1所示成员）均未患病，是杂合 携带者，3例患者均携带2等位基因突变，完全符合常染色体隐性遗传特征。
[0069] 2、确定致病突变
[0070]发明人利用HISEQ2000、S0LiD、454或单分子测序装置，采用Sanger测序方法对先 证者的外显子组序列进行了测序。具体如下：
[0071] 2.1DNA提取
[0072] 米集图2所不患者豕系中患者（即图2中患者II:2)的外周血，利用DNA提取试剂 盒从外周血样品中提取基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得各基因 组DNA的OD26Q/OD28Q均应位于1. 7-2. 0之间，浓度不少于200纳克/微升，总量不少于30微 克。
[0073] 2.2目标区域捕获与测序
[0074] 利用超声波仪将各基因组DNA样本随机打断成100~500bp左右的片段，随后按 照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库(可参见：http://www. illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文)。 文库经纯化后经过PCR扩增与捕获试剂SureSelectBiotinylatedRNALibrary(BAITS) 进行杂交富集，再经过PCR扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。 其中，测序平台为HiSeq，读取长度为35~100bp，各样本的平均测序深度最少为50X。
[0075] 3、变异检测、注释及数据库比较
[0076] 利用IlluminabasecallingSoftwarel. 7对上述获得的原始测序数据进行处 理，经过过滤去污染后，使用S0APaligner/S0AP2 (可参见：LiR,LiY,KristiansenK，et al,SOAP:shortoligonucleotidealignmentprogram.Bioinformatics2008, 24 (5):71 3-714；LiR,YuC,LiY,eaal,S0AP2:animprovedultrafasttoolforshortread alignment.Bioinformatics2009, 25 (15) : 1966-1967,通过参照将其全文并入本文）比 对到UCSC人类参考基因组（hgl9,build37. 1，http://genome.ucsc.edu/),以便获得比 对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：LiR,LiY,FangX，Yang H,etal,SNPdetectionformassivelyparallelwhole-genomeresequencing.Genome Res2009, 19 (6) : 1124-1132,通过参照将其全文并入本文）确定靶区域的基因型，获得患者 的单核苷酸多态性（SNPs)和插入/缺失测序结果。
[0077]随后通过dbSNP数据库（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hgl9/ database/snpl35.txt.gz.)、HapMap数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)、千 人基因组数据库（ftp://ftp.lOOOgenomes.ebi.ac.uk/voll/ftp)、炎黄数据库（http:// yh.genomics,org.cn/)等公共数据库的过滤，去掉上述获得的测序结果中的同义突变、 非编码区的变异，以及所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0. 005的变异，并利用 SIFT软件进行SNP功能预测，最终得到3个可能具有致病意义的denovoSNP位点。
[0078] 对上述3个de novo SNP位点在家系成员中和正常人群对照组基因组DNA中进行 扫描，最终确定CYP4V2基因c. 413+2T>G杂合突变导致CYP4V2蛋白发生缺失突变，此基因 突变在该常染色体隐性遗传结晶样视网膜变性家系中与疾病表型共分离，并在正常对照人 群中未检出该突变。综上推测，CYP4V2基因c. 413+2T>G杂合突变是B⑶的致病突变。
[0079] 实施例2:对候选CYP4V2基因进行Sanger法测序验证
[0080] 针对CYP4V2基因(外显子1-11)序列设计引物，通过PCR扩增，产物纯化，测序的 方法获得有关序列。具体操作如下：
[0081] 1.DNA提取
[0082] 采集上述B⑶家系中的先证者（即图2中患者II:2)外周血，利用常规酚-氯仿法 抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标 本基因组DNA的0D26(l/0D28(l均位于1. 7-2. 0之间，浓度不少于200纳克/微升，总量不少于 30微克。
[0083] 2.引物设计
[0084] PCR反应引物设计参考人类基因组序列，具体见下表1 :
[0085] 表 1
【主权项】
1. 一种分离的编码CYP4V2突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO :1相比， 具有c. 413+2T>G突变， 任选地，所述核酸为DNA。
2. -种分离的多肽，其特征在于，具有如SEQ ID NO :23所示的氨基酸序列， 任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。
3. -种筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法，其特征在于，包括以下 步骤： 从所述生物样品提取核酸样本； 确定所述核酸样本的核酸序列； 所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0:1相比，具有c.413+2T>G突变是所述生物样品 易感原发性结晶样视网膜变性的指示， 任选地，所述生物样本为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种， 任选地，所述核酸样本为全基因组DNA。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述生物样品提取核酸样本进一步包 括： 从所述生物样品提取RNA样本，优选所述RNA样本为mRNA ;以及 基于所述RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样 本。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包 括： 针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，任选地，采 用选自Hiseq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测 序， 任选地,针对所述核酸样本,构建核酸测序文库进一步包括： 利用CYP4V2基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增；以及 针对所得到的扩增产物，构建所述核酸测序文库， 任选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO :7-8所示的核苷酸序列。
6. -种筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统，其特征在于，包括： 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核 酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列； 判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核 酸序列与SEQ ID NO :1相比，是否具有c. 413+2T>G突变，判断所述生物样品是否易感原发 性结晶样视网膜变性， 任选地，所述核酸提取装置进一步包括： RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及 反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行反转 录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。
7. 根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括： 文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测 序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果， 任选地,所述文库构建单元进一步包括： PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有CYP4V2基因外显子特异性引物，以便利用所 述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增， 任选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO :7-8所示的核苷酸序列， 任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一 种。
8. -种用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的试剂盒，其特征在于，含 有： 适于检测CYP4V2基因突变体的试剂，其中与SEQ ID N0:1相比，所述CYP4V2基因突变 体具有c. 413+2T>G突变， 任选地，所述试剂为核酸探针或引物， 任选地，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO :7-8所示的核苷酸序列。
9. 一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码CYP4V2突变体的核酸。
10. -种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求9所述的构建体转化受 体细胞而获得的。
【专利摘要】本发明公开了CYP4V2基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码CYP4V2突变体的核酸，分离的多肽，筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的方法，筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的系统，以及用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性的生物样品的试剂盒。其中，该分离的编码CYP4V2突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.413+2T>G突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性。
【IPC分类】C12M1-34, C12Q1-68, C12N15-63, C12N15-12, C12M1-00, C12N5-10, C07K14-47
【公开号】CN104745591
【申请号】CN201310749646
【发明人】阴正勤, 孟晓红, 金鑫, 徐海伟, 黎其友, 李世迎
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月31日