达载体pCAM-PRP2p-1062中，GmPRP2p-1062启动子位于⑶S基因上游， 驱动⑶S基因的转录，同时在⑶S基因下游连接有终止其转录的NOS终止子。
[0060] 实施例3、转GmPRP2p-1062拟南芥的获得及表达特性研究
[0061] 一、浸花法转化拟南芥及鉴定
[0062] YEP液体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：5g/L NaCl，5g/L酵母提取物， l〇g/L胰蛋白胨；pH7. 0。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度。
[0063] 1/2MS固体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：2. 17g/L MS盐（Phyto Tech，目 录号：M524)、7g/L琼脂、30g/L蔗糖，lml/L MS有机（Phyto Tech,目录号：Μ533)，ρΗ5·8。各 浓度为相应组分在培养基中的终浓度。
[0064] 1、用实施例2获得的重组质粒pCAM-PRP2p-1062,以及pC13Pl空载体分别转化根 癌农杆菌GV3101感受态细胞，得到2种重组农杆菌。将2种重组农杆菌分别接种于YEP液 体培养基(含卡那霉素50mg/L)，28°C、220rmp振荡培养，得到0D600=0. 4-0. 6的2种重组农 杆菌菌液。
[0065] 2、将pC13 (Delta)⑶S载体(质粒图谱如图5所示）转化根癌农杆菌GV3101感 受态细胞，得到重组农杆菌。将重组农杆菌接种于YEP液体培养基(含卡那霉素50mg/L)， 28°C、220rmp振荡培养，得到0D600=0. 4-0. 6的重组农杆菌菌液。
[0066] 3、将步骤1得到的2种重组农杆菌菌液分别与步骤2中的重组农杆菌菌液按体积 比1:1混合，加入0. 5% (v/v) silwet L-77,共得到2种农杆菌混合液，用来浸染植株。
[0067] 4、浸染植株的准备：将拟南芥（Arabidopsis thaliana (L. )Heynh. )Columbia 的 种子在10%(v/v)次氯酸钠的水溶液中消毒15min，用无菌水洗3-4次后，将种子种于1/2MS 固体培养基上，4°C培养3d后，置于22°C培养箱中培养，光照16h/黑暗8h。生长2周的植 株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，生长到开花期的拟南芥用来浸染。
[0068] 5、浸染：将上述步骤4中生长到花期的拟南芥植株在步骤3中制备好的2种农杆 菌混合液中浸泡lmin，浸染后的植株遮光过夜，浸染第二天后，恢复正常培养，一周后采用 同样方法对植株进行第二次浸染。直至收获T1代种子。
[0069] 6、将收获的T1代种子消毒后，种植于含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上，4°C培养 3d后，置于22°C培养箱中培养，光照16h/黑暗8h，筛选出能够正常生长的植株，将生长2周 的植株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，收获T2代种子。同时提取T1代植株的基因 组DNA，进行PCR检测。具体如下：以基因组DNA为模板，对于转入pCAM-PRP2p-1062的抗 性转基因拟南芥，采用引物对F-1062/R2进行PCR检测，得到大小约为1062bp目的条带(序 列2)的拟南芥为阳性。同时设置以未转基因的拟南芥基因组DNA代替模板的阴性对照，以 及以对应质粒代替模板的阳性对照。PCR检测结果如图6所示。
[0070] 7、检测出目的条带的株系，其T2代种子采用步骤6中同样的方法种植培养，收获 T3种子，选择T3代不再分离的纯合株系的种子用来后续的试验。
[0071] 二、转GmPRP2p-1062拟南芥表达特性的研究
[0072] 1、营养生长阶段不同发育时期的组织表达特性
[0073] 取生长1(1、3(1、5(1、7(1、10(1、20(1的1'3代转基因拟南芥植株进行^3组织染色。同 时以未转基因的野生型拟南芥Columbia和转入pC13Pl空载体的拟南芥植株作为对照。实 验重复三次。
[0074] ⑶S组织化学染色参照Jefferson的方法。具体如下：将待染色的组织样品放入 检测液中，37°C温育12-16h。70%，90%乙醇分别浸泡2h后，70%乙醇过夜，以除去绿色组织 中的叶绿素。显微镜下或用肉眼观察供试样品的染色结果，并照相。白色背景下的蓝色即 为⑶S表达位点。其中，检测液配方如下 ：50mmol吨4磷酸缓冲液(配方：4.095g Na2HPOJP 2. 537g NaH2PO4 定容到 IL 水溶液中），ρΗ7· 0, IOmmol .L-1EDTAjO. 1% (w/v) Triton X-100， 2mmol · I71铁氰化钾，2mmol · I71亚铁氰化钾，5% (w/v)X-Gluc。各浓度为相应组分在检 测液中的终浓度。
[0075] 结果如图7所示，从图中可以看出，在转GmPRP2p-1062拟南芥植株中，从种子萌发 开始，在其不同生长时期，在根和下胚轴中检测到GUS基因的表达活性，在叶片中几乎没有 检测到。而作为对照的未转基因的野生型拟南芥Columbia和转入pC13Pl空载体的拟南芥 植株均无⑶S表达。三次重复实验结果一致。
[0076] 2、生殖生长阶段的组织表达特性
[0077] 将生长2周的T3转基因拟南芥植株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，在开 花结荚期对其各组织器官（叶、花、果）进行GUS组织染色，方法同步骤1。同时以未转基因 的野生型拟南芥Columbia和转入pC13Pl空载体的拟南芥植株作为对照。实验重复三次。
[0078] 结果如图8所示，在生殖生长时期，转GmPRP2p-1062的拟南芥的叶柄和果荚外壳 的基部有检测到少量的GUS表达活性。而作为对照的未转基因的野生型拟南芥Columbia 和转入PC13P1空载体的拟南芥植株均无⑶S表达。三次重复实验结果一致。
[0079] 3、⑶S活性的测定
[0080] 分别取生长20d的转基因拟南芥植株的根和叶，转基因植株取3个株系，测定根和 叶中的⑶S活性。同时以未转基因的野生型拟南芥Columbia (记为WT)和转入PC13P1空 载体的拟南芥植株作为对照。具体如下：
[0081] (1)4-甲基伞形酮（4-MU)标准曲线的制作
[0082] 4-甲基伞形酮（4-MU)标准品溶液的配制：用0. 2M Na2CO3水溶液分别配制不同 浓度的 4-MU 标准品溶液，lmM4-MU、10 μ M4-MU、1 μ M4-MU、100nM4-MU、50nM4-MU、10nM4-MU、 5nM4-MU。其中，4-MU标准品为sigma公司产品，目录号为M1381。测定在激发光365nm，发 射光455nm下的荧光光度值。根据4-MU标准品的浓度及对应荧光光度值绘制标准曲线。
[0083] (2)待测样品的制备
[0084] 将取好的根和叶分别放入研钵中（预冷)，用Iml的GUS提取液研磨成匀浆，转入 1. 5ml的离心管中，ISOOOrpnufC，离心IOmin,收集上清液，得到待测样品，用于检测。
[0085] 其中，⑶S提取液配方如下：50mM磷酸缓冲液(配方：4. 095g Na2HPO4和 2. 537gNaH2P04 定容到 IL 水溶液中），ρΗ7· 0, IOmM Na2-EDTA，pH8. 0, ΙΟπιΜβ -巯基乙醇，0· 1% (w/v) Triton Χ-100。各浓度为相应组分在⑶S提取液中的终浓度。
[0086] (3)⑶S活性测定
[0087] A. GUS 反应
[0088] GUS反应液：4. 08g4_ 甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醒酸苷（4-Methylumbellifery_i3 -D-Glucuronide简称4-MUG)定容到IOml⑶S提取液中，用来进行酶促反应。其中，4-MUG 为INALCO公司产品，目录号为1758-1630。
[0089] ⑶S终止反应液：0. 2M Na2CO3水溶液，用来终止反应。
[0090] 反应过程：将90μ 1的⑶S反应液加入I. 5ml的离心管中，37°C预热，加入10μ 1 上述步骤（1)中提取好的上清液，37°C反应60min后，加入900μ 1的⑶S终止反应液。同 时，每一个样品有Omin反应的对照，测定365nm/455nm荧光光度值。根据所测荧光光度值 及步骤（1)得到的4-甲基伞形酮（4-MU)标准曲线，计算得到的"单位时间的4-MU浓度变 化"。
[0091] B.蛋白含量测定
[0092] 取上述待测样品（提取好的上清液）10 μ 1，加入200 μ 1考马斯亮蓝，室温反应 15min，在酶标仪上测定595nm的吸光值。
[0093] 牛血清蛋白（BSA)标准溶液（lmg/ml)由Bradford蛋白质定量试剂盒提供 (TIANGEN，目录号 PA102)。分别取 0、0· 5、1· 5、2· 5、3· 5、4· 5、5· 5、6· 5μ I BSA 标准溶液，每 个标准样用〇. 15Μ NaCl水溶液定容到10 μ 1，加入200 μ 1考马斯亮蓝，室温反应15min，在 酶标仪上测定595nm的吸光值。根据标准样品的浓度换算上述待测样品(提取好的上清液） 中的蛋白含量。
[0094] C.⑶S活性计算
[0095] 根据A和B的检测结果，计算待测样品的⑶S活性，用"nmol/min/mg蛋白"表示。 具体而言，用"单位时间的4-MU浓度变化"除以"待测样品中的蛋白含量"，求出单位质量的 蛋白单位时间的4-MU浓度变化，即为单位时间内的GUS活性。
[0096] 实验重复三次，结果取平均值。
[0097] 结果如图9,在所有转GmPRP2p-1062拟南芥植株中，在根中的⑶S表达活性显著高 于叶中。而作为对照的未转基因的野生型拟南芥Columbia (WT)和转入pC13Pl空载体的 拟南芥植株的根和叶中均无⑶S表达。
【主权项】
1. DNA分子，是下述a)-C)中任一的DNA片段： a) 序列表中序列2所示的DNA片段； b) 与a)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段； c) 在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
2. 含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3. 根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pC13Pl载体的多 克隆位点处插入含有权利要求1所述DNA分子的DNA片段后得到的重组质粒。
4. 根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的所述 DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以 功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。
5. 权利要求1所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述表达为根特异性表达。
7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植 物。
8. 根据权利要求7所述的应用，所述双子叶植物为拟南芥或大豆。
9. 扩增权利要求1所述DNA分子的引物对。
【专利摘要】本发明公开了一种来源于大豆的根特异性启动子GmPRP2p-1062及其应用。本发明所提供的启动子为如下中的至少一种：a）序列表中序列2所示的DNA片段；b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。本发明所提供的启动子能够有效启动目的基因在根中的特异性表达。本发明为植物在根部的分子改良提供了一种手段，对植株的抗逆研究就有一定意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-84, C12N1-21, C12N15-11, C12N15-113
【公开号】CN104560984
【申请号】CN201310466910
【发明人】侯文胜, 陈莉, 韩天富, 蒋炳军, 孙 石, 吴存祥
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月9日