0.8% (v/v)的LB液体培养基，初始0D600控制在0.15，置于37°C 200rpm的摇床培养、测定各菌株的生长曲线见图2。
[0071]在0.8% (v/v) 丁醇的 LB 培养基中、菌 1.2(3)-2, 1.2(3)-3, 1.2(3)-4, 1.3(2)-4和1.4-4对于丁醇的抗性都要明显好于大肠杆菌BW25113，在6h时候0D600均高于出发菌大肠杆菌，说明用该技术进行的全基因组改组有效，即运用全基因改组技术成功获得了转化子。菌株1.3 (2) -4的丁醇耐受性最强，最高OD6。。达到0.5，为各菌株中最高值，可以用Bffl.3 (2) - 4作为出发菌株进行下一轮的基因组改组。
[0072]实施例5转化子Bwl.3(2) - 4的改组及丁醇耐受评价
[0073]BW25113中含的pKD46质粒是温敏型复制子，30°C培养可正常复制，在37°C环境下培养pKD46会丢失。在获得转化子Bwl.3(2) - 4的筛选和培养过程均在37°C培养，因而质粒pKD46自动去除，为提高转化子Bwl.3 (2) -4的重组效率，因此将pKD46质粒转入转化子Bwl.3 (2) - 4，使转化子Bwl.3(2) - 4能够产生Gam、Beta、Exo三种蛋白，从而提高重组效率。
[0074]用天根质粒小量提取试剂盒从大肠杆菌BW25113提取pKD46质粒，按照实施例3所述的方法制备Bwl.3(2) - 4的感受态细胞，取1ng的pKD46质粒至50ul的感受态细胞中混合均匀，混合后移至无菌预冷的Imm电击杯中，1800V电击，电击后立刻加入30°C预热的450ul LB液体培养基于30°C静置I小时，在25 μ g/ml的氯霉素平板上筛选出转化的单克隆。挑取单克隆至LB液体培养基中培养，提取出质粒进行酶切电泳鉴定，如图3所示，PKD46质粒经BamHI和NcoI酶切，产生2235bp和3390bp片段，与预期结果一致，即获得含有pKD46质粒的BWl.3(2) - 4的菌株，该菌株用于后期电转化。
[0075]按照实施例3中的所述的方法进行电转化，将每个电击后的500 μ L培养物各取100 μ L涂布于2个含1.6%、2个含1.8%和一个含2.0%丁醇的LB固体平板，倒置放于培养箱30°C培养1-3天，观察平板上单克隆菌落的生长状况，若用无菌超纯水5 μ L电转化后所涂的平板未长出菌落而浓缩PCR电转化细胞的样品所涂的平板长出菌落，则挑取转化板上的单克隆用于后续的丁醇耐受性评价。
[0076]实施例6第二轮全基因改组后获得转化子的丁醇耐受评价:
[0077]将实施例5中平板长出的单克隆接种LB液体培养基中于37°C、180_200rpm培养至对数晚期，保存菌液。将上述单克隆、出发菌株BW25113和转化子Bwl.3(2)-4分别接种至LB液体培养基，于37°C静置预培养至0D6。。= I时转至4mL 0.8% 丁醇的LB液体培养基，使菌的初始浓度控制在0D600 = 0.15。菌株长至6h，Bwl.8 _ 4与BW2.0 _ I的OD600达到最高值，分别为0.64和0.62，而出发菌株BW25113和Bwl.3(2) - 4的最高OD600分别为
0.51和0.57，所以选取Bwl.8 - 4和Bw2.0 -1用于后续摇瓶评价。
[0078]摇瓶评价用的液体LB培养基的丁醇浓度提高到0.85% V/V0
[0079]将大肠杆菌BW25113，第二轮的全基因改组的出发菌株Bwl.3(2) _4与转化子Bwl.8 - 4和Bw2.0 -1分别按种至LB液体培养基于37 °C、180_200rpm培养至对数晚期，5000g/18°C的条件下离心5min，弃上清，加入LB液体培养基重悬菌体，使菌液浓缩后的0D_为25，再分别将上述浓缩的菌液转接至50mL 丁醇浓度为0.85% V/V的LB液体培养基，初始0D600控制在0.1，测定各菌株的生长曲线见图4。
[0080]0.85%丁醇浓度的50ml LB液体培养基内进行培养，测得生长曲线如图4。由图可知，在0.85 % 丁醇的LB培养基中，大肠杆菌BW25113的生长受到了抑制，最高OD6。。为0.25，本轮的出发菌株Bwl.3(2) - 4最高OD600为0.31，Bwl.8 - 4、Bw2.0 -1的OD 6。。的最高值分别为0.35和0.31，BW25113,出发菌株Bwl.3(2) - 4、Bwl.8 - 4和Bw2.0 -1的最大比生长速率分别为0.248/h、0.339/h、0.379/h和0.355/h，其中，Bwl.8 -4的比生长速率最高。本轮改组得到的转化子中，细胞密度最高值和比生长速率最大的菌株为Bwl.8 - 4。保藏该菌株，见“生物材料样品保藏”。
【主权项】
1.大肠杆菌的易错全基因组改组方法，其特征是包括如下步骤: (1)基因组DNA提取:提取出发菌株大肠杆菌BW25113的基因组DNA; (2)易错PCR扩增全基因组: 取5 μ L的dNTPS母液、16.6 μ L的100uM10-17个碱基的随机引物、3 μ L的15mM的MnCl2、5yL 的 1X 突变 buffer、20ng 步骤(I)获得的基因组 DNA、2.5 μ L 的 2U/μ L TaqDNA聚合酶、补充无菌水至50 μ L ;所述dNTPS母液含1mM dCTP和dTTP、2mM dATP和dGTP ；所述 1X 突变 buffer 含 ImM ρΗ8.3 的 Tris-HCl，0.7mM MgCl2、5mM KC1、lg/100mL 甘油； 易错PCR反应条件:94°C预变性5分钟；92°C lmin，再在37°C的条件下退火lmin，再由37°C以每秒变化0.1°C的速度升至55°C，55°C延伸4min，进行50个循环，55°C补充延伸1min ； (3)全基因组改组:将步骤(2)获得的PCR产物通过乙醇沉淀浓缩10倍，制备出发菌株大肠杆菌BW25113的感受态细胞；取浓缩后的PCR产物3_5 μ L至50ul所述大肠菌的感受态细胞，1800V电击后加入LB液体培养基，混匀后转移到无菌离心管中于37°C静置培养1-2小时，涂布于丁醇浓度为1-1.6% V/V的LB固体培养基筛选平板，倒置放于培养箱37°C培养1-3天，得单克隆即转化子； (4)评价:挑取步骤(3)所述单克隆至LB液体培养基中于静置培养至对数晚期，保存菌液；分别接种上述单克隆的菌液和出发菌株大肠杆菌至LB液体培养基，培养至OD6。。为1.2-1.8 ;再分别转接至丁醇浓度为0.8% V/V的LB液体培养基，使各个菌株的初始接种浓度一致，测定生长曲线，筛选出耐丁醇的转化子； (5)第二轮全基因组改组，即转化子Bwl.3(2) - 4的改组:将步骤(4)中获得的丁醇耐受性最强的转化子Bwl.3(2) - 4进行第二轮的易错全基因改组；为提高外源易错PCR产物与基因组中的各个基因的重组效率，将含有Red重组酶基因的pKD46质粒从大肠杆菌BW25113菌中提取后重新转化到转化子Bwl.3 (2) - 4，获得含有pKD46质粒的Bwl.3(2) - 4的菌株，按照步骤⑴-⑶对含有口10)46质粒的加1.3(2) - 4的菌株进行全基因组改组，其中步骤(3)所述LB固体培养基筛选平板的丁醇浓度改为1.6-2.0% V/V，筛选得到单克隆即转化子； (6)第二轮全基因改组后获得转化子的丁醇耐受评价:挑取步骤(5)所述单克隆、大肠杆菌BW25113、转化子Bwl.3(2) - 4分别接种至LB液体培养基，培养至对数晚期，再分别转接至丁醇浓度为0.85% V/V的含丁醇的LB液体培养基，使各个菌株的初始接种浓度一致，测定生长曲线，筛选出耐丁醇能力更强的转化子。2.耐受丁醇的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌Bwl.8-4 (Escherichia coli)Bwl.8-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:M2015365。
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌的易错全基因组改组方法及耐受丁醇的大肠杆菌，耐受丁醇的大肠杆菌其分类命名为大肠杆菌Bw1.8-4(Escherichia？coli)Bw1.8-4，保藏号CCTCC？NO：M2015365。本发明的方法获得的耐受丁醇的大肠杆菌,能在0.85％V/V丁醇的LB液体培养基中高效的生长。本发明运用易错PCR技术实现无需理化诱变和原生质体融合即能快速有效获得耐受丁醇的大肠杆菌，避免了传统理化诱变菌带来的化学试剂和辐射的污染，也避免了连续驯化周期长的缺点,与传统的全基因组改组技术相比，本发明的方法获得的耐受丁醇的大肠杆菌比出发菌株耐受丁醇能力强。CCTCC NO：M201536520150619
【IPC分类】C12N15/10, C12R1/19, C12N15/87, C12N15/70, C12N1/21
【公开号】CN105002218
【申请号】CN201510468193
【发明人】马媛媛, 洪解放, 张敏华, 邹少兰
【申请人】天津大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月31日