径乙基）-4-亚硝基苯胺）;5% (w/w) 聚乙締化咯烧酬，pH7和20化25ml憐钢酸 C.)通过添加25化各自的糖底物溶液，且随后将板W1000巧m振荡共1分钟来起始 反应 d.)使用微孔板阅读器在700nm处监控憐钢酸还原的动力学。
[0089] 在本公开内容的上下文中，表达"对于葡萄糖特异性或对于底物葡萄糖特异性"指 示：当通过如下文材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时，本文提供的(X)x对于底 物葡萄糖100%的活性。言下之意，当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测 定进行测定时，本文提供的GOx对于除葡萄糖外的糖例如半乳糖、麦芽糖、木糖和麦芽=糖 的残留活性< 6%。
[0090] 在设及上述方面中任一个的另一个方面，本发明提供了 (X)x变体，当借助于介质 测定与根据SEQIDNO: 1的(X)x的亚硝基苯胺介质活性相比较时，所述(X)x变体显示出对 于用于电子转移的亚硝基苯胺介质〉400%、或〉500%、或〉600%的活性，所述介质测定包 括下述步骤： a. )将75化酶溶液样品转移至96孔平底微孔板 b. )加入100化介质溶液（19. 05mlN，N-双（2-径乙基）-4-亚硝基苯胺）;5% (w/w) 聚乙締化咯烧酬，pH7和20化25ml憐钢酸 C.)通过添加25化葡萄糖底物溶液，且随后将板W1000巧m振荡共1分钟来起始反 应 d.)使用微孔板阅读器在700nm处监控憐钢酸还原的动力学。
[00川和当借助于ABTS测定与根据SEQIDNO: 1的(X)x的氧活性相比较时，《30%、或 < 25%、或< 20%，且特别是< 15%、或《10%的氧活性，所述ABTS测定包括下述步骤： a. )将75化样品酶溶液转移至含有100化憐酸盐缓冲液（pH7)的96孔平底微孔板 b. )将20化反应混合物加入每个孔，导致下述浓度：0. 91U/mLHRP(辣根过氧化物 酶）；2. 3mlABTS(2, 2' -联氮-双（3-乙基苯并嚷挫嘟-6-横酸)） C.)通过添加25化葡萄糖底物溶液，且随后将板W1000巧m振荡共30秒来起始反应d.)使用微孔板阅读器在414皿处动态测定ABTS的氧化。
[0092] 在另一个方面，本发明的主题设及经分离的多核巧酸，其编码根据上述方面中任 一个的(X)x变体或其活性片段。
[0093] 在另一个方面，本发明提供了根据本发明的(X)x变体的活性(功能)等价物/片段。
[0094] 术语"其一种或多种活性等价物/ 一个或多个片段"或同义词"其一种或多种功能 等价物/ 一个或多个片段"指依照本发明的任何经修饰的和因此优化的(X)x变体，由此如在 根据SEQIDNO: 1的相应序列中，至少一个氨基酸缺失或由另一个氨基酸置换，前提是此 类一种或多种等价物/ 一个或多个片段仍显示出关于酶活性、酶特异性和显著降低的耗氧 率和/或对于除氧外的特定介质显著增加的活性的基本特性，通过具有根据SEQIDNO: 1 的至少置换T30V和I94V的存在，并且进一步具有在选自根据SEQIDNO: 1的S53;A137; A173 ;A332 ;F414 ;和V560的位置中的至少一个另外的氨基酸置换。
[0095] 在本发明的特定方面，根据本发明的(X)x变体的一种或多种功能等价物/ 一个或 多个片段包含一种或多种氨基酸序列，其与根据SEQIDNO: 2至SEQIDNO: 9的序列至 少70%同源，特别是至少80%同源或〉90%同源。
[0096] 在另一个方面，本发明的主题设及通过根据本发明的(X)x变体或其活性片段来检 巧。、测定或测量先体外后体内样品中的葡萄糖的方法；所述检测、测定或测量包括使先体外 后体内样品与所述(X)x或其活性片段接触。
[0097] 在设及上述方面的另一个方面，所述葡萄糖检测、测定或测量使用传感器或测试 条装置执行。
[0098] 本发明还设及用于生产本发明的(X)x变体的方法，编码所述酶的核酸，载体，宿主 细胞W及使用所述酶检测、测定或测量样品中的葡萄糖的方法，W及同样包含所述酶的装 置。
[0099] 在特定方面，本发明提供了用于测定样品中的葡萄糖的装置，其包含本发明的GOx 变体中的至少一种和除氧外的电子介质。
[0100] 在本发明的另一个特定方面，除氧外的一种或多种电子介质选自亚硝基苯胺及其 衍生物、偶氮化合物、吩嗦及其衍生物、吩嚷嗦及其衍生物、吩嗯嗦及其衍生物、二茂铁及其 衍生物、铁氯化钟、Ru-和Os-络合物、酿及其衍生物。
[0101] 设及上述方面中任一个的主题的本发明的另一个特定方面是(X)X变体，除根据 沈QIDNO: 1的两个置换T30V和I94V之外，其还具有在选自沈QIDNO: 1的A173;A332; F414 ;和V560的四个位置中的至少一个另外的氨基酸置换。
[0102] 由本发明预期的本文提供的(X)x变体的主要应用之一是其在测试条中的用途，W 监控糖尿病患者的先体外后体内样品中的血糖水平。当然，可W研究许多种类的样品。特 别地，体液如血液、血清和血浆是此类样品的来源。
[0103] 因此，在另一个方面，本发明提供了具有本发明的(X)x变体中的至少一种的酶电 极，其固定在所述电极上。
[0104] 在另一个方面，本发明提供了用于测定葡萄糖的酶传感器，其包括本发明的酶电 极作为工作电极，且因此具有本发明的(X)X变体中的至少一种。
[0105] 在另外一个方面，本发明提供了用于测定样品中的葡萄糖的试剂盒，其包括根据 本发明的至少一种(X)X变体和除氧外的电子介质。
[0106] 用于测量葡萄糖的试剂盒可W使用本发明的至少一种(X)x变体进行构建。除本发 明的(X)x变体之外，试剂盒含有测量必需的缓冲液，除氧的适当电子介质特别是亚硝基苯 胺介质，和需要时的酶例如过氧化物酶，W及用于制备校准曲线的葡萄糖标准溶液和使用 说明书。
[0107] 样品中的葡萄糖浓度可W通过测量由酶反应生成的电子量进行测定。多种传感器 系统是本领域已知的，包括碳电极、金属电极和销电极。将本发明的GOx变体固定到电极 上。用于固定的方法的例子包括交联、封装到大分子基质内、用透析膜包被、光学交联聚合 物、导电聚合物、氧化还原聚合物及其任何组合。
[010引测定装置可W具有与用于监控血糖水平，常规商购可得的安培测量生物传感器测 试条中的任一种相似的结构。此类装置的一个例子具有置于绝缘基材上的两个电极(工作 电极和参考或对电极)、试剂端口和样品接收器。试剂端口含有本发明的(X)x变体和除氧外 的介质。当样品例如血样加入样品接收器时，样品中含有的葡萄糖将与GOx变体反应，从 而电子转移指示样品中的葡萄糖量。例如根据W0 2004/113900和US5, 997, 817,适合测 定酶底物的电化学传感器的典型例子是已知的。作为电化学传感器的替代物，可W使用光 学检测技术。通常，此类光学装置基于试剂系统中发生的变色，所述试剂系统包含酶、电子 介质和指示剂。变色可W使用巧光、吸收或减轻（remission)测量进行定量。例如根据US 7, 008, 799;US6, 036, 919和US5, 334, 508,适合测定酶底物的光学装置的典型例子是已 知的。
[0109] 在另一个方面，本发明提供了含有经分离的多核巧酸的表达载体，所述经分离的 多核巧酸编码根据本发明的(X)X变体或其活性片段。
[0110] 在另一个方面，本发明提供了包含含有经分离的多核巧酸的表达载体的宿主细 胞，在本文中也称为转化体，所述经分离的多核巧酸编码根据本发明的GOx变体或其活性 片段。
[0111] 在另一个方面，本发明提供了用于生产根据本发明的(X)X变体或其活性片段的方 法，该方法包括培养上述转化体。
[0112] 在另一个方面，本发明提供了可通过上述方法获得的根据本发明的(X)x变体或其 活性片段。
[0113] 在另一个特定方面，本文提供的表达载体优选包含编码本发明的(X)x变体的DNA 序列之一的全部或一部分。
[0114] 含有本文提供的(X)x变体的编码和控制序列的合适表达载体可W使用本领域已 知的标准DNA技术进行构建，所述标准DNA技术中的许多在Sambrook等人，in"Molecular Cloning:ALaboratoryManual"(1989)，ColdSpringHabor，NYColdSpringHabor L油oratoryPress中描述。
[0115] 合适的宿主细胞包括例如可得自Promega(2800WoodsHollowRoad,Madison, WI，USA)的大肠杆菌（j5： 皿 10UATCC33694)，可得自StratagenedlOllNodhTorrefy PineRoad,La化lla，CA，USA)的)(L1-BlueMRF'等。合适的毕赤酵母属（巧cAia)宿主细 胞包括例如，可得自Invitrogen(5791VanAllanWay,Carlsbad,CA92008，USA)的己斯 德毕赤酵母（CjOa別o'is)X3 3或己斯德毕赤酵母KM71H。
[0116] 根据本发明的(X)x变体的重组生产可W在本领域已知的宿主中进行。合适 的宿主可W选自丝状真菌菌株，例如黑曲霉、酱油曲霉（AsjOe'巧sojae)和米曲霉 Uwer知合适的宿主可W选自酵母菌株，如例如己斯德毕赤酵母、酿酒酵 母和多形汉逊酵母（偏nsenuia/7〇妙膨巧片3)。
[0117] 在另一个特定方面，通过在酵母特别是酿酒酵母中表达编码所述(X)x变体的多核 巧酸，可获得根据本发明的GOx变体或其功能等价物。
[011引表达载体可W通过本领域已知的多种方法引入宿主细胞内。例如，通过聚乙二醇 介导的原生质体转化方法（Sambrook等人1989,同上)，可W进行用表达载体转化宿主细 胞。然而，还可W采用用于将表达载体引入宿主细胞内的其他方法，例如电穿孔、弹道DNA 注射或原生质体融合。
[0119] 一旦含有根据本发明的(X)x变体的表达载体已引入适当宿主细胞内，宿主细胞就 可W在允许根据本发明的所需(X)x变体表达的条件下进行培养。通过例如抗生素选择或 营养突变体的互补和从最小培养基中选择，可W容易地鉴定含有所需表达载体(且因此具 有编码根据本发明的GOx变体的DNA序列）的宿主细胞/T; K化/556心/ "MolecularCloning:alaboratorymanual",第3版，ColdSpringHarbor,NewYork。本文提供的(X)x变体的表达可w通过本领域技术人员已知的不同方法进行鉴定， 如测量GOxmRNA转录物的生产，免疫检测基因产物或检测基因产物的酶促活性。特别地， 酶促测定应如条目ff)下的材料与方法部分中的介质测定下概述的应用。另外，当如条目 gg)下所述的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时，通过如依照本发明显著降低 的耗氧率，可W鉴定本文提供的(X)x变体。
[0120] 在本发明的另一个方面，通过在表达编码本发明的(X)x变体之一的DNA序列的宿 主细胞中生产，可获得本文描述的用于本发明的(X)x变体的多肤。通过由编码本发明的GOx 变体之一的DM序列编码的mRNA的体外翻译，还可W获得本发明的多肤。例如，DM序列 可W插入合适的表达载体内，所述表达载体依次又可W用于体外转录/翻译系统中。
[0121] 包含如上定义和描述的经分离的多核巧酸的表达载体代表本发明的另一个特定 方面，所述经分离的多核巧酸可操作地连接至能够促进其在无细胞的肤合成系统中的表达 的启动子序列。
[0122] 例如通过如上所述的操作产生的多肤随后可W使用多种常规蛋白质纯化技术进 行分离且纯化。例如，可W采用层析操作例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。
[0123] 在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含根据本发明的至少一种(X)x变 体或其活性片段。
[0124] 在另一个方面，根据本发明的(X)x变体保留其对于底物葡萄糖特异性的固有特 性，但当通过如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时，由于除根据 SEQIDNO: 1的置换T30V和I94V之外，氨基酸序列中的特定位置中的至少一个另外的氨 基酸置换，最大限度的残留氧活性降低至《30%。伴随地，当通过如条目ff)下的材料与方 法部分中概述的介质测定进行测定时，本文提供的(X)x变体显示出对于除氧外的电子介质 〉400%、或〉500%、或〉600%的酶活性。
[01巧]考虑到上文，本发明在本文提供的(X)x变体中组合 i)G化的葡萄糖特异性特性 ii) 与GDH的氧不依赖性酶活性特性 经由从氧化酶活性朝向脱氨酶活性的转变 iii)和任选对于除氧外的某些电子介质增加的活性， 用于实现准确的葡萄糖测量，特别是准确的血糖测量。
[0126] 在根据本发明的(X)x变体的上下文中，表达"从氧化酶活性朝向脱氨酶活性的转 变"指示 ?当通过如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时，根据本发明 的(X)x变体的氧活性从作为参考的G0X-T30V;I94V的1. 0开始朝向《0. 3、或< 0. 25、或< 0. 2,特别是< 0. 15、或《0. 1残留氧活性的减少，和 ?当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时，根据本发明 的0化变体的脱氨酶活性从作为参考的G0X-T30V;I94V的介质活性1. 0开始朝向至少1. 5 介质活性的伴随增加。
[0127] 上述值代表在氧活性和介质活性方面本发明的(X)x变体的酶活性，W及作为参考 的G0x-T30V;I94V的各自酶活性之间的比例馈数)。当通过如条目ee)下的材料与方法部 分中概述的化ISA进行测定时，比例（商数）基于两种(X)x活性扣/mg]表示的氧活性和 介质活性)。
[0128] 根据本发明，根据序列SEQIDNO: 11至SEQIDNO: 17的核酸分子各自编码经修 饰的多肤或其片段，其衍生自编码根据SEQIDNO: 1的多肤的SEQIDNO: 10(G化-T30V; I94V)〇
[0129] 如本文使用的，术语"G化-T30V;I94V"指示基于根据沈QIDNO: 2的黑曲霉野 生型（WT)序列的GOx，其进一步具有在其多肤序列即SEQIDNO: 1中的两个置换T30V和 I94V。
[0130] 如本文使用的，术语"G化双重突变体"相等地指示基于根据SEQIDNO: 2的黑曲 霉WT序列的GOx，其进一步具有在其多肤序列即SEQIDNO: 1中的两个置换T30V和I94V。 所述(X)x双重突变体衍生自Zhu等人（2006 ;2007)。
[0131] 根据本发明，对应于沈QIDNO: 1的核酸分子（即沈QIDNO: 10)用于进一步 改善根据本发明的GOx酶的动力学特性，特征在于从氧化酶活性朝向脱氨酶活性的转变。 运通过本发明人经由特异性核巧酸序列修饰来实现，导致在位置S53 ;A137 ;A173 ;A332 ; F414;和V560的至少一个中的氨基酸置换，而两个置换T30V和I94V根据SEQIDNO: 1已 经存在。
[0132] 在另一个方面，本发明提供了(X)x变体，除根据SEQIDNO: 1的两个置换T30V和 I94V之外，其还具有在选自沈QIDNO: 1的S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560的六个 位置中的另外两个、或=个、或四个、或五个或六个氨基酸置换，从而显示出对(X)x酶活性 的协同作用。
[013引在本发明的上下文中，表达"对0化酶活性的协同作用"指示除根据SEQIDNO: 1 的两个置换T30V和I94V之外，在位置S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560中的至少两个 另外的氨基酸置换，具有在减少(X)x耗氧率方面对(X)x酶活性的作用。
[0134] 进一步地，在本发明的上下文中，"对(X)x酶活性的协同作用"指示除根据SEQID NO: 1的两个置换T30V和I94V之外，在位置S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560中的至 少两个另外的氨基酸置换，具有在减少(X)x耗氧率和/或增加对于除氧外的电子介质的GOx 介质活性方面对G化酶活性的作用。
[013引另外，在本发明的上下文中，"对(X)x酶活性的协同作用"指示除根据SEQIDNO: 1的两个置换T30V和I94V之外，在位置S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560中的至少两个 另外的氨基酸置换，具有在接受除氧外的某些电子介质用于电子转移方面对(X)x酶活性的 作用。在特定方面，本发明提供了(X)x变体，除根据SEQIDNO: 1的两个置换T30V和I94V 之外，其还具有在F414和V560位置中由剩余19种蛋白源氨基酸中任一种的另外的氨基酸 置换，与在位置A137 ;A173 ;和A332中由剩余19种蛋白源氨基酸中任一种的氨基酸置换组 厶1=1 0
[0136] 在特定方面，本发明提供了 0化变体，除根据SEQIDNO: 1的两个置换T30V和 I94V之外，其还具有在F414和V560位置中由剩余19种蛋白源氨基酸中任一种的另外的组 合氨基酸置换。
[0137] 本发明的另一个特定方面设及上述方面，并且提供了GOx变体，除根据SEQIDNO: 1的两个置换T30V和I94V之外，其还具有另外的组合氨基酸置换F414M或F414V和V560P 或V560L。
[0138] 在进一步的特定方面，本发明提供了 0化变体，除根据SEQIDNO: 1的两个置换 T30V和I94V之外，其还具有另外的氨基酸置换F414M或F414V，与一个或多个氨基酸置换 V560P或V560L和 / 或A13化和 / 或A173I或A173V和 / 或A332S或A332V或A332T组合。
[0139] 在进一步的特定方面，本发明提供了 0化变体，除根据SEQIDNO: 1的两个置换 T30V和I94V之外，其还具有另外的氨基酸置换F414M或F414V，与一个或多个氨基酸置换 V560P或V560L和 / 或A13化和 / 或A173I或A173V和 / 或A332S或A332V或A332T组合。
[0140] 本发明的另一个特定方面设及上述方面，并且提供了 (X)x变体，除根据SEQIDNO: 1的两个置换T30V和I94V之外，其还具有选自上述置换中任一个的至少两个组合的氨基酸 置换。
[0141] 对于除氧外的电子介质的(X)x特异性可W通过如条目ff)下的材料与方法部分中 概述的介质测定进行测定。
[0142] 在另