一种疟原虫检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测试剂盒技术领域，具体涉及一种疟原虫荧光定量PCR检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 疟疾是全球最严重的由疟原虫引起的热带病之一，每年约有4亿人感染，其中大 部分发生在撒哈拉以南的非洲（恶性疟）和东南亚等国家（间日疟）。疟疾每年给非洲造 成的经济损失高达120亿美元。在针对疟疾的治疗过程中，病因的早期检测显得尤为的重 要，现在国内外成熟的商品化疟原虫检测试剂多为免疫学平台产品。
[0003] 疟原虫的检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。
[0004] 国内成熟产品中，外周血中核酸的提取，目前主要有三种方法：1)直接煮沸法：向 外周血中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板。其优点是易于操作；缺点是 不能有效去除外周血中抑制PCR的因素，弱阳性经常无扩增。2)浓缩煮沸法：先将外周血 浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板，这种方法是目前国内临床通用的方法，其 优点是能部分去除"直接煮沸法"中无法去除的抑制性因素；缺点是不同厂家的浓缩效果不 一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到。看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，导 致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀的，使操作者无法确定吸弃杂质时会不 会把病毒一起吸弃，而导致病毒损失，导致成为假阴性。3)柱提取法：外周血通过裂解，过 柱后核酸吸附到膜上，通过两次洗涤，最后洗脱下来的为模板。这种方法相对前两种提取方 法而言，提取的核酸纯度大大提高，但步骤繁琐，时效性差。
[0005] 临床上检测疟原虫的方法目前主要是免疫学方法，而基于实时荧光定量PCR技术 (探针法）对疟原虫进行检测的报导较少。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的 一种核酸检测技术；它使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照 一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动 态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，实验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲 线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性 结果。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了荧光探针。探针发出的荧光信号被荧 光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。实验 结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果。因此，该技 术在靶多核苷酸样品的检测分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
[0006] 国内已有多种基于免疫学方法用于疟原虫检测的试剂盒，但暂无实时荧光定量 PCR技术检测疟原虫的试剂盒应用于临床检测中。已有的这些试剂盒所提供的疟原虫提 取和检测方法有很多不足之处：1)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本 时，需要经过多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集 不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本丢失验证，核酸提取效率低；2)检测灵敏度低，在 5000 C〇pieS/ml左右；3) -般没有预防物污染的措施；4)没有荧光归一化校正系统，结果判 定受主观因素影响较大；5)方法学时效性差且通量小。
[0007] 因此，本领域需要研宄开发一种操作简便、耗时短、高效、安全可靠且检测灵敏度 高的疟原虫检测试剂盒。
【发明内容】
[0008] 本发明针对现有技术的不足，提供一种疟原虫荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂 盒包括用于检测的探针、用于扩增的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶。该 试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性， 利用该试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测，可以确定血液样本中疟原虫有无，可为灵敏、 早期诊断是否被疟原虫感染提供可靠的实验证据。
[0009] 因此，本发明提供一种疟原虫检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于荧光定量PCR 检测的PCR反应液。具体地，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下 游引物序列，且所述上游引物的序列为：5' -CGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGT-3';所述下游引物 的序列为：5' -CCAGAACCCAAAGACITTGAITTC-3'。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸检测的探针 序列，且所述探针序列为：5 ' -TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3 '。本发明中，所述探针的 羧基端用荧光素标记，并对羟基端用猝灭基团修饰，其中所述荧光素选自FAM、TET、JOE和 ffiX，所述猝灭基团选自BHQ1、DABCYL、TAMRA、BHQ2和BHQ3。优选所述荧光素为FAM，所述 猝灭基团为BHQ1。
[0011] 本发明的试剂盒，因为采用了上述探针和上下游引物，所以具有很好的特异性和 灵敏性，应用本发明提供的试剂盒，可以对血液样本中的疟原虫进行快速、准确测定，特异 性好，能够检测出是否存在疟原虫感染。
[0012] 在本发明的另一种实施方式中，所述试剂盒中还含有40~200mmol/L的参比染 料。本发明中，所述参比染料包括R0X参比染料（购自Roche公司）或其他适用于荧光定 量PCR的参比染料。加入R0X参比染料起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳 定性有明显改善。
[0013] 本发明中，所述试剂盒中还包括酶混合液和疟原虫阴性对照，且所述酶混合液包 含浓度为1~5U/ y 1的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和浓度为0? 05~0? 2U/ y 1的尿嘧啶DNA 糖基化酶（UNG酶）。其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反 应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。在本发明的另一个实施例中，所述疟原 虫阴性对照为不含有疟原虫任意一种型别的灭活阴性外周血。
[0014] 本发明的PCR反应中优选地包括PCR反应缓冲液。在本发明的一个实施例中，所 述10XPCR反应缓冲液包括pH7. 5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、30mmol/L氯化 镁、500mmol/L氯化钾、0. 2ml/100ml曲拉通、和10ml/100ml甲酰胺（各组分购自Sigma公 司
[0015] 本发明还提供一种使用如上所述的试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测的方法， 其包括：步骤K，将PCR反应液与酶混合液混合后制成PCR混合液；步骤L，将PCR混合液离 心处理，然后将经过离心处理的PCR混合液加入多个反应管，并向含有PCR混合液的反应 管中分别加入阴性对照或待测样本核酸，制成PCR反应样品，盖好管盖；步骤M，在荧光定量 PCR扩增仪上进行荧光PCR反应，检测并记录样品的扩增曲线与阈值线；步骤N，根据样品的 扩增曲线形状、扩增曲线与阈值线是否存在交点Ct，以及Ct值大小进行疟原虫分析；其中， 在步骤K中，PCR反应液的加入量为42~43 y 1/人份，酶混合液的加入量为1~2 y 1/人 份。
[0016] 优选地，在步骤L中，每个反应管中阴性对照或待测样本核酸的加入量为3~ 5 y 1 〇
【具体实施方式】
[0017] 为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅 起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常 按照常规实验方法进行。
[0018] 实施例1
[0019] 本实施例提供一种疟原虫荧光定量PCR检测试剂盒，它包括如下组分。
[0020] 1)用于检测疟原虫的引物探针序列（Invitrogen公司合成），其源于疟原虫各型 别的保守区域。
[0021] 上游引物 PT-F :5' -CGACTAGGTGTT