糖、半乳糖、麦芽糖、木糖和麦芽=糖)，对于 通过亚硝基苯胺介质作为示例性介质介导的电子转移。
[0196] 对于所述介导的电子转移，使用对亚硝基苯胺化合物/5ec知。0. 分.化e Glucose-Dye-OxidoreduktaseinderklinischenDiagnostik.DISSERTATIONthesis， TechnischeUniversitatKaiserslautern,Kaiserslautern]。图 2 显示了介质巧ij定，良P PMO(憐钢酸）测定的原理，其中应用亚硝基苯胺介质N，N-双（2-径乙基）-4-亚硝基苯胺。
[0197] 在上述测定中，来自介质反应的两个电子转移至PM0。PM0随后变得被还原。通过 在700nm处的吸收，来监控从氧化PM0的淡黄色到还原PM0的深蓝色的变色。
[019引为了证明依照本发明的特定(X)x变体，上述介质测定修改为酵母细胞上清液中的 低(X)x活性，其显示在憐酸钟缓冲液（0. 2M，pH7. 0)中从0. 65U/L到22U/L的广泛线性 检测范围。在所述条件下达到在96孔板上10. 2%的标准差。对于标准差的计算，通过扣除 阴性对照的值考虑本底(真标准差)。
[0199] 葡萄糖氧化酶变体 依照本发明，选择Zhu等人（2006 ;2007)中所述的双重突变体作为用于本文提供的 特异性氨基酸置换的原材料。运种双重突变体具有固有地存在的两个置换T30V和I94V (SEQIDN0:1)。（X)x-T30V;I94V显示改善的热稳定性、改善的抑稳定性W及增加的kcat 喧X议!.5/5量_\?>].]/s) [Zhu,Z.，Wang,M.，Gautam,A.，Nazor,J.，Momeu,C.，R,R，and U，S. (2007).DirectedevolutionofglucoseoxidasefromAspergillusnigerfor ferrocenemethanol-mediatedelectrontransfer.BiotechnologyJounal2,241-248]。
[0200] 选择高糖基化的酿酒酵母菌株作为表达宿主/ZeAie，Z.，仿'沁打，乂，ZeA打erf，jf.， Haselbeck,A.矛口Kopetzki,E. (1995).GlycoproteinbiosynthesisinSaccharomyces cerevisiae:ngd29,anN-glycosylationmutantallelictoochlhavingadefectin theinitiationofouterchainformation.FEESLett370，41-45]。
[0201] 在具有依照本发明的特定氨基酸置换的细胞克隆培养后，平行应用介质测定和 ABTS测定。选择显示增加的介质活性、降低的氧活性或两者的克隆用于进一步研究。因此， 将所选克隆和对照培养且筛选12次。随后，将依照本发明的改善变体的(X)x基因分离且测 序。其后，所选变体的所述基因充当用于进一步的特定氨基酸置换的模板。
[020引氨基酸位置的表征 本发明人进一步表征了本文提供的(X)x变体的特定氨基酸位置，即S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560。运些位置在图3中描述。
[0203] 预表征 为了进一步研究特定(X)x变体，本发明人考虑下述特性进行预表征： 1) 耗氧量 2) 对于作为底物的葡萄糖的特异性 3) 米曼二氏动力学(介质活性/葡萄糖亲和力）和 4) 热稳定性。
[0204] 相应的细胞克隆的培养在常规摇瓶中发生。将上清液浓缩且在0. 2M憐酸钟，pH 7中缓冲。
[0205] 1)耗氧率 如下文材料与方法部分中的条目gg)下概述的，通过生色底物ABTS的氧化间接测定耗 氧量。为了证明该数据，使用光学氧探针直接测量耗氧量。6化变体在反应方法中标准至2 U/L。
[0206] 2)特异性 如上文已概述的，G化对于底物葡萄糖的特异性在酶促葡萄糖测定中起主要作用，因为 存在紧靠葡萄糖在临床上相关的糖，例如四种糖：半乳糖、麦芽糖、木糖和麦芽=糖。因此， 为了证明本文提供的(X)x变体的特异性，选择所述糖且与葡萄糖相比较。对于运些研究，使 用介质测定，应用181.8ml每种糖。
[0207] 3)介质活性/葡萄糖亲和力 关于介质活性的更详细研究和葡萄糖亲和力的测定，本发明人应用本文公开的变体关 于米曼二氏动力学的测试。
[020引 4)热稳定性 应用如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定，分析本发明的所选(X)x变 体的热稳定性。作为另外的对照，还分析在黑曲霉中表达的高糖基化的(X)x和去糖基化的 GOx-WT。
[0209] G化变体G0X-EZ07的最终表征 对于最终表征，各自的G0X-EZ07表达酿酒酵母菌株在10L发酵罐中进行培养，随后纯 化所获得的G0X-EZ07。最终酶制剂的纯度在50ml憐酸钟缓冲液抑7中高于90%。如预 表征时期中，研究耗氧量、特异性、活性和葡萄糖亲和力。对于(X)x浓度的特异性测定，应用 ELISA(参见条目ee下的材料与方法部分)。
[0210] 变体G0X-EZ07也在下述方面进行标准： la)耗氧量 2a)对于作为底物的葡萄糖的特异性 3a)米曼二氏动力学(介质活性/葡萄糖亲和力）和 4a)热稳定性。
[0211] la)GOx-EZO?的耗氧量 如1)中所述实现测量。如条目dd)下的材料与方法部分中概述的标准方案，纯化所有 测试的酶（GOx-WT ;G0x-T30V ;I94V和G0X-EZ07)，且调整至5嗦/血的蛋白质浓度。
[0212] 检测到下述耗氧率[%/分钟]:G0x-WT: 17. 44 ;G0x-T30V;I94V: 24. 22 和本发 明的GOx-EZO? :3. 86。GOx-EZO?的残留氧活性与G0X-T30V;I94V相比较为15. 9%，并且与 G化-WT相比较为22. 13〇/〇。
[0213] 2a)G0X-EZ07 的特异性 如2)中所述实现测量。
[0214] 3a)G0X-EZ07的米曼二氏动力学 如3)中所述实现测量。
[0引引 4a)热稳定性 如4)中所述实现测量。
[0216] 结果 本发明人发现六个不同的氨基酸位置S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560负责降低 的耗氧率和/或对于除氧外的电子介质增加的介质活性。进一步地，本发明人发现在六个 氨基酸位置中的协同效应，其允许本领域技术人员在葡萄糖特异性、显著降低的耗氧率和/ 或对于除氧外的介质增加的活性方面设计(X)x变体。
[0217] 特别地，本发明人发现单独或组合的位置V560和F414负责显著降低的耗氧率和 /或负责对于显著增加的介质活性。另外，发现位置A173和A332负责组合的两者，即本文 提供的(X)x变体的介质活性中的显著增加和伴随的耗氧率中的显著降低。发现位置S53和 A137负责对于除氧外的特定介质显著增加的介质活性。
[021引进一步地，本发明人发现适合由本发明提供的(X)x变体的特定氨基酸。
[0219] 表1显示了用于位置173、332、414和560的合适氨基酸集合和相应的简并密码 子。
[0220] 根据本发明测试的(X)x变体的比活性通过各自的EZ编号显示于表2中。该表是 根据本发明测试的(X)x变体在经由介质测定的介质活性和经由ABTS测定的耗氧量特性方 面的比较。
[022。 结果W根据本发明的(X)x变体和作为原材料的亲本突变体即(X)x-T30V;I94V之 间的比例（商数）的形式显示。不同微量滴定板的结果是可比较的。该比例基于通过常规ELISA技术测定的比活性扣/mg]，如条目ee)下的材料与方法部分中概述的。该表还显示 了依照本发明测试的氨基酸位置的确切置换。
[0222] 表2 :就介质活性和(残留)氧活性测试的具有EZ数字代码的本发明的特定(X)x变 体。
[0223] 结果显示不同特定变体（6203、6205、6212、6206、6207、6208、6210、6211、6215)具 有根据本发明的必需特性，即降低的氧亲和力，导致与亲本突变体G0X-T30V;I94V相比较， 显著降低的耗氧率和/或增加的介质活性。变体6203、6205、6207、6208和6210经历进一 步研究。
[0224] 例如，本发明人发现与亲本突变体相比较，G化-EZ07和EZ10显示对于增加的介质 活性W及氧测定中的显著减少的两种显著改善。
[0225] 特别地，本发明人发现变体EZ07是依照本发明显著改善的(X)x变体，而对所述变 体的相应特定氨基酸置换没有任何限制。EZ07显示在介质测定中与亲本突变体相比较的 4. 4倍增加，和在ABTS测定中亲本突变体的氧活性仅0. 1倍的氧活性。相比之下，与亲本突 变体相比较，G化变体EZ12和EZ15显示对于介质和氧活性两者的伴随增加。与亲本突变 体相比较，EZ12携带在位置S53上的另外置换(参见表2)。进一步地，发现由于氨基酸置换 A137LEZ15具有介质活性中的6倍增加。
[0226] 氨基酸位置的表征 位置A173和A332远离活性位点。A173是表面位置；A332定位接近于底物增强通道。 对氧活性具有影响的两个位置F414和V560定位接近于活性位点。F414在葡萄糖结合位点 上方，并且V560紧靠葡萄糖和FAD。两个活性位置A137和S53均为接近FAD的表面位置。
[0227] 预表征 所选预表征的变体的结果如下： 1)耗氧率 图4显示了根据时间（a)和耗氧率/分钟（b)，在反应混合物中的氧含量的进展。作为 对照，还分析G0X-T30V;I94V、GOx-WT和阴性对照菌株的上清液。
[0228] G化-WT和G0X-T30V;I94V显示相似的行为。因此，此处测试的所有(X)x变体 (EZ03、EZ05、EZ07、EZ08、EZ10)均具有显著降低的耗氧率。此外，作为本发明的令人惊讶和 出乎意料的发现，所测试的变体不能明确与阴性对照区分，运指示各自的氧活性在所选条 件下甚至低于测定的检测范围。
[0229] 2)特异性 表3显示参考葡萄糖的残留(X)x酶活性。
[0230] 表3 :本发明的(X)x变体对于不同糖的残留活性。对于残留活性的测定，应用用于 表征的介质测定。底物浓度为各自反应混合物中181.81111。0化-胖1'和6(^-13(^;194￥活 性充当参考。
[023。 与(X)x-WT和根据沈QIDNO: 1的亲本突变体G0X-T30V;I94V相比较，本发明的G化变体无一显示被麦芽糖或麦芽=糖的显著干扰。EZ07和EZ10对于所有测试的糖具有 最佳结果。
[0232] 3)介质活性/葡萄糖亲和力 米曼二氏动力学在图5中描绘。表4显示Vm。、和Km的计算值。
[023引表4 :不同(X)x变体的酶参数。应用MicrosoftExcel中的最小二乘法，根据米曼 二氏动力学来计算参数。
[0234] 表4显示EZ07 -方面具有与亲本突变体G0X-T30V;I94V相比较高大约7. 5倍 的VmJ直，但另一方面具有高几乎两倍的Km值。然而，高Km值是高VmJ直的结果。在图5 中，明确可见(X)x-EZ07在低底物浓度下的表现可与WT和亲本突变体T30V、I94V相比较。 G化-EZ10达到相似结果，但更低的Vm。、值。
[0235] 4)热稳定性 在图6中，对于八个不同溫度图解残留活性。
[0236] 根据本发明测试的(X)x变体、G化-WT和G0X-T30V;I94V亲本突变体显示相似结 果。对于去糖基化的GOx-WT可W观察到热稳定性中的显著下降；然而，高糖基化的分子显 示更高的热稳定性。
[0237] 结论 在所有预表征研究期间的特定测试1)至4)的结论中，G化-EZ07和GOx-EZlO变体显 示最显著的结果。根据预表征结果实现氧活性中的显著下降和介质活性中的显著增加。 G化-EZ07和GOx-EZlO的特异性几乎未改变，仅检测到对木糖的轻微活性变化。因为EZ07 的活性比EZ10的活性高大约1. 7倍，所W选择G0X-EZ07用于最终表征。
[023引应强调的是上述结果使用本发明的未纯化的(X)x变体生成。相应地，本领域技术 人员认识到在使用相似的纯化的(Xk变体后，结果可W改变。另外，在应用化ISA的细胞上 清液中的特定蛋白质测定可W受杂质影响。
[0239] 变体G0X-EZ07的最终表征 对于最终表征，选择纯化的G0X-EZ07变体。
[0240] la)G0X-EZ07 的耗氧量 G0x-WT、G0x-T30V;I94V和G0X-EZ07的相对耗氧量在图7中描绘。
[0241] 在所选条件下，与GOx-WT相比较，G化-EZ07的耗氧率降低超过10倍，运确认预表 征研究的数据。
[0242] 2a)GOxEZ07 的特异性 图8显示了GOx-WT、G0X-T30V;I94V和G0X-EZ07参考葡萄糖（100%)的残留活性。图 8显示了与G0X-T30V;I94V和(X)x-WT相比较，在(X)x-EZ07的特异性中无显著变化。
[0243] 3a)G化变体EZ07的米曼二氏动力学 图9比较了 (X)x-WT、G化-T30V;I94V和G0X-EZ07在介质测定中的动力学。
[0244] 根据图9,与(X)x-WT相比较，G化变体EZ07显示在介质测定中641. 5%的残留活性 和在ABTS中17. 5%的残留活性，导致降低37倍的氧化酶活性。
[0245] 4a)G0X-EZ07 的热稳定性 图10指示了当与GOx-WT和G0X-T30V;I94V相比较时，G化-EZ07的热稳定性通过各自 置换得到维持。
[0246]G化变体的概括 在亲本突变体G0X-T30V、I94V中鉴定了六个氨基酸位置，其显示对本文提供的(X)x变 体的葡萄糖特异性、介导的电子转移的酶活性和氧活性的作用。所有位置均个别地饱和。为 了研究协同效应，使在活性位点周围聚簇的位置（S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;V560)同时 饱和。选择与亲本突变体特性相比较改善的介质活性和/或降低的耗氧率的最显著变体用 于预表征。事实证明变体G0X-EZ07 (具有另外的置换A173V;A332S;F414I;和V560T)显示 在本发明的意义中，对于所测试的特性葡萄糖特异性、介质活性和耗氧率的最显著结果。
[0247] 因此，G化-EZ07就其介质活性、氧化酶活性、葡萄糖特异性W及其热稳定性特 性进行深入研究。该变体显示在对于介导的电子转移的比活性中的6. 4倍增加（G化-WT: 7. 4 ;G0x-EZ07: 47. 5U/mg)和ABTS测定中 5. 7 倍的活性降低（GOx-WT: 451. 1U/mg; G化-EZ07: 78. 86U/mg)，导致降低36. 5倍的氧化酶活性。（X)x-EZ07没有热稳定性或特异 性中的显著变化。
[024引材料与方法 所有化学制品均为分析级别且购自Sigma-Al化ich(Taufkirchen，德国）、Applichem(Darmsta化，德国）或CarlRoth(Karlsruhe,德国）。所有酶均购自化wElnglandBiol油s (UK)和Sigma-Al化ich(Taufkirchen，德国）。pYES2穿梭载体和大肠杆菌菌株。化领勾自 InvitrogenCKarlsruhe，德国）。酿酒酵母菌株 7087(ngd29皿nl)由Rochedia即ostics提供 [Lehle,L. ,Eiden,A. ,Lehnert,K. ,Haselbeck,A.和Kopetzki,E. (1995).Glycoprotein biosynthesisinSaccharomycescerevisiae:ngd29,anN-glycosylationmutant allelictoochlhavingadefectintheinitiationofouterchainformation.FEES Zeff 口，如-必7。使用NanoDrop光度计（NanoDropTechnologies,Wilmington,DE，USA) 定量DM。测序和寡核巧酸合成通过化rofinsMWG化e;ron(Ebersberg，德国)完成。使用 的引物在表5 (支持信息）中提及。
[0249]aa)多重和单一位点饱和诱变 对于多重位点饱和诱变，应用Omnichange方案/"化如乂，捕ira化?6,AK，Marienhagen,J.和Schwaneberg,U. (2011) .OmniChange:TheSequenceIndependent MethodforSimultaneousSite-SaturationofFiveCodons.PLoSONE6，e26222]AW MlPCR反应混合物含有1ng/Pl质粒模板、lxPhusion缓冲液（NewElnglandBiol油s， 化anlrfud，德国）、1UPhusion聚合酶和200剛dNTP。将反应混合物分成四个相等体积， 并且加入250nM祀向特异性位点的正向引物和反向引物用于片段扩增。在用于载体主链 扩增的混合物中，加入另外的dNTPW达到300剛的最终浓度。对于片段1，将祀向A173的 引物P7和P8加入主混合物中。同时对于A332饱和，使用P9和P10。通过使用P11和P12 祀向F414位点。将V560位点包括在载体主链中，因为它通过P13和P14进行扩增。用于 片段扩增的PCR程序为98°C45秒（1个循环）；98°C15秒；65°C30秒；72°C30秒（20个循 环）；72°C5分钟（1个循环)。对于载体主链扩增，应用4分钟的延伸时间。将所有片段进 行柱纯化，并且在NanoDrop光度计（NanoDropTechnologies,Wilmington,DE，USA)上测量 浓度。随后对PCR产物实施过夜化wl消化(各5U)。
[0巧0] 片段的消化和连接：将插入片段的浓度调整至0. 06pmol/rt。同时，将载体主链浓 度调整至0. 02pmol/rt(还考虑用化消化的稀释因子)。将1W切割溶液（50%(500ml TrispH9. 0、30% (lOOmM舰的乙醇溶液）和20%地20)加入4W每种片段。反应随后在 70°C下溫育5分钟。将切割的片段混合在一起，并且在转化化学感受态大肠杆菌D册6用于 文库扩增前，在室溫下（RT)溫育5分钟。对于酵母转化，使用质粒分离试剂盒"NucleoSpin? Plasmid" (MAC肥RY-NAGEL，D化en