专利名称:猪繁殖与呼吸综合征与猪圆环病毒重组腺病毒及疫苗的制作方法
一.技术领域：
本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒串联基因重组腺病毒及疫苗属于生物技术高科技领域，专用于加强猪对猪繁殖与呼吸综合征和2型猪圆环病毒的免疫保护作用及减少猪场的经济损失。
二、技术背景重组腺病毒基因工程技术在人类的基因治疗方面已经得到了较为广泛的应用，很多应用于人类基因治疗的重组腺病毒已经进入临床实验三期阶段。因为重组腺病毒具有宿主范围广，感染细胞种类多，可以表达人源和非人源蛋白，而且不会插入宿主染色体，回复突变率低，可以复制到很高的滴度等特点。而GP5蛋白是由猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的ORF5编码的大约25kD的糖蛋白，由其诱导的抗体具有中和活性。用杆状病毒表达的GP5蛋白可以对怀孕母猪提供50％的保护力，此外用杆状病毒表达的GP5、GP3免疫母猪产下的仔猪在断奶时PRRSV血清阴性。用巨细胞病毒启动子控制下的GP5质粒免疫动物后，在猪和小鼠体内产生抗GP5的特异性中和抗体。单克隆抗体试验证明针对GP5的单克隆抗体的中和活性要强于针对GP4的单克隆抗体，而且GP5蛋白可以诱导细胞凋亡。ORF2编码的核衣壳蛋白(Cap蛋白)，是PCV-2的主要结构蛋白，分子量28-36KD。PCV-2不同分离株Cap蛋白基因变异性较大，同源性仅为65％，这说明病毒的基因型是由Cap蛋白决定的[20]。多肽扫描(Pepscan)显示，PCV-1与PCV-2的Cap蛋白上存在共同的抗原决定簇，但血清学却显示它们的Cap蛋白没有抗原交叉性，即PCV-2的Cap蛋白的抗体(或抗原)不能与PCV-1的Cap蛋白(或抗体)发生反应。通过多肽扫描分析在Cap蛋白中已经鉴定出了几个型特异的表位。研究表明ORF2编码蛋白的免疫原性优于ORF1编码蛋白，能诱导产生较强的抗体反应，ORF2编码蛋白亚单位疫苗的免疫效果也优于该基因疫苗。现在在我国PRRS和PCV-2混合感染的比例在不断的增加，希望能够构建PRRS和PCV-2基因串联重组腺病毒，以期通过此双价苗达到一针防两病的目的。
发明内容
技术问题 本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和2型猪圆环病毒的重组腺病毒及疫苗，构建PRRS和PCV-2基因串联重组腺病毒，以期通过此双价苗达到一针防两病的目的，使在当前PRRS和PCV-2混合感染经常发生并且难以防制的情况下有新的突破。
技术方案 本发明的实施方案如下猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白和猪圆环病毒Cap蛋白基因串联重组腺病毒，其特征在于，猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒rAd-Cap-GP5在分类上属于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Human adenovirus)，该重组腺病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋白。该重组腺病毒已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。保藏日期2005年12月9日，保藏号为CGMCCNO.1559。
上述猪繁殖与呼吸综合征病毒和2型猪圆环病毒串联基因重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的(1)Cap基因的扩增、克隆以GenBank中PCV2-TJ(序列号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer Premier 5.0设计一对引物，在两条引物的5’端都加入KpnI酶切位点。引物15’TTC ggT ACC AgC TAT gAC gTATCC AAg 3’引物25’gCA ggTACC gTT AAg Tgg ggg gTC TTT 3’。该引物扩增基因片段大小为718bp。。
以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了PCV-2的Cap蛋白全基因。通过设计的酶切位点，把Cap基因克隆入质粒pShuttle-CMV-GP5(猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒和疫苗，发明专利公开号CN1554766A，
公开日20041215)中，然后通过酶切和PCR鉴定，获得含有GP5和Cap蛋白基因的穿梭载体pShuttle-Cap-GP5；(2)含有GP5和Cap蛋白基因的穿梭载体pShuttle-Cap-GP5与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组鉴定好的含有GP5和Cap蛋白基因的穿梭载体pShuttle-Cap-GP5经酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1(Qbiogene)通过电转化方法转化入大肠杆菌菌株BJ5183中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，实现了把外源基因转入腺病毒骨架载体，经50μg/ml卡那霉素筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒；(3)重组腺病毒的获得鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染HEK293-A细胞，重组腺病毒质粒在293细胞内包装成完整的重组腺病毒rAd-Cap-GP5。
用上述猪繁殖与呼吸综合征和2型猪圆环病毒串联基因重组腺病毒制成的疫苗将纯化的重组腺病毒在HEK293-A细胞上连续传代20次，检测猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因和PCV-2Cap蛋白基因的转录与表达情况，证明PRRSV GP5蛋白和PCV-2Cap蛋白表达稳定，重组腺病毒的毒价稳定在010TCID50/1.0ml。
在扩大培养过程中取用保存PRRSV和PCV-2的纯化重组腺病毒按104TCID50接种长成单层的HEK293-A细胞。当细胞病变达70-90％时收毒，经反复冻融一次即可获得PRRSV和PCV-2串联基因重组腺病毒疫苗。
有益效果本发明首次提出了用腺病毒载体构建PRRSV和PCV-2重组腺病毒，该重组腺病毒突破了PRRSV常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性和PCV-2没有疫苗可以防制的尴尬境地。该重组疫苗具有弱毒疫苗的复制特性和灭活疫苗的安全性，而且使PRRSV GP5蛋白和PCV-2的Cap蛋白获得了提前表达，改变了PRRSV和PCV-2感染猪后保护性抗体产生量少而且慢的特点。因为该重组腺病毒疫苗采用的是人腺病毒血清5型载体，对人、猪等动物没有致病性，容易通过安全性评价。
试验证明，本发明构建的PRRSV和PCV-2重组腺病毒对外源蛋白表达稳定，而且其效价稳定，种毒的毒价稳定在1010TCID50/ml。通过小鼠免疫试验和中和试验证明了该重组腺病毒产生了针对PRRSV和PCV-2的保护性抗体。
重组腺病毒对动物不致病，而且进入动物体内很少向外界排毒，因此其安全性高。利用该重组腺病毒免疫小鼠获得了针对PRRSV的特异性中和抗体和PCV-2的保护性抗体。因为该重组腺病毒既可以表达GP5蛋白也可以表达Cap蛋白，因此可以达到一针防两病的目的，节约了人力和物力。
四、
图1 PCV-2Cap蛋白基因克隆入已构建的质粒pShuttle-CMV-GP5载体示意图图2 pShuttle-Cap-GP5质粒与腺病毒的骨架载体的同源重组和获得重组腺病毒的示意图图3 pShuttle-Cap-GP5质粒的酶切和PCR鉴定图4 pAd-Cap-GP5重组质粒的PacI酶切鉴定图5 重组腺病毒rAd-Cap-GP5的Cap蛋白表达IPMA鉴定图6 重组腺病毒rAd-Cap-GP5的Cap蛋白表达IFA鉴定图7 重组腺病毒rAd-Cap-GP5的GP5蛋白表达IPMA鉴定图8 重组腺病毒rAd-Cap-GP5的GP5蛋白表达IFA鉴定五具体实施方式
(一)基因工程体-PRRSV和PCV重组腺病毒(rAd-Cap-GP5)的构建1重组质粒pShuttle-Cap-GP5的构建与鉴定1.1 Cap蛋白基因的扩增1.1.1引物以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件PrimerPremier 5.0设计一对引物，在两条引物的5’端都加入Kpn I酶切位点。引物15-TTCggT ACC AgC TAT gAC gTA TCC AAg-3，引物25-gCA ggT ACC gTT AAg Tgg ggg gTC TTT-3。该引物扩增基因片段大小为718bp。
1.1.2 DNA的提取将PCV2-PK15细胞培养物反复冻融三次后移入1.5ml的离心管中，12000转离心5min，取上清；加入等体积的氯仿，混匀，12000rpm离心10min，取上清，反复抽提三次；加入终浓度为50mg/ml的蛋白酶K和终浓度为1％的SDS，55℃作用至澄清；然后分别用等体积的酚、酚∶氯仿(1∶1)、氯仿抽提，取上清；加入10％体积的3M的乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃过夜或-70℃冷冻两小时；12000rpm离心20min，弃上清，干燥沉淀约5min，加入20-30μl的灭菌双蒸水溶解沉淀，-20℃冻存备用。
1.1.3 PCR反应体系为引物各1.0μl(浓度50pmol/l)25mMMgCl23.0μl；2.5m MdNTPs4.0μl；10×buffer 5.0μl；病毒DNA模板6.0μl；Taq酶1.5U；加灭菌双蒸水至50μl。循环参数95℃，预变性12min；再以95℃，40s、58℃，40s、72℃，1min、35次循环；最后72℃作用10min，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
1.1.4重组质粒Shuttle-Cap-6P5的构建和鉴定将Cap蛋白基因和重组质粒Shuttle-GP5用Kpn I酶切、去磷酸化后回收，T4连接酶连接，转化DH5α涂布卡那霉素抗性的LB平板，挑取疑似阳性克隆菌落，提取质粒，用PCR、Kpn I酶切和测序鉴定，命名为pShuttle-Cap-GP5。
1.2重组质粒pAd-Cap-GP5的构建和鉴定用Pme I酶切重组质粒pShuttle-Cap-GP5，使其线性化，然后与pAdEasy-1在25kV、25μF和200Ω条件下电转化至大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使Shuttle-Cap-GP5与pAdEasy-1发生同源重组，涂布卡那霉素抗性的LB平板，挑取疑似阳性克隆菌落，用PCR和Pac I酶切鉴定重组是否正确。
1.3转染按照脂质体转染试剂操作方法，将预先用Pac I线性化的重组质粒pAd-Cap-GP5转染HEK293-A细胞，5％CO2，37℃静置培养10天以上，显微镜观察有无病变。
1.4重组病毒的纯化采用有限稀释法纯化病毒。将重组腺病毒10倍倍比稀释后，接种已长满单层的HEK293-A(Qbiogene)细胞，5％CO2，37℃静置培养3天，挑选只有一个细胞病变的孔，反复冻融2次后，重复上述操作2次。
1.5重组病毒rAd-Cap-GP5蛋白表达的鉴定1.5.1 IFA将重组病毒rAd-Cap-GP5稀释后接种于长满HEK293-A单层细胞的96孔板，待细胞出现轻微病变后，弃去营养液，用PBS洗涤一次；37℃干燥45min，-20℃冷冻45min；每孔加入100μl冷的无水乙醇，4℃固定1h，PBST洗涤三次；在不同孔中分别加入1∶20稀释的PCV-2阳性血清和1∶50稀释的PRRSV阳性血清各100μl，并设定正常细胞作为对照，37℃孵育1.5h，PBST洗涤三次；每孔加入100μl 1∶100稀释的SPA-FITC，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；荧光显微镜观察。
1.5.2 IPMA按照上述方法固定正常和接种重组病毒的HEK293-A细胞，在不同孔中分别加入1∶20稀释的PCV-2阳性血清和1∶50稀释的PRRSV阳性血清各100μl，37℃孵育1.5h，PBST洗涤三次；每孔加入100μl 1∶100稀释的SPA-HRP，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；每孔加入50μl AEC溶液，室温作用约30min；弃去AEC，每孔加入50μl的0.05M的乙酸钠(PH5.0)；显微镜观察。
1.6稳定性试验1.6.1连续传代重组病毒的TCID50的测定用DMEM维持液将纯化后的第5、10、15和20代病毒作10倍梯度稀释，然后分别接种于长满HEK293-A细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种5个孔，每孔接种100μl。同时设定两排孔加入维持液做对照。5％CO2，37℃静置培养4天，观察病变，按Read-Muenels法，计算病毒TCID50。
1.6.2 PCR对外源基因的检测将传至25代的重组病毒反复冻融后，提取DNA后对目的基因进行PCR扩增。
1.6.3 IFA分别对第5、10、15和20代病毒蛋白的表达进行了鉴定，方法同1.6.1。
1.6.4 IPMA将纯化后的第5、10、15和20代病毒接种细胞后，按照1.6.2方法鉴定重组病毒表达蛋白的稳定性。
1.7小鼠免疫试验取40只体重为16～17g清洁级小白鼠，分成两组，每组20只，第一组为空白对照，第二组作为免疫试验组，皮下多点注射0.25μl(约2.5×1011TCID50)重组病毒，两周后加强免疫一次。在第二次免疫后的10、20、40天每组分别随机宰杀7只，收集血清测定抗体。
1.8间接ELISA参照Ph.Blanchard等方法。分别以Cap重组蛋白和PRRSV纯化全病毒包被酶标板，用0.15％BSA作封闭液；小鼠血清1∶50、1∶100…1∶12800倍比稀释，酶标记物为SPA-HRP(武汉博士德公司)，底物为OPD，最后用2M H2SO4终止反应，测定490nm的吸光度值(OD490)，并计算检测孔OD490/对照孔OD490比值(P/N)，P/N≥2.1的最高稀释度即为该血清的抗体滴度。
1.9半定量RT-PCR用Trizol(Invitrogen)从脾脏淋巴细胞中提取RNA，反转录后进行PCR扩增，以β-actin为持家基因，扩增IFN-γ和β-actin。引物序列分别为IFN-γ P15-TgC ATC TTggCT TTg CAg CTC TTC CTC ATg gC-3，IFN-γ P25-Tgg ACC TgT ggg TTg TTg ACC TCAAAC TTg g-3，β-actin P15-gTg ggC CgC TCT Agg CAC CAA-3，β-actin P25-CTCTTT gAT gTC ACg CAC gAT TTC-3。反应条件为95℃、5min；94℃、40s，55℃、40s，72℃、1min，30循环；72℃、10min。PCR产物经1％Agarose电泳，用Gdldoc-It ImagingSystem分析灰度，计算比值IODIFN-γ/IODβ-actin。
2结果2.1重组质粒pShuttle-Cap-GP5的构建与鉴定2.1.1 Cap蛋白基因的扩增PCR产物1％琼脂糖电泳，可见扩增有大小约为718bp左右的条带，并用编码Cap蛋白的基因ORF2序列中的EcoR I酶切位点鉴定该片段为目的片段。
2.1.2重组质粒Shuttle-Cap-GP5的鉴定将疑似阳性重组质粒1∶100稀释作PCR反应，分别扩增ORF2、ORF5和ORF2+ORF5基因片段，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，扩增片段与预计片段大小一致。Kpn I酶切重组质粒，可见切出有与ORF2片段大小一致的片段。测序分析结果显示，PCV-2的Cap蛋白和PRRSV的GP5蛋白的基因已成功克隆入穿梭载体中，并符合原阅读框。将该阳性重组质粒命名为pShuttle-Cap-GP5。
2.2重组质粒pAd-Cap-GP5的鉴定将疑似阳性重组质粒1∶100稀释作PCR反应，分别扩增ORF2、ORF5和ORF2+ORF5片段，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，扩增片段与预计片段大小一致。Pac I酶切重组质粒，1％琼脂糖凝胶电泳可见切出35kb和4.5kb的片段。将该阳性重组质粒命名为pAd-Cap-GP5。
2.3转染pAd-Cap-GP5质粒DNA经线性化转染细胞，第10天后经镜检可以观察到有部分细胞孔出现病变，第12天收毒。
2.4重组腺病毒rAd-Cap-GP5蛋白表达的鉴定2.4.1 Cap蛋白表达的鉴定在IPMA中，接种重组腺病毒的细胞用AEC染色后，整个细胞呈现红褐色，对照细胞只在细胞之间呈现较淡的红褐色。在IFA中，接种重组腺病毒的细胞染色后呈现明显的荧光，而对照正常细胞没有荧光。说明Cap蛋白在该重组病毒中获得了表达，并具有较好的抗原性。
2.4.2 GP5蛋白表达的鉴定与SPA-HRP孵育后用AEC染色后，大部分细胞被染成红褐色，对照细胞没有被染色。接种重组腺病毒的细胞与PRRSV阳性血清孵育，与SPA-FITC反应后在细胞中有明亮的荧光，对照细胞没有荧光。说明该重组病毒成功地表达了GP5蛋白，表达的GP5蛋白具有较好地抗原性。
2.5稳定性试验第5、10、15和20代重组病毒的TCID50分别为109.5，1011.9，109.7和1012.7。将它们接种细胞后进行IFA和IPMA，都能观察到有荧光的细胞和被染成红褐色的细胞，说明该病毒能一直稳定的表达Cap蛋白和GP5蛋白，具有较好的稳定性。
2.6间接ELISA宰杀后的小鼠血清以Cap重组蛋白和PRRSV纯化全病毒为抗原，测定PCV2和PRRSV的抗体，其结果如表1
2.7半定量RT-PCRPCR扩增后，分析PCR产物的灰度，计算其比值。说明了免疫组干扰素的表达水平高于对照组，说明了用重组腺病毒进行免疫能够刺激机体产生细胞免疫。结果如表2
用猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒制备疫苗，将纯化的重组腺病毒在HEK293-A细胞上连续传代30次，检测其猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因与PCV-2Cap蛋白基因的转录与表达情况，证明PRRSV GP5与PCV Cap蛋白表达稳定。重组腺病毒的毒价稳定在1010TCID50/1.0ml。
在扩大培养过程中取用纯化保存的PRRSV重组腺病毒按104TCID50接种长成单层的HEK293-A细胞。当细胞病变达70-90％时收毒，经反复冻融一次即可获得PRRSV重组腺病毒疫苗。
权利要求
1.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白和猪2型圆环病毒Cap蛋白基因串联重组腺病毒，其特征在于，猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒rAd-Cap-GP5在分类上属于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Human adenovirus)，该重组腺病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋白，该重组腺病毒已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2005年12月9日，保藏号为CGMCC NO.1559。
2.根据权利要求
1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白和猪圆环病毒Cap蛋白基因串联重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的(1)Cap基因的扩增、克隆以GenBank中序号为AY181946的PCV2-TJ毒株基因序列为模板，用软件Primer Premier 5.0设计一对引物，在两条引物的5’端都加入KpnI酶切位点；引物15’TTC ggT ACC AgC TAT gAC gTA TCC AAg 3’引物25’gCA ggTACC gTT AAg Tgg ggg gTC TTT 3’，该引物扩增基因片段大小为718bp；以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了PCV-2的Cap蛋白全基因，通过设计的酶切位点，把Cap基因克隆入已构建好的质粒pShuttle-CMV-GP5中，然后通过酶切和PCR鉴定，获得含有GP5和Cap蛋白基因的穿梭载体pShuttle-Cap-GP5；(2)含有GP5和Cap蛋白基因的穿梭载体pShuttle-Cap-GP5与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组鉴定好的含有GP5和Cap蛋白基因的穿梭载体pShuttle-Cap-GP5经PmeI酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1通过电转化方法转化入大肠杆菌菌株BJ5183中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，实现了把外源基因转入腺病毒骨架载体，经50μg/ml卡那霉素筛选获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒pAd-Cap-GP5；(3)重组腺病毒的获得鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染HEK293-A细胞，重组腺病毒质粒在293细胞内包装成完整的重组腺病毒rAd-Cap-GP5。
3.用权利要求
1或2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白和猪圆环病毒Cap蛋白基因串联重组腺病毒rAd-Cap-GP5制备的疫苗。
专利摘要
本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪2型圆环病毒(PCV－2)串联基因重组腺病毒及疫苗属于高新生物技术领域：
。通过PCR技术把Cap蛋白基因按照开放式阅读框规则克隆入质粒载体pShuttle－CMV－GP5中，与骨架载体pAdEasy－1共转化大肠杆菌BJ5183菌株获得重组质粒，用重组质粒转染HEK293－A细胞获得了重组腺病毒并进行了纯化，证明构建成功表达了PRRSV GP5蛋白和PCV－2 Cap蛋白的重组腺病毒rAd－Cap－GP5。在该重组毒中可以使蛋白表达提前和表达量提高，能更有效的刺激机体对这两种病的免疫保护反应。这种重组腺病毒疫苗具有亚单位疫苗的安全性和能够采取多种免疫方式，能够刺激机体全方位的免疫应答，从而具有广泛的开发和应用前景。
文档编号C12N15/33GKCN1800375SQ200510022550
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月23日
发明者姜平, 王先炜, 李玉峰 申请人:南京农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan