上述溶在TE缓冲液的DNA溶液加入1 μ 1糖原（20mg/ml)、100 μ 1醋酸钠（3M，ρΗ5· 2)和 Iml预冷的无水乙醇；放置-80摄氏度冰箱冷却30分钟；4度离心机，14000转/分的转速 下，离心10分钟，留沉淀；沉淀再用75%预冷的乙醇洗两遍；超净台里风干；4摄氏度冰箱 储存，电转之前重悬在10 μ 1超纯水备用。
[0058] 6)感受态制备及电转
[0059] 从新鲜活化的平板上挑出发菌株（Candida sp. DC12,参见《微生物学报》20 (1): 88-93, 1980,正烷烃发酵生产长链混合二羧酸，可从中国科学院微生物所购买）的单菌 落于3ml液体YH)培养基中，30 °C摇床培养过夜，转速为220转/分钟；2 %转接于20ml YPD，30°C摇床培养，220转/分钟，至0D600达到1. 8 ;将菌液置于冰上静置15分钟，使其 停止生长，4000转/分钟，4°C离心3分钟，留菌体沉淀；用4ml预冷无菌水洗一次；4000转 /分钟，4°C离心3分钟，留菌体沉淀；加入4ml TE/0.1 M LiOAc, 150转/分钟，30°C的摇床内 振荡90分钟；加入0.1 mllM DTT，继续150转/分钟、30°C的摇床箱内振荡30分钟；4000转 /分钟，4°C离心3分钟，留菌体沉淀；加入4ml预冷无菌水，洗3次；加入2mlIM山梨醇，洗1 次，4000转/分钟，4°C离心3分钟；弃上清，加入120 μ 1山梨醇将细胞悬起；取出40ul的细 胞悬液于I. 5ml离心管，加入5 μ 1上述纯化后重悬在无菌水的PCR扩增产物（约10 μ g)， 混匀，置于冰上5分钟；转入预冷的电转杯中，擦干电转杯，进行电转（电转条件为：2mm狭 缝的电转杯，电压为1800伏，电击时间为5毫秒）；电转后立刻加入1ml山梨醇，混匀后吸 出放到1.5ml的离心管中；4000转/分钟离心3分钟，弃上清，加入1ml YH)培养基，37°C 的摇床内培养2小时；4000转/分钟离心3分钟，弃上清，加100 μ I YPD重悬菌体，涂布平 板（YPD+clonNAT)，放到30°C培养箱内培养至单菌落出现。
[0060] 7)筛选抗性菌落
[0061] 将上述抗性平板上长出的单菌落分别接种到Iml YH)培养基的离心管中，加 clonNAT至终浓度为100 μ g/ml，220转/分钟，30°C摇床培养。出现生长，说明带有抗性，证 明抗性基因已经整合到菌体基因组中并发挥作用，这部分菌落用于下一步验证。没有出现 生长的菌落，说明是假阳性，等同于出发菌株，停止处理。
[0062] 8)鉴定
[0063] 上面出现生长的抗性菌落，接种YH)液体培养基培养过夜，吸取500 μ 1菌液，利用 宝生物工程有限公司的基因组提取试剂盒制备基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进 行。以获得的基因组DNA为模版，F0X2-U和F0X2-D为引物进行PCR扩增，具体反应体系及 反应条件参照本实施例1的第4)条。如果靶位点上的等位基因没有被敲除，从两条等位染 色体上扩增出来的DNA片段大小一样，在琼脂糖电泳上表现为一条带。如果靶位点上其中 一个等位基因被敲除，从两条等位染色体上扩增出来的DNA片段大小不一样，在琼脂糖电 泳上表现为两条带（见图3)。鉴定为抗性阳性并且靶位点被敲除的菌液，再进一步经菌落 纯化和相同方法的鉴定，得到本发明的长链二元酸生产菌株TDTC023。
[0064] 实施例2 :长链二元酸的发酵生产
[0065] 菌种通过常规的斜面培养后，接入50ml -级种子培养16小时，然后将一级种子培 养转接入500ml二级种子培养16小时。
[0066] 种子培养基的配方：酵母膏1~8g/L，玉米衆1~8g/L，鹿糖5~25g/L， KH2P044~12g/L，尿素 (λ 5~4g/L，重蜡40~70g/L，121°C灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿 素分开单独ll〇°C灭菌20分钟，灭菌后再合并混匀。
[0067] 二级种子发酵完成后，转接入5L发酵罐。发酵罐培养基配方：酵母膏1~Sg/ L，玉米衆 1 ~8g/L，鹿糖 5 ~30g/L，KH2P044 ~15g/L，尿素 0· 5 ~4g/L，KN035 ~15g/L， NaClO. 5~2. 5g/L，121°C灭菌30分钟。其中，蔗糖和尿素分开单独灭菌，IKTC灭菌20分 钟，灭菌后再合并混匀。另外配制75 %葡萄糖溶液，105°C灭菌20分钟，发酵初期进行流加。 基础培养基为4L。在30°C以1 :0. 5的通气体积，控制pH5. 5~6. 5,在第16小时后开始以 50ml/h的速度流加十二碳直链烷烃，发酵时间为144-156小时。整个发酵过程用IOM NaOH 溶液自动流加控制pH，同时通过转速的调整使溶解氧保持在30%。
[0068] 如图4和图5所示，HPLC分析表明出发菌株DC12和改造菌株TDTC023发酵得到 的长链二元酸产物一致，纯度在98%以上。
[0069] 从下表可以看出，改造后的菌株，转化率也得到提高。
[0072] 实施例3
[0073] 按照实施例2的方法，只是底物从十二碳直链烷烃改为月桂酸甲酯。
[0075] 实施例4
[0076] 按照实施例2的方法，只是底物从十二碳直链烷烃改为月桂酸乙酯。
【主权项】
1. 一种长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌（Candida sp.)TDTC023,其保 藏编号为：CGMCC No. 8929。2. 根据权利要求1所述的长链二元酸生产菌株，其特征在于所述假丝酵母菌的等位基 因CandidaA07204和CandidaA06446之一被敲除，所述等位基因的碱基序列如序列表的序 列5和序列6所示。3. 如权利要求1所述的长链二元酸生产菌株的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 准备引物 F0X2-F 和 F0X2-R ; (2) 准备长链二元酸生产菌株感受态细胞； (3) 使用步骤（1)中的引物进行扩增clonNAT抗性基因，利用扩增的产物对菌种中的等 位基因CandidaA07204和CandidaA06446之一进行敲除，所述等位基因的碱基序列如序列 表的序列5和序列6所示； (4) 通过PCR扩增、纯化、电转、筛选、鉴定，得到本发明的长链二元酸生产菌株。4. 根据权利要求3所述的长链二元酸生产菌株的制备方法，其特征在于所述筛选步骤 中使用的筛选标记为clonNAT。5. 根据权利要求3所述的长链二元酸生产菌株的制备方法，其特征在于所述步骤（2) 中的长链二元酸生产菌株为假丝酵母（Candida sp.)DC12。6. 如权利要求1所述的长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用。7. 如权利要求6所述的长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用，其特征在于 发酵结束后，将发酵液加热至70~80°C ;再将pH调至9~9. 5,除去菌体沉淀，保留上清； 脱色，温度保持在70~90°C，得到滤清液，用酸酸化至pH2. 5, 70~90°C保温，冷却，离心或 压滤，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到长链二元酸。
【专利摘要】本发明涉及一种长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用，其解决了现有长链二元酸菌种改造效果不显著的技术问题，其分类命名为假丝酵母菌(Candida？sp.)TDTC023，其保藏编号为：CGMCC？No.8929。本发明可广泛用于长链二元酸的制备领域。<pb pnum="1" />CGMCC NO892920140318
【IPC分类】C12R1/72, C12N1/19, C12P7/64, C12N15/87
【公开号】CN105018363
【申请号】CN201410176116
【发明人】赖小勤, 晏礼明, 杨勇, 张子娟, 陈远童, 陶勇, 傅深展
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年4月28日