10珠蛋白-sl8-内含子或(e)mca205珠蛋白-sl8-内含子用15μm异银杏黄素、35μmip2或35μmm2p2处理48小时。提取rna，并用扩增未剪接的(内含子)和剪接的(外显子)珠蛋白-sl8-内含子rna的引物进行qrt-pcr。数据以至少三个独立实验的2^-δδct内含子和2^-δδct外显子之比的平均值±sem给出。对用15μm或35μm的(f)ip2或(g)m2p2处理的mca205或b16f10细胞进行mtt测定。数据表示为至少三个独立实验的与对照条件比较的活细胞百分比的平均值±sem。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(未配对学生t检验)。

图11：ip2处理降低肿瘤生长并延长存活期。

与小鼠(a)肉瘤mca205或(b)黑色素瘤b16f10细胞系共同培养后的b3zsl8-特异性t细胞活化，这两种共同培养细胞系都瞬时表达内含子源性sl8肽，并且用15μm或35μm的ip2(左图)或m2p2(右图)上游处理。数据以平均值±sem给出。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(未配对学生t检验)。皮下接种在免疫感受态c57bl/6小鼠的侧肋的下列细胞的生长：(c)mca205(左图)或黑色素瘤b16f10细胞(右图)，二者都稳定表达珠蛋白-sl8-内含子构建体，或者(d)mca205wt(左图)或b16f10wt(右图)，所述小鼠在接种后第5、10和15天腹膜内注射18mg/kg的异银杏黄素、m2p2或ip2，或者24mg/kg或36mg/kg的ip2。每3至4天评估肿瘤大小，直到达到既定的伦理终点。每条线表示每组6只小鼠的以面积(mm²)计的肿瘤大小。数据以平均值±sem给出。*p<0.05，**p<0.01(anova与tukey多重比较检验比较所有组)。皮下接种在免疫感受态c57bl/6小鼠的侧肋的(e)mca205珠蛋白-sl8-内含子细胞的kaplanmeier图，所述小鼠腹膜内注射pbs或18mg/kg的异银杏黄素、m2p2或ip2。进行对数秩(mantel-cox)检验。

图12：ip2不影响细胞表面的h2-k^b分子表达并且不诱导凋亡

用ip2和m2p2处理的(a)mca205和(b)b16f10细胞上的h2-k^b表达的流式细胞术分析。(c)用35μm或1000μmip2处理18小时的早期、晚期和总凋亡mca205和b16f10细胞的流式细胞术分析。

图13：ip2治疗效应取决于免疫应答

皮下接种在免疫缺陷的nu/nu裸鼠侧肋的(a)mca205珠蛋白-sl8-内含子(左图)、mca205wt(右图)、(b)b16f10珠蛋白-sl8-内含子(左图)或b16f10wt(右图)的生长曲线，所述裸鼠在第5、10和15天腹膜内注射18、24或36mg/kg的ip2。皮下接种在免疫感受态小鼠的侧肋的(c，左图)mca205珠蛋白-sl8-内含子的生长曲线，所述小鼠在接种后第5、10和15天用pbs或24mg/kg的ip2处理以及每三天用体内抗cd8或同种型处理。每条线表示每组至少6只小鼠的以面积(mm²)计的肿瘤大小。c右图表示第27天的肿瘤大小。数据以平均值±sem给出。*p<0.05，**p<0.01(anova与tukey多重比较检验比较所有组)。(d)接种在100天无肿瘤c57bl/6小鼠中的mca205珠蛋白-sl8-内含子细胞或b16f10wt细胞的生长曲线，所述小鼠预先接种有mca205珠蛋白-sl8-内含子并用ip2(左图)或异银杏黄素(右图)处理。每条线表示每组至少4只小鼠的以面积(mm²)计的肿瘤大小。

图14：ip2处理降低已建立肿瘤的肿瘤生长

皮下接种在免疫感受态c57bl/6小鼠的侧肋上的稳定表达珠蛋白-sl8-内含子构建体的肉瘤15*10⁵mca205细胞的生长。让肿瘤在被分级之前进展10天并分配到等量肿瘤负荷的组。根据肿瘤大小分成三个六只小鼠的组，一组肿瘤大小为40mm²(正方形)，一组肿瘤大小为50mm²(三角形)，以及一组肿瘤大小为100mm²(圆形)。在第11天，所有小鼠腹膜内注射24mg/kg的ip2-4na。每3至4天重复该处理，共5次。平行地，每3至4天评估肿瘤大小，直至达到既定的伦理终点。每条线表示每组6只小鼠的以面积(mm²)计的肿瘤大小。

实施例

材料和方法

细胞培养

将mca205小鼠肉瘤细胞系在37℃和5％co2下在rpmi1640培养基(lifetechnologies)中在1％谷氨酰胺、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素和10％fbs(lifetechnologies)存在下，在标准条件下培养。将b16f10小鼠黑色素瘤细胞系、mrc5人成纤维细胞细胞系和a375人黑色素瘤细胞系在37℃和5％co2下在含有1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和10％fcs的dmem培养基(lifetechnologies)中在标准条件下培养。将a549人肺癌细胞系在37℃和5％co2下在dmem/f12+glutamaxi中在1％hepes、1％丙酮酸钠和10％fbs存在下，在标准条件下培养。将稳定的mca205-珠蛋白-sl8-内含子细胞系在与mca205细胞系相同的条件下培养，并添加2mg/mlg418(来自lifetechnologies的遗传霉素)用于选择。将稳定的b16f10-珠蛋白-sl8-内含子细胞系在与b16f10细胞系相同的条件下培养，并添加2mg/mlg418(来自lifetechnologies的遗传霉素)用于选择。将sl8/kb-特异性(b3z)t细胞报告杂交瘤在37℃和5％co2下在rpmi1640培养基(lifetechnologies)中在1％谷氨酰胺、0.1％β-半乳糖苷酶、1％青霉素/链霉素和10％fbs存在下，在标准条件下培养。

t-细胞测定

分别用转染试剂jetprime(ozyme)或genejuice(millipore)，根据各制造商的方案，用yfp-珠蛋白-sl8-内含子质粒或用pcdna3空质粒(阴性对照)转染mca205和b16f10小鼠细胞系。用编码小鼠h2-kb分子的质粒转染a375、a549和mrc5人细胞系12小时，然后用转染试剂jetprime(ozyme)根据制造商的方案，进行质粒yfp-珠蛋白-sl8-内含子的转染。转染后二十四小时，将细胞用不同剂量的异银杏黄素(merckmillipore)、ip2或im2p2(在本文中也标识为“m2p2”)处理过夜。然后将细胞用pbs1x洗涤三次并将5x10⁴个细胞与1x10⁵个b3z细胞共同培养。在阳性对照孔中，添加4μg/ml的合成肽sl8。然后将细胞在37℃与5％co2下温育过夜。将细胞以1200rpm离心5分钟，用pbs1x洗涤两次，并在4℃和振荡下用下列裂解缓冲液裂解5分钟：0.2％tritonx-100，0.2％dtt，0.5mk2hpo4，0.5mkh2po4。将裂解物以3000rpm离心10分钟，并将上清液转移至96孔optiplate微孔板(packardbioscience，randburg，sa)。添加含有33mm的甲基伞形β-d-吡喃半乳糖苷(mug)的显示缓冲液，并将该板在室温下温育3小时。最后，使用fluostaroptima(bmglabtechgmbh，offenburg，德国)测量β-半乳糖苷酶活性。结果表示为平均值±sem。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(未配对学生t检验)。

肿瘤激惹和处理

c57bl/6j雌性小鼠得自harlan。nu/nu裸鼠得自charlesriver。在7周龄时，小鼠在右侧肋用5x10⁴mca205-珠蛋白-sl8-内含子细胞或用4x10⁴b16f10-珠蛋白-sl8-内含子细胞与基质胶(vwr)一起皮下注射。激惹后五天，用pbs、异银杏黄素(merkmilllipore)、ip2或im2p2腹膜内处理小鼠。激惹后十五天，再次用相同的药物进行腹膜内处理。每3至4天记录一次肿瘤面积，直到第27天。所有动物实验均遵照法国和欧洲法律和法规进行。结果表示为平均值±sem.*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(anova与tukey多重比较检验比较所有组)。

结果

异银杏黄素处理增加癌细胞中内含子源性抗原的抗原呈递。

在最近的研究中，发明人已经表明，先驱翻译产物(“ptp”)是体外内源性mhci类途径的肽的主要来源。为了调节在癌细胞表面呈递ptp源性抗原，他们测试了异银杏黄素处理对黑色素瘤a375、肺癌a549和正常成纤维细胞肺mrc5细胞系的影响。为此目的，所有的所述细胞分别从β-珠蛋白基因构建体内的内含子瞬时表达mhci类k^b分子和sl8表位。如图1a、1b和1c所示，天然异银杏黄素化合物导致所测试的癌细胞系中内含子-ptp依赖性抗原呈递增加，并具有剂量依赖性效应。同样，对小鼠肿瘤细胞系，一种黑色素瘤(b16f10)和一种肉瘤(mca205)细胞系，也进行了相同的实验。这两种鼠细胞系均瞬时表达源自于β-珠蛋白基因构建体内的内含子的ptp-sl8表位。与先前在人类细胞系中的结果一致，异银杏黄素在小鼠细胞系中引起ptp依赖性抗原呈递增加，并具有剂量依赖性效应。这些结果表明，在异银杏黄素处理后，可以在癌细胞系中正向调节ptp抗原或ptp源性抗原的产生和呈递。它们支持以下假设：该分子可以用作正向免疫调节剂，以加强依赖于ptp产生和呈递的特异性抗肿瘤免疫应答。

在异银杏黄素处理后，需要剪接事件来有效增加癌细胞中外显子和内含子源性的抗原呈递。

异银杏黄素增加来自内含子编码区的sl8表位在细胞表面的呈递这一事实支持了以下观点：当剪接机制不配对时，pre-mrna是抗原呈递的来源。发明人于是推测，异银杏黄素也将引起来自外显子编码区而不是来自不需要剪接的cdna构建体的抗原表位的增加。为此，上述两种鼠细胞系均从β-珠蛋白基因构建体内的外显子瞬时表达ptp-sl8表位，或瞬时表达在其右侧(rightseeting)存在sl8表位的ovacdna。正如所料，天然异银杏黄素化合物引起被测癌细胞系中外显子和内含子-ptp依赖性抗原呈递增加，并具有剂量依赖性效应(图2a、2b、2d和2e)，而剪接抑制剂对由ovacdna构建体编码的sl8表位的产生没有效应(图2c和2f)。这些结果表明，异银杏黄素需要剪接才能充当癌细胞中ptp抗原或ptp源性抗原呈递的促进剂。

异银杏黄素处理在体内减慢肿瘤生长。

以上结果证明，与由外显子或内含子序列编码的ptp依赖性抗原的来源无关，异银杏黄素的天然产物能够在体外增加它们在被处理的肿瘤细胞系的细胞表面上的产生和呈递。下一个明显的问题是看看必须溶解在dmso中的异银杏黄素在体内是否可以对肿瘤生长和cd8⁺t细胞增殖具有相同的效应。为此，将小鼠皮下接种mca205肉瘤细胞，该肉瘤细胞稳定表达来自β-珠蛋白基因中内含子的siinfekl(sl8)表位(珠蛋白-内含子-sl8)。该接种后五天，给小鼠腹膜内注射确定剂量的异银杏黄素。然后，10天后再次注射相同剂量。在此期间，每两到三天监测肿瘤生长(图3a)。发明人观察到在用6和18mg/kg异银杏黄素处理的小鼠中，在激惹后第27天肿瘤生长显著降低50％(图3b)。为了评估对这种效应对免疫应答的需要，他们用与先前所述的相同设置，测试了18mg/kg异银杏黄素处理在免疫缺陷的nu/nu小鼠中的影响，并观察到它对肿瘤生长没有效应(图4d)。这些结果表明，异银杏黄素处理后的肿瘤大小减小需要在体内存在活跃的免疫应答。发明人接下来决定生成异银杏黄素的衍生物，以试图增加抗肿瘤应答。实际上，异银杏黄素不溶于水，只能溶于dmso溶剂中，致使其在腹膜腔内的药代动力学效率较低。

天然异银杏黄素产物的衍生化合物：合成方案。

为了在不使用毒性载体或共溶剂(dmso)下使异银杏黄素可用于更广泛的体内验证，认为有必要寻找提高其溶解度的策略。本发明的化合物是从商购异银杏黄素制备的，异银杏黄素是一种小的多酚分子，更常被称为双黄酮类，是从银杏树——ginkobilobal.的叶子中提取的。考虑到溶解在dmso中的天然产物可能在小鼠中不能很好地被吸收，发明人决定生成将会保持其功能的衍生化合物，这意味着具有比溶于共溶剂中的天然化合物更好的药代动力学的对抗癌细胞系的剪接体抑制剂和正向免疫调节剂。

方案1(图5)中描绘的ip2化合物(2和2’)的合成，是从异银杏黄素通过磷酸化，利用原位形成二乙基氯代亚磷酸酯以提供1而完成的。用碘代三甲基硅烷进一步裂解乙酯保护基，得到磷酸中间体，将其立即用氢氧化钠处理，以完成磷酸二钠前药2和2’的实际途径。发现2和2’的水溶性大大高于母体化合物异银杏黄素的水溶性。

如方案1所示完成im2p2——衍生物4的合成。使用碘甲烷将1的剩余两个苯酚基团烷基化，得到化合物3。该后者在与从1制备2和2’相似的条件下处理，产生磷酸二钠前药4，而它在碱性条件下的反应提供了化合物5。

从6开始以三个步骤合成前药8：c4位置的苯酚基团磷酸化，然后用三甲基碘硅烷裂解7的乙基基团，以及使所生成的磷酸与氢氧化钠在水中反应而获得磷酸钠前药8。

方案1(参见图5)：

在碱性条件下，用大量过量的碘甲烷(5当量)处理异银杏黄素，得到完全甲基化的化合物11[参见方案2(图6)]。使用3当量的mei产生三烷基化的产物9和10的混合物，它们容易通过柱色谱法分离。异银杏黄素与氯化吡啶鎓的反应使醚裂解并提供多酚化合物12。

方案2(参见图6)：

异银杏黄素衍生物ip2在体外有效增加内含子源性抗原的mhci类呈递，并在体内以免疫依赖性方式剧烈降低肿瘤生长。

为了测试新化合物作为对抗肿瘤细胞系的正向免疫调节剂，发明人首先决定在体外测定法中对其进行测试。两种衍生物2和/或2’，二者在本文中也都被标识为“ip2”，以及衍生物4，称为“im2p2”，都能够溶于水。用15μm、25μm或35μm的ip2处理瞬时表达源自于β-珠蛋白基因中内含子的ptp-sl8表位(珠蛋白-内含子-sl8)的mca205细胞后，发明人观察到ptp依赖性抗原呈递增加(图4a)。相反，用15μm、25μm和35μm的im2p2(图4b)或者产物或化合物10(图4c)处理表达发明人的ptp编码构建体的mca205细胞没有增加发明人的ptp源性抗原的呈递。然后，发明人决定体内考查这些衍生物在抗肿瘤生长和作为特异性抗肿瘤免疫应答诱导剂方面的效应。为此，将小鼠皮下接种mca205肉瘤细胞，该肉瘤细胞稳定表达来自β-珠蛋白基因中内含子位置的siinfekl(sl8)表位(珠蛋白-内含子-sl8)。然后，在该接种后5天，每组小鼠分别腹膜内接种18mg/kg的异银杏黄素、ip2或im2p2。十天后，再次注射相同剂量的每种化合物。在此期间，每两到三天监测肿瘤生长(图3a)。在用18mg/kg的ip2处理的小鼠组中，发明人观察到，与用18mg/kg的异银杏黄素处理的小鼠组相比，肿瘤生长急剧下降(图4d)。平行且相反地，用18mg/kg的im2p2处理的小鼠未出现任何肿瘤生长下降(图4d)。

为了证明肿瘤生长下降是由于以ptp依赖性方式的特异性抗肿瘤免疫应答所致，发明人考查了所述化合物在nu/nu无胸腺裸鼠中的效应。为此，将小鼠皮下接种mca205肉瘤细胞，该肉瘤细胞稳定表达来自β-珠蛋白基因中内含子位置的siinfekl(sl8)表位(珠蛋白-内含子-sl8)。然后，在该接种后5天，每组小鼠分别腹膜内接种18mg/kg的异银杏黄素、ip2和im2p2。然后10天后，再次注射相同剂量的每种化合物。在此期间，每两到三天监测肿瘤生长(图3a)。图4e显示，所用的任何化合物均在这些免疫缺陷小鼠中对肉瘤细胞系的肿瘤生长有效应，从而支持并进一步阐明了这样的事实，即作为剪接抑制剂的天然产物异黄酮的所选衍生物可以被视为抗癌的正向免疫调节剂并可以用作新的化疗治疗。

讨论

本发明首次证明了本文标识为ip2的产物对于抗肿瘤免疫应答并因此对于肿瘤的生长具有非常积极的效应。发明人确实证明了天然产物异银杏黄素的特定衍生物是体外和体内抗肿瘤免疫应答的有效刺激剂。表现出这种作用机制的小分子是前所未有的。发明人的数据在靶向分子疗法的框架内为新的抗癌应用开辟了道路。

pre-mrna剪接是所有哺乳动物细胞正常功能所需的必要机制。在最近几年，数项研究报告了各种癌症中与异常剪接活性有关的主要剪接体因子存在突变和过表达。几年前，发明人还提供了抑制剪接体增加mhci类ptp依赖性抗原呈递的一些证据。这些发现将重点放在剪接体作为抗癌治疗的潜在靶标上。已经报道了小分子抑制剪接体，特别是抑制剪接体因子sf3b1的功能。虽然这些小分子的确切机制尚不完全了解，但据报道，取决于所用的化合物，它们在癌症疗法中可以通过将肿瘤大小减小40至80％而生效。迄今为止，唯一一个经过人体测试的是e7107。它因为毒性问题已停用。已知该化合物通过与sf3b1相互作用来抑制剪接体。在该研究中，发明人提供了体外和体内证据，即通过使用本文所述的天然产物异银杏黄素的特定衍生化合物ip2来调节剪接体活性，可以诱导特异性抗肿瘤免疫应答。

代替考查这些不同化合物抑制剪接体的特定组分的效应，发明人决定考查已报道抑制剪接体复合体形成的另一类抑制剂。据报道，异银杏黄素干扰剪接体组装的早期步骤，并且还报道它是一种有效的肿瘤细胞浸润抑制剂。实际上，已经证明异银杏黄素抑制前剪接体的a复合体形成更大的催化前的剪接体b复合体。发明人证明，通过在体外和体内尽可能早地使用异银杏黄素的衍生物ip2抑制所述剪接体的形成，通过特异性诱导针对ptp依赖性表位的cd8⁺t细胞增殖而非常显著地增加抗肿瘤抗原呈递。发明人在此报道，ip2可用作抗癌、特别是对抗黑色素瘤和肉瘤的新化疗剂。

其他结果

剪接抑制增加了癌细胞中源自于内含子和外显子的抗原的呈递

癌细胞显示出不同的细胞内机制，这些机制可以塑造在它们表面的mhci类(mhc-1)分子上呈递的肽的库和量，导致它们的抗原性降低并逃脱t细胞识别。发明人已经表明，ptp是体外内源性mhc-1途径的主要肽来源。此外，他们通过用剪接抑制剂异银杏黄素处理hek细胞，提供了剪接抑制对ptp依赖性抗原呈递的正向影响的第一个证据。已报道异银杏黄素在剪接体组装的早期阶段抑制剪接体。为了改善癌细胞系的抗原性和免疫识别性，发明人确定异银杏黄素是否能够正向调节肿瘤相关ptp源性抗原(ta-ptp)在癌细胞表面的表达和呈递。为此，人黑色素瘤细胞系a375、人肺癌细胞系a549和正常人肺成纤维细胞细胞系mrc5从β-珠蛋白基因构建体(珠蛋白-sl8-内含子)内的内含子瞬时表达mhc-1h2-k^b分子和ptp-sl8表位，并将它们用不同浓度的异银杏黄素处理18h。为了不因处理后细胞表面的h2-k^b分子总体表达的调节而产生偏差，所有结果均基于在有或没有细胞外添加sl8肽下b3z活化的比率来表示。在这三种细胞类型中，用异银杏黄素处理以剂量依赖性方式增加了内含子源性sl8抗原呈递(图7a)。所用异银杏黄素的浓度对人细胞无毒，因为在处理后其活力显示为超过80％(表1)。

表1：异银杏黄素处理后人细胞系存活的百分比

对用2.5μm或6.25μm的异银杏黄素处理的a375、a549和mrc5细胞系的mtt测定。数据作为来自至少三个独立实验的细胞活力百分比的平均值±sem给出。

平行地，对瞬时表达珠蛋白-sl8-内含子构建体的小鼠黑色素瘤b16f10和肉瘤mca205细胞系进行了相同的实验。与先前的结果一致，异银杏黄素以剂量依赖性方式引起内含子源性sl8抗原呈递的增加(图7b)。有效剂量在这些细胞系中导致细胞活力超过50％(表2)。

表2：异银杏黄素处理后人细胞系存活的百分比

对用6.25μm、15μm或25μm的异银杏黄素处理的mca205和b16f10细胞系的mtt测定。数据作为来自至少三个独立实验的细胞活力百分比的平均值±sem给出。

为了进一步研究异黄素对ptp呈递的影响，这两种鼠肉瘤和黑色素瘤细胞系均从β-球蛋白基因构建体(珠蛋白-sl8-外显子)内的外显子瞬时表达ptp-sl8表位或瞬时表达ovacdna。在后一种构建体中，sl8表位处于正确的位置并且无需剪接。发明人观察到异银杏黄素增加mca205和b16f10癌细胞系中外显子源性sl8抗原呈递，并具有剂量依赖性效应(图7c)，而该剪接抑制剂对由ovacdna构建体编码的sl8表位的产生没有效应(图7d)。因此，异银杏黄素似乎需要剪接事件来影响ptp依赖性抗原呈递。这提示异银杏黄素的作用是在ptp生产步骤期间，而不是在更下游的mhc-1抗原呈递途径。结合这些结果，发明人表明，在用异银杏黄素处理的细胞系中，h2-k^b分子在细胞表面的表达受到不同的影响，即它在mca205中减少(图8a，左图)，在b16f10中增加(图8a，右图)，并且在人细胞系中稳定(图8b)。

总之，这些结果表明，天然产物异银杏黄素充当癌细胞中ptp源性抗原呈递的促进剂，这与所述表位的位置即在外显子或内含子序列中无关，并且与所测试的细胞系无关。这阐明了剪接事件对于癌细胞中mhc-1抗原的产生和呈递的重要性。最后，发明人的数据支持了当剪接机制不配对时pre-mrna是抗原呈递的来源的观点。

当表达内含子源性sl8表位时，异银杏黄素处理在体内减慢肿瘤生长，并且其作用依赖于免疫应答。

已经证明细胞表面的抗原丰度是决定cd8⁺t细胞应答幅度的关键参数并因此是决定免疫优势的关键参数(doherty等人，2006)。sl8肽已被广泛证明在体内是高度免疫原性的。考查sl8特异性t细胞的体外活化，发明人观察到剪接抑制后癌细胞表面的sl8表达丰度的变化。为了在体内检验这种假设，他们首先考查了异银杏黄素处理对表达所述内含子源性sl8肽的肿瘤的生长的影响。为此，将稳定表达珠蛋白-内含子-sl8构建体的mca205肉瘤细胞和b16f10黑色素瘤细胞两者皮下接种到小鼠中。在肿瘤接种后第5、10和15天，给小鼠腹膜内注射确定剂量的异银杏黄素，并监测肿瘤生长(图9a)。在荷载mca205珠蛋白-sl8-内含子(mca205gi)肿瘤的小鼠中，发明人观察到，当用12和18mg/kg的异银杏黄素处理后，在激惹后第27天肿瘤大小显著降低，超过50％(图9b)。异银杏黄素处理对b16f10珠蛋白-sl8-内含子(b16f10gi)肿瘤生长的影响低于对mca205gi的影响；然而所述药物仍显著减慢了肿瘤生长(图9c)。为了评估异银杏黄素处理后体内sl8过表达与肿瘤生长降低之间的联系，发明人对接种mca205或b16f10野生型(wt)细胞的小鼠进行了相同的实验。用12和18m/kg的异银杏黄素处理后，未观察到mca205wt(图9d)或b16f10wt(图9e)肿瘤生长的显著降低。这些结果提示，异银杏黄素影响体内肿瘤生长需要免疫优势表位、在本文中即sl8肽的表达。

然后，发明人评估了对于异银杏黄素降低肿瘤生长而言的免疫应答需求。将免疫缺陷的nu/nu裸鼠皮下接种稳定表达珠蛋白-内含子-sl8的mca205或b16f10细胞、或wt，并用与前述相同的设置进行处理(图9a)。没有观察到异银杏黄素处理对这四种肿瘤类型的生长的效应(图9f-i)。

总体而言，这些结果表明，异银杏黄素处理后肿瘤尺寸的减小需要体内存在活跃的免疫应答，并提示免疫优势表位表达的增加驱动了抗肿瘤免疫应答。

源自天然异银杏黄素的化合物衍生物(产物ip2和产物m2p2，后一个在上文也标识为“im2p2”)是水溶性的，抑制剪接，并且毒性较小。

合成了天然异银杏黄素产物的衍生物，并测试了它们在体外抑制剪接、增加ptp源性抗原的能力以及在体内降低肿瘤生长的能力。衍生物ip2(参见图10b上的ip2-6na和ip2-4na)和m2p2(图10c)从商购异银杏黄素合成(图10a)，异银杏黄素更通常称为双黄酮类，是从银杏树——ginkobilobal的叶子提取的。图5中提供了合成方案。简言之，ip2或化合物2和2’(如方案中所命名)的合成是通过异银杏黄素的磷酸化，利用原位形成二乙基氯代亚磷酸酯来提供化合物1而完成的。用碘代三甲基硅烷进一步裂解乙酯保护基，得到磷酸中间体，将其立即用氢氧化钠处理，以完成磷酸二钠前药的实际途径。为了合成m2p2分子，使用碘甲烷将1的剩余两个苯酚基团烷基化，得到化合物3。该后者在与从化合物1制备化合物2和2’相似的条件下处理，产生磷酸二钠前药4或m2p2，而它在碱性条件下的反应提供了化合物5。

发现ip2和m2p2的水溶性明显高于母体化合物异银杏黄素的水溶性(数据未显示)。另外，发明人测试了ip2和m2p2抑制mca205和b16f10细胞中珠蛋白-sl8-内含子基因产物的剪接的能力。有趣的是，ip2和m2p2在每个细胞系中提供了两种不同的剪接抑制模式。ip2处理增加了这两种细胞中存在的未剪接的rna产物，正如异银杏黄素处理的那样。相比之下，与ip2和异银杏黄素处理相比，m2p2处理不影响b16f10细胞中的剪接，而它对mca205中的剪接有强大的影响(图10d和10e)。因此，ip2和m2p2似乎显示出不同的抑制剪接的机制。重要的是，发明人观察到，对于所研究的基因产物，ip2的剪接模式类似于异银杏黄素。另外，已经显示出癌细胞可以，例如通过阻止肿瘤抑制基因的表达，而获取有益于其生长的在剪接机制中的缺陷。这些缺陷并非在所有肿瘤中都具有相同的性质，因此可以解释剪接抑制剂对不同肿瘤类型的不同效应。ip2和m2p2二者在测试剂量下均未在mca205和b16f10wt细胞中表现出毒性(图10f和10g)。总体而言，发明人已经首次提供并在本文中鉴定了两种新药，它们是水溶性的，并且可以在不影响细胞活力的剂量下在两种不同的模型细胞系中不同地影响剪接。

异银杏黄素衍生物ip2在体外有效增加内含子源性抗原的mhci类呈递、降低体内肿瘤生长并延长存活期。

为了测试ip2和m2p2化合物与异银杏黄素相比的潜在免疫调节效应，首先测试了这两种分子在体外增加ptp源性抗原的mhc-1呈递的能力。为此，mca205和b16f10细胞瞬时表达珠蛋白-内含子-sl8构建体，并用15μm或35μm的ip2或m2p2处理。虽然用ip2处理增加了mca205和b16f10细胞中的所述内含子-sl8源性抗原呈递，与异银杏黄素处理后发明人观察到的相似(图11a和b，左图)，但m2p2减少了mca205细胞中所述内含子-sl8源性抗原的呈递并且在b16f10细胞中对其没有影响(图11a和b右图)。有趣的是，这些结果与ip2和m2p2抑制珠蛋白-sl8-含子基因剪接的相应能力有关。实际上，m2p2对b16f10中的剪接和sl8抗原呈递都没有影响。相反，m2p2强烈抑制mca205中的剪接，并负面影响sl8呈递。结合这些结果，发明人表明，在用ip2和m2p2处理的所述细胞系中，h2-k^b分子在细胞表面的表达不受影响(图12a和12b)。因此，似乎可能是，为了处理能够正面影响内含子源性表位的呈递，需要严格的剪接调节。这些结果表明，异银杏黄素衍生物ip2在体外以与天然产物相同的方式充当ptp源性抗原呈递的促进剂。

然后测试ip2和m2p2分子在体内的抗肿瘤效应。如以前用异银杏黄素处理所进行的那样，将稳定表达珠蛋白-内含子-sl8构建体的mca205肉瘤细胞或b16f10黑色素瘤细胞、或wt皮下接种到小鼠中。在肿瘤接种后第5、10和15天，每组小鼠分别用18mkg的异银杏黄素、ip2或m2p2腹膜内处理。在该剂量下，用ip2处理后观察到与异银杏黄素处理相比mca205gi肿瘤生长显著降低，而未监测到m2p2处理的影响(图11c，左图)。此外，用18mg/kg的异银杏黄素或ip2处理后，b16f10gi肿瘤生长的降低相似，而m2p2对生长没有效应(图11c，右图)。由于ip2处理降低肿瘤生长并且是水溶性的，因此发明人决定增加小鼠的注射剂量。ip2剂量的增加在24mg/kg时并没有改善其对mca205gi的抗肿瘤效应，但在36mg/kg时它对b16f10gi的抗肿瘤效应增强(图11c)。引人注目的是，异银杏黄素和m2p2处理均不影响mca205wt或b16f10wt的肿瘤生长，而ip2处理减慢了这两种肿瘤的生长(图11d)。发明人证实，即使在高剂量下，ip2也不会诱导肿瘤细胞的凋亡(图12c)。最后，ip2处理显示出延长小鼠的存活期，在接种肿瘤后100天的存活者多于50％(图11e，下图)。同时，用异银杏黄素处理的小鼠中约有30％仍然活着(图11e，中图)。m2p2处理不影响存活期(图11e，上图)。

总体而言，这些结果证明了处理后在体外观察到的ptp源性抗原呈递增加和体内肿瘤生长降低之间的相关性。有趣的是，与异银杏黄素相反，ip2处理减慢了不带有源自ptp的高度免疫优势sl8表位的肿瘤的生长。发明人认为，剪接抑制剂ip2增强了驱动抗肿瘤应答的细胞表面处免疫优势表位的出现。

ip2处理功效依赖于免疫应答并产生持久的抗肿瘤应答。

为了确定ip2抗肿瘤功效对免疫系统、尤其是t细胞应答的需求，发明人考查了它在缺乏t细胞而不是b细胞和nk细胞的nu/nu无胸腺裸鼠中的效应。如先前用异银杏黄素进行的测试那样，将稳定表达珠蛋白-内含子-sl8构建体的mca205或b16f10细胞、或wt皮下接种到小鼠中。在肿瘤接种后第5、10和15天，将每组小鼠用在免疫感受态小鼠中观察到的最有效的ip2抗肿瘤生长剂量进行腹膜内处理。因此，分别用18mg/kg、24mg/kg和36mg/kg处理mca205gi、mca205wt和b16f10gi或wt荷载小鼠。在每种情况下，均未观察到ip2处理对肿瘤生长的影响(图13a和b)。

此外，为了评估ip2功效对cd8⁺t细胞的特殊需要，发明人测试了小鼠体内cd8⁺t细胞贫化的影响。将小鼠皮下接种mca205gi细胞，然后按计划用抗cd8⁺t细胞抗体或用同种型2a3处理。ip2处理如之前那样在第5、10和15天施行。有趣的是，抗cd8⁺t细胞抗体处理完全消除了ip2处理的抗肿瘤效应(图13c)。因此，该结果证实了ip2处理对肿瘤生长的效应依赖于cd8⁺t细胞应答，其支持了抗原驱动的对抗肿瘤细胞的细胞毒性活性。

最后，如上所述接种了mca205gi并随后用ip2处理的小鼠中约有50％在处理之后变得无肿瘤。首次肿瘤接种后100天，这些小鼠在右侧肋用mca205gi肿瘤细胞并在左侧肋用b16f10细胞再度激惹。尽管b16f10肿瘤随时间生长，但mca205gi在小鼠中却没有生长(图13d)。这些结果证明，在ip2处理后，小鼠发展出对mca205gi肿瘤特异性的长期抗肿瘤应答。

ip2(ip2-4na)处理降低已建立的肿瘤的肿瘤生长

为了评估通过提高特异性抗肿瘤cd8⁺t细胞的增殖来调节肿瘤生长的特异性ip2功效，发明人测试了ip2在体内对已建立的肿瘤的影响。皮下注射稳定表达所述珠蛋白-内含子-sl8构建体的mca205肉瘤肿瘤细胞(15.10⁵)，使其在分级前进展10天，并分配到等量肿瘤负荷组，导致在开始ip2处理之前形成肿瘤大小为40、50和100mm²的三个组。然后每3至4天，每组小鼠分别用24mg/kg的ip2腹膜内处理。在此剂量下，与未处理小鼠相比，用ip2处理后观察到mca205gi肿瘤生长明显降低(图14)，而与所测试的组无关。即使当肿瘤的大小已达到100mm²(圆圈)时，与未处理的小鼠(黑色圆圈)相比，5剂24mg/kg的ip2剂量仍能够诱导显著的肿瘤消退并且存活期增加约30天(灰色圆圈)。

总而言之，所有这些使用ip2作为免疫调节剂的实验均表明，当在很早期(当肿瘤刚可触知时)处理小鼠时，该分子通过诱导长期抗肿瘤应答来有效诱导完全的肿瘤排斥，并表明ip2处理也可以降低已建立的肿瘤的肿瘤生长。

总之，这些结果阐明了特异性剪接抑制剂、例如异银杏黄素和ip2正向调节抗肿瘤免疫应答的能力。此外，他们证实，ptp源性抗原在体内和体外由cd8⁺t细胞有效地呈递和识别，并且它们在细胞表面呈递的数量或性质的变化可引起cd8⁺t细胞的抗癌应答。

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序列表

<110>法国古士塔柏罗斯学院（institutgustaveroussy）

<120>用于治疗癌症的化合物、组合物及其用途

<130>b2614pc00

<160>1

<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列

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