叶绿体表达载体pWX-Nt03具体为： 1. 1)、在保持氨基酸序列不发生改变的前提下，利用Gene Designer将编码基因的所有 密码子采用烟草叶绿体密码子最适编码方式进行密码子替换，对经修饰后的基因序列再通 过DNAMAN7. 0和VectorNTI 10. 0软件分析其中的酶切位点信息，将第35位氨基酸Ile的 编码密码子由第1最适密码子TAT，变更为第2最适密码子TAC以消除EcoR I酶切位点；将 第104位氨基酸Tyr的编码密码子由第1最适密码子TCT，变更为第2最适密码子TCA以消 除Psi I酶切位点；将第109位氨基酸Ser的编码密码子由第1最适密码子ATT，变更为第 2最适密码子ATA以消除Xba I和Bgl II酶切位点；优化后的人源碱性成纤维细胞生长因 子基因序列见SEQ ID NO. 1所不； 1. 2)、构建烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03,经密码子优化后的人源碱性成纤维细胞生 长因子基因bFGF，由叶绿体特异性融合启动子PrrnPclpPrbcL驱动，并由烟草叶绿体终止 子TpsbA终止，构成目的基因表达框。作为报告基因的绿色荧光蛋白基因GFP和作为筛选 标记基因的壮观霉素抗性基因aadA依次位于烟草叶绿体启动子Prrn与烟草叶绿体终止子 Trpsie之间，构成筛选标记表达框；上述两个表达框化学合成后，通过酶切连接导入来自 烟草叶绿体基因组中的部分16S核糖体RNA基因与异亮氨酸转移RNA基因构成的16S-trnI 片段和丙氨酸转移RNA基因与部分23S核糖体RNA基因构成的trnA-23S片段两段同源片 段之间，最终获得用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为 pffX-Nt03〇6. 根据权利要求4所述的利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人源碱性成纤维细胞 生长因子的方法，其特征在于，所述步骤2中bFGF基因的叶绿体转化及同质化筛选具体 为： 1) 用H)S 1000/He基因枪进行叶绿体转化：金粉颗粒直径为0? 6 y m，轰击距离为9cm， 可裂膜采用IlOOpsi，金粉微弹按每毫克金粉用0. 2 y g质粒DNA包裹； 2) 筛选：第一轮筛选：轰击过的叶片背面朝上在恢复养基上25°C暗培养3天；暗培养 后，将叶片切成5_X5mm的小块，背面朝下放在筛选培养基I上，以16小时光照、8小时黑 暗的光周期25°C培养，每20天更新一次培养基。产生不定芽后，用365nm紫外灯检测，将 产生绿色荧光的不定芽剪下，置于生根培养基II上；PCR检测选择性标记基因GFP、aadA以 及目的基因bFGF，其中，培养基I具体为4.3g/L MS盐、30g/L蔗糖、2mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、500mg/L壮观霉素和8g/L琼脂，pH5. 8 ;生根培养基II具体为：4. 3g/L MS盐、30g/L蔗 糖、500mg/L壮观霉素和8g/L琼脂，pH5. 8 ; 第二至多轮筛选：选取转基因植株中绿色荧光较强的植株，将其叶片切成5_X 5mm的 小块，背面朝下放在筛选培养基按照与第一轮相同条件重复筛选，期间通过在PCR方式进 行烟草转基因植株同质化进程的检测，重复此筛选过程直至获得同质化的不定芽，将获得 的同质化的不定芽在生根培养基II上生根、移栽，即获得同质化的叶绿体转基因植株。7. 根据权利要求6所述的利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人源碱性成纤维细胞 生长因子的方法，其特征在于，所述步骤2中叶绿体转基因烟草植株的同质化检测具体为： 高盐低PH值法提取叶绿体DNA，其引物为：引物Pl :5' -GGTCGGAACAAGTTGATAG-3'，碱基序 列如 SEQ ID NO. 2 所示；引物 P2 :5' -CAGTAGAGTCTITCAGTGGC-3'，碱基序列如 SEQ ID NO. 3 所示；PCR程序为：95°C预变性5min ;95°C变性20sec，56°C退火20sec，72°C延伸2min，30个 循环；72 °C后延伸5min ;取4 y g叶绿体DNA用BamHI和KpnI酶切，0. 8 %琼脂糖凝胶80V电 泳3个小时后转移到硝酸纤维素膜上，紫外交联两次，每次30秒，间隔2分钟；按照Roche公 司试剂盒提供的方法进行Southern杂交分析，探针为烟草叶绿体上trnl-trnA区段BamHI 和KpnI内切酶之间约I. 4kb的PCR产物。8. 根据权利要求4所述的利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人源碱性成纤维细胞 生长因子的方法，其特征在于，所述步骤4中叶绿体转基因烟草植株中bFGF表达量分析具 体为：将野生型烟草和同质化的叶绿体转基因烟草植株的叶片剪下，在液氮中研磨成粉末， 按 1:2(W/V)比例加入 PBS 缓冲液，其中，PBS 缓冲液为 137mmol/L NaCl，2. 7mmol/L KC1， 10mmol/L Na2HP04,2mmol/L KH2PO4,冰浴至完全融化；涡旋 30sec;在 4°C条件下 15000g 离 心20min，取上清即为总可溶性蛋白； 取10 yL蛋白溶液与等量2X上样缓冲液混合，沸水温浴5min，然后进行16. 5% Tricine-SDS - PAGE电泳检测，并用考马斯亮蓝R250染色，将相同条件下电泳后未进行考 马斯亮蓝R250染色的凝胶，在200mA恒定电流条件下通过半干转膜仪转印到0. 2 ym的 尼龙膜上，用TBST缓冲液洗涤6次，每次5min，其中，TBST缓冲液为20mmol/L Tris-HCl， 150mmol/L NaCl，0. 05% Tween 20 ;加入封闭液 100mL，37°C封闭 2h，其中，封闭液为 5%脱 脂奶粉/TBST缓冲液；倒掉封闭液，按上述方法洗涤后加入IOOmL用封闭液稀释的一抗鼠 抗bFGF工作液，37°C包被Ih ;倒掉一抗工作液，如前述方法洗绦，加入IOOmL用封闭液稀释 的二抗碱性磷酸酶标记的羊抗鼠，包被Ih ;倒掉二抗工作液，如前法洗涤，加入IOmL显色剂 BCIP/NBT，室温暗光反应直至出现预期杂交信号后，用50ml双蒸水或TE缓冲液洗膜5min， 以终止反应。9.根据权利要求4所述的利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人源碱性成纤维细胞 生长因子的方法，其特征在于，所述步骤5中重组人源碱性成纤维细胞生长因子的纯化得 到烟草叶绿体转bFGF基因的同质化植株具体为：将总可溶性蛋白经0. 22 ym滤膜抽滤后， 置于截流分子量为30KD的超滤离心管中，4000g离心15min，取流出液再置于截流分子量为 IOKD的超滤离心管中5000g离心60min后，截留部分液体即为重组人源碱性成纤维细胞生 长因子的初步纯化产物，即为烟草叶绿体表达的碱性成纤维细胞生长因子。
【专利摘要】本发明公开了一种人源碱性成纤维细胞生长因子，该基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为pWX-Nt03；本发明还公开了一种携带并可扩增上述载体的宿主细胞Mach1；本发明还公开一种利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人源碱性成纤维细胞生长的方法；利用叶绿体表达bFGF能够较传统的动物血液中分离提取法和现行生物工程制药中的微生物发酵法不仅大幅度降低成本，且由于植物中往往不含有或极少含有能够导致人及动物过敏反应的热源蛋白，因此，相对利用微生物生产bFGF具有更好的临床应用前景。
【IPC分类】C12N15/82, C07K14/50, C12N15/12, C07K1/34
【公开号】CN104946656
【申请号】CN201510310239
【发明人】邢少辰, 蔡玉红, 王云鹏, 韦正乙, 仲晓芳, 林春晶, 张玉英, 马建, 刘艳芝, 孙卉
【申请人】吉林省农业科学院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月8日