GGATGAAAGTGT-3' ；
[0022] 下游引物 PT-R : 5 ' -CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3 ' ；
[0023] 探针 PT-P :5' -TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3' ；
[0024] 优选地，探针羧基端用FAM标记，羟基端用BHQ1猝灭基团修饰。在本发明的其他 实施方式中，还可以选用TET、JOE、HEX等荧光素标记，配合选用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3 等猝灭基团。
[0025] 2)10XPCR反应缓冲液：包括pH7. 5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐， 30mmol/L氯化镁，500mmol/L氯化钾，0. 2ml/100ml曲拉通和10ml/100ml甲酰胺（各组分购 自Sigma公司）；
[0026] 3)脱氧核糖核苷三磷酸：为dATP、dCTP、dGTP和dTTP (均购自Promega公司）；
[0027] 4) dUTP :购自Promega公司，它与尿嘧啶DNA糖基化酶配合用于预防PCR产物污 染。
[0028] 上述组分1)~4)可混合构成PCR反应液。
[0029] 5) R0X参比染料：R0X参比染料购自Roche公司，或使用其他适用于荧光定量PCR 的参比染料。加入R0X参比染料起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳定性有 明显改善。
[0030] 6)酶混合液：购自Promega公司，其中酶混合液包含浓度为1~5U/ y 1的耐热DNA 聚合酶（Taq酶）和浓度为0. 05~0. 2U/ y 1的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）；其中UNG 酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防 PCR产物污染的作用。
[0031] 7)疟原虫阴性对照：不含有疟原虫各型别中任意一种的灭活阴性外周血。
[0032] 实施例2
[0033] 本实施例为使用实施例1的试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测。
[0034] 1 ?试剂准备：
[0035] 1)提取待测样本中核酸：
[0036] ①根据样本数取相应量的1. 5ml离心管，做好标记。
[0037] ②取血液样品200ml，加入2-2. 5倍体积的灭菌生理盐水，颠倒混匀，振荡至彻底 混匀。
[0038] ③加入200ul裂解液，混匀，振荡至彻底混匀。
[0039] ④将上一步得到的溶液，99度放置lOmin，其间颠倒混匀数次。
[0040] ⑤将上一步得到的溶液，12000rpm离心5min，将上清收集到离心管中。
[0041] ⑥在PCR管盖上做好标记，低速离心数秒，而后分别加入已提取的待测样品3~ 5 y 1，使反应总体系为50 y 1，低速离心数秒。每次实验可设置一个阴性质控，作为产品使用 的质量控制。
[0042] 2)PCR反应液：包含10XPCR反应缓冲液，0. 2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸， 40mmol/L~200mmol/LR0X参比染料，0. 2ymol/L~0. 4ymol/L用于革巴多核昔酸扩增的 上游引物PT-F以及下游引物PT-R，0? 2ymol/L~0? 4ymol/L用于检测靶多核苷酸的探针 PT-P；
[0043] 3)PCR-mix :根据待测样本和阴性对照的量，按比例（PCR反应液42~43 y 1/人份 +酶混合液1~2 y 1/人份）取相应量的PCR反应液及酶混合液，充分混匀成PCR-mix，瞬 时离心后备用。
[0044] 2?荧光PCR反应
[0045] 1)将PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪，按对应顺序设置待测样本名称；
[0046] 2)焚光检测通道选择：选择FAM通道（Reportere:FAM, Quencher:None)检测疱原 虫有无；参比焚光（Passive Reference)设置为R0X ;
[0047] 3)荧光定量PCR反应条件为：
【主权项】
1. 一种疟原虫检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于荧光定量PCR检测的PCR反应液。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸 扩增的上游引物和下游引物序列，且 所述上游引物的序列为：5' -CGACTAGGTGITGGATGAAAGTGT-3' ； 所述下游引物的序列为：5' -CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3'。
3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中包含用于靶多核 苷酸检测的探针序列， 且所述探针序列为：5' -ITCGAGGTGACTITTAGAITGCTTCCTTC-3'。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的羧基端用荧光素标记，并 对羟基端用猝灭基团修饰，其中所述荧光素选自FAM、TET、JOE和HEX，所述猝灭基团选自 BHQl、DABCYL、TAMRA、BHQ2 和BHQ3。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素为FAM，所述猝灭基团为 BHQl0
6. 根据权利要求1~5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有 40~200mmol/L的参比染料。
7. 根据权利要求1~6中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶 混合液和疟原虫阴性对照，且所述酶混合液包含浓度为1~5U/y1的耐热DNA聚合酶和浓 度为0. 05~0. 2U/y1的尿嘧啶DNA糖基化酶。
8. -种使用如权利要求1~7中任意一项所述的试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测 的方法，其包括： 步骤K，将PCR反应液与酶混合液混合后制成PCR混合液； 步骤L，将PCR混合液离心处理，然后将经过离心处理的PCR混合液加入多个反应管，并 向含有PCR混合液的反应管中分别加入阴性对照或待测样本核酸，制成PCR反应样品，盖好 管盖； 步骤M，在荧光定量PCR扩增仪上进行荧光PCR反应，检测并记录样品的扩增曲线与阈 值线； 步骤N，根据样品的扩增曲线形状、扩增曲线与阈值线是否存在交点Ct，以及Ct值大小 进行疟原虫分析； 其中，在步骤K中，PCR反应液的加入量为42~43y1/人份，酶混合液的加入量为1~ 2y1/人份。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤L中，每个反应管中阴性对照或待 测样本核酸的加入量为3~5y1。
【专利摘要】本发明提供一种疟原虫检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于荧光定量PCR检测的PCR反应液。具体地，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物序列，且上游引物：5’-CGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGT-3’；下游引物：5’-CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3’。在一种【具体实施方式】中，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸检测的探针序列，且探针序列为：5’-TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3’。本发明提供的试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性，利用该试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测，可以确定血液样本中疟原虫的有无，可为灵敏、早期诊断是否被疟原虫感染提供可靠的实验证据。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-04, C12R1-90
【公开号】CN104762379
【申请号】CN201510141779
【发明人】戴立忠, 邓中平, 付亚成
【申请人】湖南圣湘生物科技有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月30日