ker III，I号泳道为pKD46质粒4 μ L ;2_3泳道为pKD46质粒用限制性内切酶BamH I消化I个小时后上样10 μ L ;4号泳道为限制性内切酶用BamHI酶和NcoI酶共同消化Ih后上样10 μ L0
[0028]图4是实施例5中筛选出的耐受丁醇的大肠杆菌的转化子、实施例3获得的Bffl.3(2)-4和大肠杆菌BW25113在含丁醇0.85% V/V的LB液体培养基中的生长曲线。
[0029]生物材料样品保藏
[0030]本发明涉及的耐受丁醇的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌Bwl.8-4 (Escherichia coli) Bwl.8-4，该菌株已于2015年6月19日保藏于地址为中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号CCTCC NO:M2015365o
【具体实施方式】
[0031]大肠杆菌BW25113购于:b1vector NTCC公司。大肠杆菌BW25113含有pKD46质粒。BW25113中的pKD46质粒含有red重组酶基因能提高重组效率，但该质粒是温敏型复制子，因此在第一轮全基因组改组的时候质粒丢失。
[0032]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0033]实施例1基因组DNA提取:
[0034]提取出发菌株大肠杆菌BW25113的基因组DNA，具体操作如下:甘油管中的上述菌液转接至含有5mL的LB液体培养基的试管中，37°C培养过夜，使0D600 = 2?3。将培养物移至离心管中，4°C 13000rpm离心I分钟后弃上清，沉淀用30 μ L无菌水重悬后，离心弃上清。在离心管内加入120 μ L破菌缓冲液、60 μ L Tris饱和酚、60 μ L氯仿、120 μ L TE缓冲液，120 μ L体积石英砂，充分震荡4min后，4°C 13000rpm/5min离心取上清液。在上清液中加入ImL无水乙醇，颠倒混勾，于-20°C放置30min后，于4°C，13000rpm/25min离心，弃上清液，沉淀晾干，取50 μ L无菌水重悬得到基因组DNA。
[0035]LB液体培养基为:酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L和NaC110g/L，余量为水。
[0036]LB固体培养基为:酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L和NaC110g/L，20g/L琼脂粉，余量为水。
[0037]破菌缓冲液:
[0038]2% (V/V) TritonX -100,1 % (ff/V) SDS, 10nmoI/L NaCl, lnmol/L EDTA，1nmoI/LpH8.0Tris - cl.
[0039]TE 缓冲液 1nmoI/L Tris - cl (ρΗ8.0) ； lnmol/L ρΗ8.0EDTA
[0040]实施例2易错PCR扩增全基因组:
[0041]取5 μ L的dNTPS母液、16.6 μ L的100uM10-17个碱基的随机引物、3 μ L的15mM的MnCl2、5yL 的 10X 突变 buffer、20ng 步骤(I)获得的基因组 DNA、2.5 μ L 的 2U/μ L TaqDNA聚合酶、补充无菌水至50 μ L ;所述dNTPS母液含1mM dCTP和dTTP、2mM dATP和dGTP ；所述 10X 突变 buffer 含 ImM ρΗ8.3 的 Tris - HCl, 0.7mM MgCl2、5mM KC1、lg/100mL 甘油；
[0042]易错PCR反应条件:94°C预变性5分钟；92°C lmin，再在37°C的条件下退火lmin，再由37°C以每秒变化0.1°(:的速度升至55°(:，55°(:延伸4min，进行50个循环，55°C补充延伸1min ;扩增产物如图1所示。
[0043]16.6yL的100uM10-17个碱基的任意引物均可以扩增出易错PCR产物。
[0044]16.6 μ L 的 100uM10-17 个碱基分别为:
[0045]8.3 μ L 10uM 10个碱基的随机引物和8.3 μ L 10uM 12个碱基的随机引物；
[0046]6.6yL 10uM 14个碱基的随机引物和10 μ L 10uM 15个碱基的随机引物；
[0047]8.3 μ L 10uM 13个碱基的随机引物和8.3 μ L 10uM 15个碱基的随机引物；
[0048]8.3 μ L 10uM 16个碱基的随机引物和8.3 μ L 10uM 17个碱基的随机引物；
[0049]8.3 μ L 10uM 13个碱基的随机引物和8.3 μ L 10uM 14个碱基的随机引物；
[0050]8.3 μ L 10uM 15个碱基的随机引物和8.3 μ L 10uM 16个碱基的随机引物；
[0051]16.6 yL 10uM 16个碱基的随机引物；
[0052]16.6 μ L 10uM 15个碱基的随机引物；
[0053]8.3 μ L 10uM 11个碱基的随机引物和8.3 μ L 10uM 12个碱基的随机引物；
[0054]本实施例以上述随机引物为例，是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
[0055]图1 中，
[0056]泳道I是使用8.3 μ L 10个碱基的随机引物I和8.3 μ L 12个碱基的随机引物2扩增的易错PCR产物；
[0057]泳道2为6.6 μ L 14个碱基的随机引物I和10 μ L 15个碱基的随机引物2扩增的易错PCR产物；
[0058]泳道3为8.3 μ L 13个碱基的随机引物I和8.3 μ L 15个碱基的随机引物2扩增的易错PCR产物；
[0059]泳道4为8.3 μ L 16个碱基的随机引物I和8.3 μ L 17个碱基的随机引物2扩增的易错PCR产物；
[0060]泳道5为8.3 μ L 13个碱基的随机引物I和8.3 μ L 14个碱基的随机引物2扩增的易错PCR产物；
[0061]泳道6为8.3 μ L 15个碱基的随机引物I和8.3 μ L 16个碱基的随机引物2扩增的易错PCR产物；
[0062]泳道7为16.6 μ L 16个碱基的随机引物扩增的易错PCR产物；
[0063]泳道8为16.6 μ L 15个碱基的随机引物扩增的易错PCR产物；
[0064]泳道9为8.3 μ L 11个碱基的随机引物I和8.3 μ L 12个碱基的随机引物2扩增的易错PCR产物
[0065]实施例3全基因组改组:
[0066]将实施例2获得的各种PCR产物混匀，通过乙醇沉淀浓缩10倍用于电转化；
[0067]将含有pKD46质粒的大肠杆菌BW25113接种到3mL含50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30 °C培养过夜；次日按1%的比例转接到含50ug/mL氨苄青霉素的50mL的LB液体培养基中，30°C培养至OD6im= 0.15?0.2，加入L-阿拉伯糖至终浓度为20mmol/L，诱导质粒PKD46表达Red重组蛋白；培养至0D6。。= 0.45?0.5时取出在冰上预冷10?15min，4°C、5000g离心lOmin，弃上清，菌体分别用20mL冰冷的无菌水洗涤I次，20mL预冷的10%的甘油洗涤两次，浓缩100倍即用500uL冰冷的10%甘油重悬混匀，即得感受态细胞。
[0068]取4份感受态细胞，每份50 μ 1，分别加入浓缩10倍的PCR产物3 μ L，4 μ L，5 μ L，及无菌超纯水5yL，分别转移至无菌预冷的Imm电击杯中，1800V电击，加入37°C预热的450ul LB液体培养基，混匀后转移到1.5ml无菌离心管中，37°C静置I小时(也可以静置2小时)，将每个电击后的约500 μ L培养物各取100 μ L涂布于丁醇浓度为1.0 %、1.2 %、
1.4%和1.6% V/V (也可以是1.0% -1.6% V/V之间的任意浓度)的LB固体培养基筛选平板，倒置放于培养箱37°C培养1-3天，观察平板上单克隆菌落的生长状况，若用无菌超纯水5 yL电转化后所涂的平板未长出菌落而浓缩PCR电转化细胞的样品所涂的平板长出菌落，则挑取转化板上的单克隆用于后续丁醇耐受性评价。
[0069]实施例4耐受丁醇转化子的评价
[0070]将实施例3中平板长出的单克隆分别命名为1.2 (3)-2，1.2(3)-3, 1.2(3)-4, 1.3(2) -4和1.4-4接种LB液体培养基中于37°C、180-200rpm培养至对数晚期，保存菌液。为了比较转化子与出发菌株大肠杆菌8125113在含0.8% (v/v) 丁醇的LB液体培养中的生长差别，从而选出耐受丁醇能力强的菌株，分别接种上述单克隆的菌液和大肠杆菌BW25113至LB液体培养基中于37°C静置180rpm转培养至OD6。。为1.5-2.0，5000g/18°C的条件下离心5min，弃上清，加入LB液体培养基使浓缩后0D_为25，再分别转接至50mL 丁醇浓度为