预变性 3min，然后 94°C 30s，50-60°C 30s， 72°C 80s，共30次循环后，72°C最后延伸7min。
[0044] 退火温度分别选择为 50°C、52°C、54°C、56°C、58°C、60°C。
[0045] (3)电泳、PCR产物序列测定：取扩增产物5yL，1.0 %的琼脂糖凝胶（含 0.05%。Gold View核酸染料）进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对：P1F/ P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132 和 P6484F/P7513R 的顺序，诺如病毒基因组扩增条带依次为1595bp、1548bp、1560bp、1283bp、1680bp、1030bp。 电泳结果如图1，结果表明P2689F/P4248R引物的退火温度选择为54°C，其余引物的退火温 度可选择为56 °C。
[0046] 实施例2 :适用于GII. 4型诺如病毒基因组扩增用引物的RT-PCR灵敏度分析
[0047] (1)病毒样本处理及核酸提取：通过PBS溶液（pH7. 4, DEPC处理）稀释收集的待 处理样品（含有GII.4型诺如病毒L10)至10% (w/v)浓度，充分振荡混匀，于12000Xg下 离心10min收集上清液140 y L，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒RNA共60 y L，并进 行10X梯度的适当稀释处理。
[0048] (2) "4+1+1"基因组分段扩增法（即分6段扩增，所使用的引物配组如下：P1F/ P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132 和 P6484F/P7513R， 每次RT-PCR反应选择一对引物）：采用20 y L的一步法RT-PCR反应体系，含有2 X one-step RT-PCR mixture 10 yL，上游引物和下游引物（10 ymol/L)各 0.6 yL，MLV/RNasin/HS-Taq 酶混合液0. 8 y L，样本病毒RNA模版2 y L，其余由ddH20补足。
[0049]反应条件为：50°C 反转录 30min，94°C 预变性 3min，然后 94°C 30s，55°C 30s， 72°C 80s，共30次循环后，72°C最后延伸7min。
[0050] 以检测引物 G2SKF/R(G2SKR :5，-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3，；G2SKF: 5 ^ -CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3')作为对照，按照上述体系和反应条件进行。
[0051] (3)电泳、PCR产物序列测定：取扩增产物5yL，1.0 %的琼脂糖凝胶（含 0.05%。6〇1(1 View核酸染料）进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物 对：P1F/P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132 和 P6484F/P7513R的顺序，诺如病毒基因组扩增条带依次为1595bp、1548bp、1560bp、 1283bp、1680bp、1030bp。电泳结果如图2,结果表明与检测引物G2SKF/R(G2SKR : 5 ' -CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3 ' ；G2SKF :5，-CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3，）对比，仅 P2689F/P4248R-对引物的扩增灵敏度低于一个数量级，其他引物均可达到过超过检测引 物的灵敏度。
[0052] 实施例3 :实际样本中病毒基因组的扩增效果
[0053] (1)病毒样本处理及核酸提取：取GII. 4型诺如病毒阳性样本L10、L62、L65、L106、 L232,通过PBS溶液（pH7.4, DEPC处理）稀释待处理样品至10% (w/v)浓度，充分振荡混 勾，于12000Xg下离心10min收集上清液140yL，并通过RNA提取试剂盒抽提样本中病毒 RNA 共 60 y L。
[0054] (2) "4+1+1"基因组分段扩增法（即分6段扩增，所使用的引物配组如下：P1F/ P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132 和 P6484F/P7513R， 每次RT-PCR反应选择一对引物）：采用20 y L的一步法RT-PCR反应体系，含有2 X one-step RT-PCR mixture 10yL，上游引物和下游引物（10ymol/L)各 0.6yL，MLV/RNasin/HS-Taq 酶混合液0. 8 y L，样本RNA模版2 y L，其余由ddH20补足。
[0055]反应条件为：50°C 反转录 30min，94°C 预变性 3min，然后 94°C 30s，55°C 30s， 72°C 80s，共30次循环后，72°C最后延伸7min。
[0056] (3)电泳、PCR产物序列测定：取扩增产物5yL，1.0 %的琼脂糖凝胶（含 0.05%。Gold View核酸染料）进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对：P1F/ P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132 和 P6484F/P7513R 的顺序，诺如病毒基因组扩增条带依次为1595bp、1548bp、1560bp、1283bp、1680bp、1030bp。 电泳结果如图3,结果表明，除L62号样本外（病毒量极低），其余样本均成功获得扩增。
[0057] (4)基因组序列拼接与比对：对其中L10与L232号样本的扩增产物测序并拼接， 分别获得基因组序列，长度均为7513bp。将两条基因组序列分别提交进行BLAST分析，结 果表明，L10 (基因组的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）与L232(基因组的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 2 所示）分别与 Genbank 登录号为：KC175323. 1 (香港）、KJ196279. 1 (日本）、 KC577175. 1 (江苏）及KJ196283. 1 (台湾）等毒株基因组序列达到99%的相似度。
【主权项】
1. 一种GII. 4型诺如病毒基因组扩增引物，其特征在于，包括六对扩增引物： 引物对 I :P1F :5' -GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3' ； P1596R :5' -TCGACGCCATTGCGTGGGA-3' ； 引物对 2 :P1258F :5' -CAACCATATGACCACCTTGCT-3' ； P2805R :5'-ATGGCCACCTCCTCATAGTA-3' ； 引物对 3 :P2689F :5' -AGGTCTCAGTGATGAAGAG-3' ； P4248R :5'-GGGCCATCCTCATTCATATTCA-3' ； 引物对 4 :P4099F :5' -TGGTAAGATCAAGAAGAGGCT-3' ； G2SKR :5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3' ； 引物对 5 :NV2of2 :5' -GGAGGGCGATCGCAATC-3' ； GV132 :5'-CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3' ； 引物对 6 :P6484F :5' -CAGCACAATCTGATGTGGC-3' ； P7513R :5, -TTACACCCGTGACTCCCCT-3,。2. -种GII. 4型诺如病毒基因组的扩增方法，其特征在于，分别以权利要求1所述 的引物对 P1F/P1596R、P1258F/P2805R、P2689F/P4248R、P4099F/G2SKR、NV2of2/GV132 和P6484F/P7513R作为扩增引物的上下游引物，以GII. 4型诺如病毒的RNA为模板进行 RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后再拼接比对，得 到GII. 4型诺如病毒基因组全长序列。3. 根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，所述的RT-PCR，其反应体系为：含 有 2X〇ne_step RT-PCR mixture IOy L，IOy mol/L 上游引物和 IOy mol/L 下游引物各 0. 6 y L，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0. 8 y L，RNA模板2 y L，其余由双蒸水补足至20 y L， 反应条件为：50°C反转录 30min，94°C预变性 3min，然后 94°C 30s，55°C 30s，72°C 80s，共 30 次循环后，72°C最后延伸7min。
【专利摘要】本发明公开了一种GII.4型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。本发明分别以六对引物作为扩增引物的上下游引物，以GII.4型诺如病毒的RNA为模板进行RT-PCR扩增，分别得到扩增产物，然后对扩增产物进行核酸序列测序，然后再拼接比对，得到GII.4型诺如病毒基因组全长序列。本发明针对GII.4型诺如病毒主要流行基因型，根据基因组所包含的三个开放阅读框设计了“4+1+1”的分段扩增策略，并根据保守区域设计相应的扩增引物；其能有效的扩增出GII.4型诺如病毒的全基因组序列。本发明可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求及相应的科研领域。
【IPC分类】C12N15/10, C12N15/11
【公开号】CN105039330
【申请号】CN201510487540
【发明人】薛亮, 吴清平, 蔡伟程, 寇晓霞, 张菊梅
【申请人】广东省微生物研究所, 广东环凯微生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月10日