8] 3、发酵罐培养基配方：酵母膏1~8g/L，玉米浆1~8g/L，蔗糖5~30g/L， KH2P044 ~15g/L，尿素 0· 5 ~4g/L，KN035 ~15g/L，NaC10. 5 ~2. 5g/L，121Γ灭菌 30 分钟。 其中，蔗糖和尿素分开单独灭菌，ll〇°C灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。另外配制75%葡 萄糖溶液，105 °C灭菌20分钟，发酵初期进行流加。
[0029] 以下实施例中使用了下面所列的菌体培养及发酵液处理方式：
[0030] 1、平板培养：在Yro平板上划线或涂布后倒置于30°C培养箱内，2-3天即可观察到 大而饱满的乳白色菌落形成。
[0031] 2、摇床培养：平板上接种单菌落至液体培养基中，或从液体培养基转接过来，30°C 摇床培养，转速保持在220转/分钟。
[0032] 3、发酵罐培养：可以比较实时精确控制发酵条件，如补料控制、pH控制、溶氧控制 和通气搅拌强度控制等等。第一阶段，发酵液pH控制在5~6. 8,同时流加葡萄糖溶液，为 菌体生长阶段；第二阶段，发酵液pH控制在7. 0~7. 8,同时流加底物（烷烃、脂肪酸或脂 肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等），以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不 产菌体，根据发酵情况继续流加底物（烷烃、脂肪酸或脂肪酸衍生物，如甲酯或乙酯等）。整 个发酵过程用IOM NaOH溶液自动流加控制pH，同时通过转速的调整使溶解氧保持在20~ 40%〇
[0033] 4、发酵液处理：发酵结束后，将发酵液加热至70~80°C，并维持60分钟；再加入 IOM NaOH将pH调至9~9. 5,用管式离心机或压滤除去菌体沉淀，保留上清；加入适量活性 炭脱色，温度保持在70~90°C，保温时间为60分钟；除去活性炭后，得到滤清液，用浓盐酸 或浓硫酸连续酸化至PH2. 5, 70~90°C保温2小时，冷却至30°C，离心或压滤，清水洗一遍， 清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到白色二元酸。
[0034] 实施例1 :菌株代谢工程改造
[0035] 1)基因组测序
[0036] 利用宝生物工程有限公司的基因组提取试剂盒（Yeast DNAiso Kit)制备长链二 元酸生产菌株假丝酵母基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。基因组DNA再经过文 库构建、新一代测序技术测序分析和数据组装等步骤。通过基因组注释和数据分析，获得了 生产菌株在二元酸生产相关的基因信息，挖掘了该菌在ω-氧化和β-氧化代谢途径相关 基因的编码序列。有研究表明（Microbiologyl54:3061-72, 2008)，假丝酵母里F0X2蛋白在 β -氧化代谢中间体跨膜运输过程中起作用，即跨越过氧化物酶体细胞器的膜。长链二元 酸生产菌株基因组里，Candida07204(2664bp)和CandidaA06446(2721bp)开放读码框编码 FOX2,序列相似性高达97%，上下游区域序列也高度相似，因而可以判断是一对等位基因。
[0037] 2)转录组测序
[0038] 利用德国凯杰公司的RNA提取试剂盒（RNeasy Mini Kit)制备长链二元酸生产菌 株假丝酵母的总RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。得到的总RNA再经过文库构建、转 录组测序及表达量分析。通过转录组数据分析，发现CandidaA07204和Candida06446这对 等位基因转录水平分别为3338. 5和4333. 2RPKM。这里，RPKM是基因表达量的一个计算方 法，表不Reads Per Kb Per Million Reads。其计算公式为
[0040] 设RPKM(A)为基因 A的表达量，则C为唯一比对到基因 A的reads数，N为唯一比 对到参考基因的总reads数，L为基因 A编码区的碱基数。RPKM法能消除基因长度和测序 量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可以直接用于比较基因表达差异。
[0041] 由于β -氧化是长链二元酸降解相关的代谢途径，菌种改造的目的是尽量避免二 元酸降解的发生。但是另一方面β-氧化对于菌体正常生理代谢和能量供应是必需的。 因此，希望通过基因工程的手段来抑制而不是完全阻断β -氧化，达到既不影响菌体正常 生长和长链二元酸的合成，又避免合成的长链二元酸被降解的目的。CandidaA07204和 Candida06446是二倍体DC12的一对等位基因，编码F0X2蛋白，在二元酸降解过程中负责 β -氧化代谢中间体的跨膜运输。因此，利用代谢工程手段，敲除该对等位基因其中的一个 拷贝，使得β -氧化代谢中间体在过氧化物酶体内积累，通过反馈抑制以达到抑制二元酸 降解的功效，从而达到更加有效累积二元酸的目的。
[0042] 3)基因敲除实验流程如图3所示。引物设计原则，同源臂和检测引物的设计都选 择在Candi daA07204和Candi da06446的比对中完全相同的区域，从而达到两个等位基因敲 除和检测具有同等的概率。在长引物F0X2-F和F0X2-R的5'端为同源臂序列，对应于基因 敲除位点的上游和下游序列。这两个长引物的3'端分别与敲除模块（deletion cassette) 的上游和下游配对。PCR扩增后得到的DNA片段，两头分别带上下游同源臂，中间为抗性筛 选标记。
[0043] 扩增的DNA片段经纯化后进行电转化导入菌体细胞内，DNA片段的上下游同源臂 与菌体染色体上的靶位点发生双交换，达到基因敲除的目的。由于这种双交换是小概率事 件，需要建立方法来进行筛选。这里所使用到的抗性基因是Satl，编码诺尔斯菌素乙酰转 移酶。二元酸生产菌株对诺尔斯菌素（又叫clonNAT或NTC)这种药物敏感，在含诺尔斯菌 素的平板上不能生长，而表达该酶后菌体能够分解诺尔斯菌素，避免致死效应。抗性筛选标 记只有整合到染色体上去才能得到表达，发挥作用，使得菌体能够在含抗性的培养基平板 上生长，并形成菌落。同时对具有抗性的菌落，进行纯化和验证。
[0044] 验证时，使用到一对检测引物F0X2-U和F0X2-D，分别与靶位点的上游和下游区域 配对。如果没有同源重组发生，通过这一对等位基因为模版扩增出来的片段在长度上是一 样的，在琼脂糖电泳中只能观察到一条带。如果其中一个等位基因由于双交换事件被抗性 基因片段替换了，那么经过扩增得到的片段长度就发生变化，在琼脂糖电泳中可以观察到 两条带。经过验证的菌株，再通过发酵实验验证代谢工程改造获得新菌株在二元酸生产方 面是否有性能上的优势。
[0045] 4) PCR 扩增
[0048] 其中，质粒pSFS2,参考文献为Gene(2004)341:119 - 127，GeneBank数据库的登录 号为：AY524979,来源于中国科学院微生物所。
[0049] PCR扩增所用引物为F0X2-F和F0X2-R。DNA聚合酶是宝生物工程有限公司的 Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，活性单位均为5U/ μ 1。
[0050] PCR循环条件为：
[0051] 94度2分钟 （预变性阶段）
[0052] 94度20秒，58度20秒，72度1~6分钟（30个循环扩增阶段）
[0053] 72度10分钟 （最后延伸阶段）
[0054] 5) DNA 纯化
[0055] 反应结束后，取5 μ 1上述PCR样品进行琼脂糖电泳检测，证明扩增所得的DNA片 段大小与预计的一样，而且没有杂带，进行两步纯化和浓缩，为后面的转化准备DNA样品。
[0056] 第一步是利用PCR纯化试剂盒（购自Omega公司），按照说明书进行。一般是50 μ 1 体系，做4管，总体积共200 μ 1，PCR纯化的最后一步用50或100 μ I TE缓冲液洗脱柱子。 纯化后的DNA，用NanoDrop仪器测浓度，计算得到的DNA总量约为20 μ g。
[0057] 第二步是将纯化的DNA再用乙醇/醋酸钠/糖原处理进行沉淀。具体做法是：往