重组低毒力1型牛疱疹病毒(BoHV-1)疫苗载体的制作方法
【专利说明】重组低毒力1型牛疱疹病毒（BoHV-1)疫苗载体
[0001] 申请数据
[0002] 本申请相关于并要求于2011年7月5日提交的题为"Avaccine"的澳大利亚临 时专利申请No. 2011902660的优先权，该临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容教导一般属于牛科动物（bovineanimals)的疫苗接种和疾病控制 领域。提供了疫苗载体来有效控制一种或更多种牛病原体（例如牛呼吸道疾病综合症 (bovinerespiratorydiseasecomplex)相关的那些牛病原体）并且改善了由此引起的疾 病病症。本文还包括用于管理受限或成群牛科动物的方案。
【背景技术】
[0004] 作者在本说明书中引用的出版物文献目录细节按字母顺序汇总于说明书的结尾 处。
[0005] 本说明书中对任何现有技术的引用不是也不应被认为是承认或以任何形式提示 该现有技术构成任何国家的公知常识的一部分。
[0006] 牛呼吸道疾病综合症（BRDC)为澳大利亚饲育牛（feedlotcattle)最显著的传染 性疾病。BRDC因为发病率、死亡率、饲料资源的损耗、药物购买、增加的饲养时间和相关劳动 力成本而造成经济损失。BRDC的病因复杂，原因在于至少四种病毒类和三种细菌类以及使 动物易患疾病的环境条件。
[0007] 与BRDC相关的四种病毒是1型牛痕疼病毒（bovineherpesvirus1，BoHV-1)、 牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheavirus，BVDV或牛痕病毒（bovine pestivirus))、3型牛副流感病毒（bovineparainfluenza3)和牛呼吸道合胞体病毒 (bovinerespiratorysyncytialvirus)。血清学研宄已经表明，所有这些病毒都会感染 澳大利亚饲育牛。BRDC中还涉及到多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamutocida)、溶血性曼氏 杆菌（Manhiemiahaemolytica)和睡眠嗜血菌（Haemophilussomnus)这三种细菌菌种。
[0008] 在北美洲和欧洲，使用活疫苗和灭活疫苗两者来控制由BoHV-1引起的疾病。这些 疫苗基于与澳大利亚所见的BoHV-1基因型不同的BoHV-1基因型。北美洲和欧洲BoHV-1 毒株通常被归入亚群1. 1而澳大利亚毒株构成亚群1. 2。与BoHV-1. 2病毒相比，BoHV-1. 1 病毒导致更严重的临床疾病。尚不知晓该表型差异的准确分子机制。
[0009] BoHV-1是疱瘆病毒（Herpesviridae)科的病毒，其在世界范围导致牛的多种疾 病，包括鼻气管炎、阴道炎、阴茎头包皮炎、流产、结膜炎和肠炎。BoHV-1还是航运热的影响 因素。其通过性接触、人工授精和空气传染（aerosoltransmission)传播。如同其他疱瘆 病毒一样，BoHV-1导致终生潜伏性感染并且释放病毒。坐骨神经和三叉神经为潜伏部位。
[0010] 由BoHV-1引起的呼吸道疾病通常被称为传染性牛鼻气管炎。症状包括发热、鼻流 出物（dischargefromthenose)、咳嗽、呼吸困难和食欲丧失。口和鼻中通常发生溃疡。 死亡率可达到10%。生殖器疾病导致母牛传染性脓疱性外阴阴道炎和公牛传染性阴茎头包 皮炎。症状包括发热、抑郁、食欲丧失、排尿疼痛、母牛阴门肿胀并伴有脓疱和流出物并且在 与公牛性接触时疼痛。在这两种情况下，病变通常在两周内消退。在感染后一至三个月可 能发生流产和死产。BoHV-1还导致新生小牛的全身性疾病，特征为肠炎和死亡。
[0011] 类似地，BVDV是降低牛的繁殖力并提高其死亡率的疾病。其由来自黄病毒科 (Flaviviridae)的瘟病毒引起。瘟病毒能够在妊娠期间建立持续的感染。持续感染瘟病毒 通常不易被察觉。BVDV还常常进行非同源RNA重组，这导致出现了使宿主致死的在遗传上 独特的病毒。
[0012] 粘膜糜烂与以急性形式的牛病毒性腹泻发生的腹泻的临床体征（clinicalsign) 对那些被感染的动物有显著影响，但是被持续感染的动物的代价更大。通常，这样的动物不 能实现其遗传潜力，其表现出体重增加减少，疾病易感性增加以及生育率降低。它们释放病 毒，从而导致群体中未免疫动物丧失生殖力。
[0013] 暴露于致细胞病变的BVDV变体的母牛（45至125天妊娠）通常将流产。更早暴 露于任一变体导致早期胚胎死亡。暴露天数在妊娠125至175天之间会导致出生缺陷（例 如视觉缺陷和脑积水）并且暴露超过175天通常将导致小牛在出生时被完全免疫。
[0014] 因此，由于BRDC的严重性及其对畜牧业的显著影响，需要改进疫苗接种。与灭活 病毒相比，减毒病毒提供更好的保护，原因是减毒病毒向宿主的免疫系统呈递更多的病毒 抗原。减毒病毒的另一个重要优点是其施用于鼻内的潜力，即在感染后野生型病毒的第一 繁殖部位。
[0015] 长期以来已经认识到BVDV的抗原变异性使得很难确定针对何种病毒来进行疫苗 接种。可采用两种方法来进行BVDV特异性疫苗接种。一种是对防止靶病毒感染细胞的中 和抗体的诱导。第二种是诱导靶向破坏被病毒感染细胞的细胞介导免疫（CMI)，由此降低病 毒感染作用。BVDV的主要中和表位是结构糖蛋白，并且由于免疫选择，这些蛋白质的变异性 也最大。因此，设计基于糖蛋白的疫苗需要包含最常见的抗原类型。BVDV的非结构蛋白通 常更加保守，原因是其特定酶功能限制了蛋白质序列可能发生的变化。
[0016] 对于合适的BRDC控制项目而言，有必要具有可与野生型病毒相区分的有效且安 全的疫苗。此前使用BoHV-1开发的疫苗被构建为缺失糖蛋白和/或包含胸苷激酶缺失突 变体。这些疫苗还存在一些问题，如胸苷激酶基因参与病毒复制并且复制越少可造成保护 越小，原因是参与产生体液免疫的糖蛋白的水平较低。
[0017] 需要开发能够控制BRDC和与此相关的特定病原体之改进的并且更有效的疫苗。
【发明内容】
[0018] 通过序列标识符（SEQIDNO)引用核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNO以数字对应 序列标识符<400>1(SEQIDN0:1)、〈400>2(SEQIDN0:2)等。表1提供了序列标识符总 览。在权利要求书之后提供了序列表。
[0019] 牛呼吸道疾病综合症（BRDC)是牛科动物（尤其是饲养在受限环境例如饲养场和 乳制品厂中的那些）的一种显著疾病风险。被BRDC相关病原体感染可迅速传播并且可导致 显著的发病率、死亡率以及降低的繁殖力。本文中教导了改进的疫苗载体，其包含被修饰为 携载编码牛病原体中的一个或更多个抗原之遗传物质的来自BoHV-1低毒力（virulence) 毒株的基因组。
[0020] 因此，本文的疫苗能够针对至少一种来自牛病原体的抗原，所述疫苗包含来自低 毒力BoHV-1的1型牛疱瘆病毒（BoHV-1)基因组，其具有与BoHV-1异源、插入两个整合 (converging)BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调 BoHV-1基因的表达。
[0021] 所述疫苗在刺激对BoHV-1以及其他牛病原体（例如BVDV、支原体（Mycoplasma)、 巴斯德氏菌（Pasteurella)、曼氏杆菌（Manhiemia)和嗜血菌（Haemophilus))相关抗原之 免疫应答的方面的能力是多价的。BVDV抗原的实例包括糖蛋白E0和E2。
[0022] 在一个实施方案中，使用诱导型重组系统（例如GET重组）来引入异源遗传物质。
[0023] 本文教导的另一个方面是针对来自牛病原体的至少一种抗原而对牛科动物接种 疫苗的方法，所述方法包括对牛科动物施用体液免疫诱导性或细胞介导免疫诱导性有效量 的来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组，所述BoHV-1基因组具有与BoHV-1异源、插入两个 整合BoHV-1基因之间的编码至少一种抗原的遗传物质，其中所述插入基本不下调BoHV-1 基因的表达。
[0024] 本文的方法能够制备针对来自牛病原体的至少一种抗原的疫苗，所述方法包括：
[0025] ⑴将来自低毒力BoHV-1的BoHV-1基因组并入细