一个特定方面，本发明提供了 0化变体，当通过如条目ff)下的材料与方法部 分中概述的介质测定进行测定时，其对于电子介质N，N-双（2-径乙基）-4-亚硝基苯胺具 有〉400%、或〉450%、或〉500%、或〉550%、或甚至〉600%的介质活性。
[0143] 在另一个特定方面，本发明提供了 0化变体，当借助于如条目gg)下的材料与方法 部分中概述的ABTS测定，与GOx-WT相比较或与根据SEQIDNO: 1的G0X-T30V;I94V相比 较时，对于作为电子受体的氧具有降低至少5倍的活性，或对于作为电子受体的氧具有降 低至少6倍的活性，或对于作为电子受体的氧具有降低至少7倍的活性。
[0144] 在另一个特定方面，本发明提供了 0化变体，当通过如条目gg)下的材料与方法 部分中概述的ABTS测定进行测定时，其具有GOxWT氧化酶活性或根据SEQIDNO: 1的 G0X-T30V;I94V氧化酶活性的《30%剩余氧化酶活性，或特别具有GOxWT氧化酶活性或根 据SEQIDNO: 1的G0X-T30V;I94V氧化酶活性的< 20%或< 15%剩余氧化酶活性，或甚 至更特别具有GOxWT氧化酶活性或根据SEQIDNO: 1的G0X-T30V;I94V氧化酶活性的< 10%剩余氧化酶活性。
[0145] 在本发明的另外特定方面，如SEQIDNO: 11至SEQIDNO: 17中给出的核酸分 子的功能等价物/片段是相应的RNA分子，其由所述DNA序列或与SEQIDNO: 11至SEQ IDNO: 17的序列基本上互补的序列编码。
[0146] 在本发明的上下文中，术语"RNA分子"意指核糖核巧酸分子的线性聚合物，其是单 链的，且充当根据SEQIDNO: 3至SEQIDNO: 9的本文提供的(X)x变体的蛋白质合成模 板。
[0147] 在本发明的进一步特定方面，同源性程度或百分比是与SEQIDNO: 3至SEQID NO: 9至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或至少99%或100%，条件是它们显示 出与说明书自始至终概述的相同的置换，并且进一步显示出如根据本发明的(X)x变体相同 的特性，所述必需特性是酶活性、对于葡萄糖的酶特异性和显著降低的耗氧率和/或对于 除氧外的特定介质显著增加的活性。
[014引序列同一性可W通过BLAST算法，基本局部比对捜索工具（BLAST) /心fsc如5：F.等人 1990.J.Mol.Biol. 215:403;AltschuLS.F.等人 1997.NucleicAcidRes. 么J.?义议9-进似7进行测定。本文提及的氨基酸序列同一性百分比指通过所述BLAST算法测 定序列同一性，其中在其上测定同源性的区域是本发明的(X)x变体的整个序列。序列同一 性可W通过本领域技术人员已知的用于序列比对和比较目的的任何其他方法进行测定。
[0149] 本领域技术人员应当理解本文提供的(X)x变体可W具有或不具有不同于上述置 换的进一步修饰，而不改变所述(X)x变体的必需特性，即如在本发明的意义中的对于葡萄 糖的特异性、显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的特定介质显著增加的活性。
[0150] 本发明的另一个特定方面是经分离的多核巧酸，其编码根据本发明的(X)x变体或 其活性等价物/片段。经分离的多核巧酸可W是编码如部分-序列表中明确列出的下述 序列（即沈QIDNO: 11至沈QIDNO: 17)的DNA或RNA分子或其相应基因。
[0151] 在另一个特定方面，当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进 行测定时，通过在30°C至47°C范围内具有至少70%特别是至少80%的残留酶活性，由本发 明提供的(X)x变体显示出溫度稳定性。
[0152] 在另一个特定方面，当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进 行测定时，通过在48°C至60°C范围内具有至少10%的残留酶活性，由本发明提供的(X)x变 体显示出溫度稳定性。
[0153] 本发明的(X)x变体可多种形式提供，例如作为冷冻干燥试剂或适当的胆存溶 液中的溶液。
[0154] 本文提供的(X)x变体占优势地预期用于在更准确的糖尿病血糖测试装置中应用。 具体地，仅通过显著降低的耗氧率，本发明的氧不依赖性(X)x变体利用氧用于电子转移，运 意指当通过如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时，对于氧的残留 G化活性是《30%、或< 25%、或< 20%，特别是< 15%、或《10%。相应地，显著量的葡萄糖 在用于更准确的血糖测量的介质相关反应中反应，而与血样中的溶解氧含量的反应显著降 低。当动脉、静脉或毛细血管血液是用于测量的来源，或在超过海平面的不同高度测量血糖 浓度的情况下时，运对于糖尿病患者是有利的。
[0155] 在另一个方面，本发明提供了 (X)x变体，其显示出显著降低的耗氧率和/或对于 除氧外的电子介质显著增加的介质活性，运也导致糖尿病患者由其获益的更准确的血糖测 量。
[0156] 定义 在本说明书的上下文中，表达"氧依赖性的"和"氧依赖性"指示：当通过如条目gg)下 的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时，特征在于残留氧活性〉30%的(X)x活 性。
[0157] 相比之下，表达"氧不依赖性的"和"氧不依赖性"指示：当通过如条目gg)下的材 料与方法部分中概述的ABTS测定进行测定时，特征在于残留氧活性《30%、或< 25%、或< 20%，特别是< 15%、或< 10%的GOx活性。
[015引在本说明书的上下文中，表达"对于葡萄糖非特异性"指示：当通过如条目ff)下 的材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时，对于底物葡萄糖< 100%、或< 99. 9%、或 < 99.5%的(X)x活性。言下之意，当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定 进行测定时，"对于葡萄糖非特异性的"G化显示出对于除葡萄糖外的糖(例如半乳糖、麦芽 糖、木糖和麦芽S糖）〉6%的(X)x活性。
[0159] 与本发明的0化变体有关的术语"经修饰的"或"修饰"指0化蛋白质，除根据SEQ IDNO: 1的两个置换T30V和I94V之外，其含有在根据SEQIDNO: 1的多肤序列中，在位 置S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560中的至少一个另外的氨基酸置换。该术语还指示 编码此类"经修饰的"G化变体的各自多核巧酸或其序列保守变化。
[0160] 多核巧酸序列的"序列保守变化"是其中给定密码子位置中的一个或多个核巧酸 的变化导致在该位置处编码的氨基酸不改变。
[0161] 术语"G化变体"指示根据本发明的葡萄糖氧化酶具有根据SEQIDNO: 1的两 个氨基酸置换T30V和I94V，W及在根据SEQIDNO: 1的多肤序列中，在位置S53 ;A137 ; A173 ;A332 ;F414 ;和V560中的至少一个另外的氨基酸置换，特征在于显示出对于底物葡萄 糖的酶特异性，W及显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的特定介质显著增加的活性。
[0162] 应当理解本说明书自始至终的氨基酸序列的编号在初始S(Ser、丝氨酸)处 开始，如根据SEQIDNO: 1的成熟G0X-T30V;I94V蛋白质中。
[0163] 依照本发明的术语"酶"意指整个或大部分由蛋白质或多肤组成的任何物质，其或 多或少特异性地催化或促进一种或多种化学或生物化学反应。术语"酶"还可W指催化多 核巧酸(例如RNA或DNA)。
[0164] 术语"氧化反应"在一般术语中意指设及对底物添加氧的化学或生物化学反应，W 形成加氧或氧化底物或产物。氧化反应通常伴随还原反应（因此，术语"氧化还原"反应包 含氧化和还原两者)。当化合物接受氧或丧失电子时，它是"氧化的"。当化合物丧失氧或 获得电子时，它是"还原的"。6化通常催化伯醇基团氧化为醒。
[016引如说明书自始至终使用的，术语"葡萄糖氧化酶"指定蛋白质，其催化0-D-葡萄 糖氧化成D-葡糖酸-1,5-内醋（D-葡萄糖+ 02 -葡糖酸内醋+ &02)，其随后可W水解 为葡糖酸。相应地，葡萄糖氧化酶是酶。进一步地，术语"具有葡萄糖氧化酶活性的多肤" 指具有上述活性的多肤。葡萄糖氧化酶可W缩写为"G化"或"E.C. 1.1. 3. 4"。如说明书自 始至终使用的，术语"G化-WT或WT"指示真菌黑曲霉的野生型GOx。术语"G0X-T30V;I94V; 或T30VI94V;或双重突变体；或亲本突变体"指示具有根据SEQIDNO: 1的两个置换T30V 和I94V的(X)x变体，如Zhu等人（2006 ;2007)中所述。
[0166] 根据本发明的(X)x变体的确均具有共同的根据SEQIDNO: 1的两个置换T30V和 I94V，W及在位置S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560的由根据本发明适合替换的剩余 19种蛋白源氨基酸中任一种的至少一个另外的氨基酸置换。说明书正文自始至终，分别的 "EZ"编号可W缩写根据本发明的(X)x变体。"EZ"代表酶。
[0167] 酶"葡萄糖氧化酶"因此是葡萄糖氧化酶类别的成员，其通过将氧从来源 或供体添加、插入、促成或转移至底物，来催化氧化反应。此类酶也称为氧化还原酶 (oxidoreductases)或氧化还原酶（redoxenzymes),并且包含氧合酶、氨化酶或还原酶、氧 化酶和过氧化物酶。
[0168] 在运点上，术语"氧供体"、"氧化试剂"和"氧化剂"意指物质、分子或化合物，其在 氧化反应中将氧贡献给底物。通常，氧供体被还原(接受电子)。示例性氧供体包括例如分 子氧或双氧（〇2)，并且过氧化物包括例如烷基过氧化物例如叔下基过氧化物，且最优选过 氧化氨（&〇2)。"过氧化物"是具有彼此结合的两个氧原子的任何化合物。
[0169] 如所述的，葡萄糖氧化酶或如本文使用的(X)x变体的"活性"或"酶活性"设及其 催化氧化反应D-葡萄糖+化一葡糖酸内醋+&化的能力的量度，并且可W表示为反应产物 在其下产生的速率。例如，葡萄糖氧化酶活性可W表示为每单位时间产生的产物(葡糖酸内 醋和/或&〇2)量，或每单位(例如浓度或重量）葡萄糖氧化酶。
[0170] 一般而言，本发明的多肤在本文中也可W被称为"突变体"、"突变蛋白"或"变体" 或"经修饰的GOx"或"修饰"，意指它已由黑曲霉(X)x-WT自身W及根据SEQIDNO: 1的 G化-T30V;I94V制备、改变、衍生或W某一方式不同或变化。
[017。 黑曲霉的(X)x-WT蛋白质包含根据SEQIDNO: 2的氨基酸的天然序列。相应地， "亲本突变体"或"双重突变体"是使用本文描述的任何方法、工具或技术，本文提供的任何 其他(X)x多肤由其衍生或制备的(X)x多肤。依照本发明，"亲本突变体"或"双重突变体"是 根据SEQIDNO: 1的多肤。
[017引因此，"亲本多核巧酸"是编码亲本多肤的那种，即根据SEQIDNO: 10的多核巧 酸。
[0173] 术语"突变"或"变化"或"修饰"意指遗传材料例如DNA或RNA中的任何可检测的 变化，或此类变化的任何过程、机制或结果。运包括其中基因的结构(例如DNA或RNA序列） 改变的基因突变，起于任何突变过程的任何基因或DNA或RNA，W及由经修饰的基因或DNA 序列表达的任何表达产物(例如蛋白质或多核巧酸)。此类变化还包括启动子、核糖体结合 位点等中的变化。
[0174] 在本说明书的上下文中，表达"除氧外的某些介质"、"除氧外的某些电子介质"、 "某些固定的介质"和"除氧外的某些电子受体"指示选自下述的介质/电子介质：亚硝基苯 胺及其衍生物、偶氮化合物、吩嗦及其衍生物、吩嚷嗦及其衍生物、吩嗯嗦及其衍生物、二茂 铁及其衍生物、铁氯化钟、Ru-和Os-络合物、酿及其衍生物、吗I噪酪、紫精、四硫富瓦締及其 衍生物和献菁。
[0175] 相应地，依照本发明的表达"除氧外的某些介质"、"除氧外的某些电子介质"、"某 些固定的介质"和"除氧外的某些电子受体"还指示电子介质，其通过FADH2快速还原但通 过抗坏血酸缓慢还原或不还原，例如2-[4-(二甲基氨基）苯基]-二氮締甲酯胺的衍生物。
[0176] 缩写 AA-氨基安替比林HRP-辣根过氧化物酶 G化-葡萄糖氧化酶 G化-WT或WT-真菌黑曲霉的野生型GOx GDH-葡萄糖脱氨酶 ABTS- 2, 2'-联氮-双（3-乙基苯并嚷挫嘟-6-横酸） BTO-憐钢酸。
[0177] 附图描述 图1 图1显示了本文提供的(X)x变体对氧的活性测定的原理：在(X)x和HRP的氧化半反应 期间产生的&〇2用于氧化生色底物ABTS。ABTS的变色通过在414皿处的吸收进行监控。 该原理构成如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定的基础。
[017引 图2 图2描述了用于检测介导的电子转移的介质测定或PM0测定(憐钢酸)。介质化合物在G化的还原半反应期间在两步中变得还原。介质将两个电子转移至氧化还原指示剂PM0,其 随后变得被还原。在还原期间的PM0变色通过在700nm处的吸收进行监控。
[0179]图 3 图3显示了在根据本发明的蛋白质结构中用于氨基酸置换的六个位置的不同定位。
[0180] 图 4 图4显示了根据本发明的不同(X)x变体的耗氧率：a)根据时间的相对氧浓度的进展；b)相对耗氧率/分钟。测定实现在条目hh)下的材料与方法部分中描述。酶标准化至2U/ L。
[0181] 图 5 图5描述了根据本发明的不同(X)x变体的米曼二氏（Michaelis-Menten)动力学。对 于活性测定，用于表征的介质测定如条目ff)下的材料与方法部分中概述的应用。虚线在 MicrosoftExcel中应用最小二乘法进行计算。
[0182] 图 6 图6显示了根据本发明的不同0化变体的热稳定性特性。测定如条目ii)下的材料与 方法部分中概述的执行。作为另外的对照，使用去糖基化和高糖基化的GOx。
[0183] 图 7 图7显示了（X)x-WT、G0X-T30V;I94V和本发明的0化变体V(即除置换T30V;I94V之 夕1'，4173￥;43325;。4141;￥5601')的相对耗氧率。测定实现在条目化）下的材料与方法部分 中描述。酶标准化至1. 7mg/L。
[0184] 图 8 图8显示了与葡萄糖相比较，G化-WT、G化-T30V;I94V和0化变体EZ07对不同糖的残 留活性。对于残留活性测定，用于表征的介质测定如条目ff)下的材料与方法部分中描述 的应用。底物浓度在反应混合物中为181. 8ml。
[0185] 图 9 图 9 显示了G0x-WT、G0x-T30V;I94V和GOx变体EZ07 的酶参数。应用MicrosoftExcel中的最小二乘法，根据米曼二氏动力学来计算参数。对于活性测定，用于表征的介质测定如 条目ff)下的材料与方法部分中描述的应用。
[0186] 图 10 图10显示了在25至67 °C之间的不同溫度下的15分钟溫育后，G化-WT、G化-T30V; 194V和(X)x变体EZ07的残留活性。
[0187] 序列描述 多肤序列
[018引在下述实施例部分，除非指定其他商业来源，否则所有试剂、限制性酶及其他材料 均得自RocheDia即osticsGermany,并且根据由供应商给出的说明书使用。用于DNA纯化、 表征和克隆的操作和方法是本领域众所周知的幻化掌yl，in"O/rre別protocol i打曲oiecu缸r如'0知斜"""化也>，於7巧"7，并且可W如由技术人员要求的进行修改。 实施例
[0189] 本发明将通过下文实施例详细举例说明，尽管本发明不应限于运些具体实施例。
[0190] 本发明的核屯、在于出乎意料和令人惊讶的特定(X)x变体的发现，所述特定(X)x变 体显示出超过血糖测量领域中的已知(X)x的改善特性，即维持其对于底物葡萄糖的特异 性，并且经由从氧化酶活性朝向脱氨酶活性的转变而显著降低耗氧率和/或对于除氧外的 特定电子介质具有增加的活性。
[0191] 为了证明依照本发明的(X)x变体的(X)x特性，本发明人不依赖于大多数指示分 子氧还原为过氧化氨的可用活性测定。具体地，对于介导的电子转移，Zhu等人（2006 ; 2007)建立了基于产物的GOx检测测定（下文G0DA)倍如，么，ifo曲細，C，Zs左AsrfseK,瓜游 Schwaneberg,U. (2006).Makingglucoseoxidasefitforbiofuelcellapplications bydirectedproteinevolution.BiosensorsandBioelectronics21,2046-2051;Zhu, Z.，Wang，M. 'Gautam,A.，Nazor，J.，Momeu，C.，R，P.，andU，S. (2007).Directedevolution ofglucoseoxidasefromAspergillusnigerforferrocenemethanol-mediated eiec化w皆<ms/kr.仿?〇祐cAno的巧^ Joyraai之，之如-之做7。该测定事实上允许葡糖酸内醋的氧不依赖性检测，但在氧的存在下，仍然不能特异性检测通过除氧外的介质介导的电 子转移，运在实时血糖分析装置的情况下是高度相关的。
[0192] 在下述实施例中，本发明人因此测试了本发明的特定(X)x变体，分别对于其介导 的电子转移、通过氧的电子转移及其葡萄糖特异性，W证明本发明的核屯、。进一步地，还测 试了在热稳定性方面的特性。
[019引 因此，本发明人使用众所周知的ABTS测定/"况/打，Z.，化妃r, 7.，心caiofe,瓜， Petrounia,I.P.和Arnold,F.比（2002).Modificationofgalactoseoxidaseto introduceglucose6-0xidaseactivity.Chembiochem3，781-783],Ay壶觀GQ'l咬形巧 氧的活性。图1显示了对氧的活性测定的原理。
[0194] G化变体的测试 为了在葡萄糖特异性、降低的耗氧率和/或对于除氧外的特定介质增加的活性方面， 就其对6化特性的改善测试适当的氨基酸置换，测试本发明的特定0化变体。
[019引（i)对于其耗氧率，即酶促活性，在比色ABTS测定中使用氧作为电子受体，和 (ii) 对于通过亚硝基苯胺介质作为示例性介质介导的电子转移， (iii) 在不同糖作为底物的存在下（即葡萄