可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用图
【技术领域】
[0001]本发明属于基因载体材料技术领域，具体涉及到具有低毒性、高转染率和靶向性的可降解靶向性三嵌段共聚物及制备方法及用途。
技术背景
[0002]人工血管一般是由高分子聚合物制备而成，与天然血管相比，人工血管最大的区别在于其内表面缺乏功能化的内皮细胞(ECs)层。同时，由高分子聚合物形成的人工血管内表面还存在亲水性差或无细胞识别位点，这些差异往往导致人工血管术后再狭窄，这是临床上导致患者死亡的主要原因。
[0003]内皮细胞层位于天然血管的最内层，它提供了一个无血栓形成内表面，同时还在防止血栓形成和血管堵塞发生方面发挥着重要作用。在人工血管表面实现快速内皮化，从而形成内皮层，这是提高人工血管长期通畅率，防止血栓形成的重要方法之一。迄今为止，科研工作者们开发了很多具有应用前景的方法，来实现人工血管植入物原位内皮化。为了制备具有ECs捕获和(或)ECs绑定能力的生物活性表面，人们通常利用Arg-Gly-Asp (RGD)和Arg-Glu-Asp-Val (REDV)多肽作为配体，将这些多肽连接到人工血管表面，从而实现人工血管内表面对ECs的粘附，进而实现快速内皮化。然而，研究发现，在众多的细胞识别配体中，只有REDV多肽序列能够特异性地被ECs表面的a 4 β 1整合素受体识别。因此，连接有REDV多肽的人工血管表面，能够实现对ECs的特异性识别和吸附。将REDV多肽固定在人工血管的表面，可以促进人工血管特异性地选择吸附内皮细胞，促进其内皮化。
[0004]虽然，利用REDV多肽修饰人工血管已经取得了一些成果。但是，目前利用REDV多肽制备ECs-靶向基因载体，携带目的基因(ZNF580基因)进入内皮细胞，从而促进内皮细胞快速增殖，抑制平滑肌增殖，最终实现快速内皮化，这样的研究至今还未见报道。
[0005]目前，亟需一种细胞毒性低、转染率高且具有内皮细胞靶向性功能的可降解靶向性三嵌段共聚物。
【发明内容】
[0006]本发明的第一个目的是解决现有技术存在的使用PEI25kDa，因其分子量高而具有高细胞毒性的问题，提供一种细胞毒性低且具有高转染性能的起着基因载体作用的可降解靶向性三嵌段共聚物。
[0007]本发明的第二个目的是提供一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法。
[0008]本发明的第三个目的是提供一种可降解靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途。
[0009]本发明的技术方案概述如下:
[0010]一种可降解靶向性三嵌段共聚物，是由可降解环状单体共聚物、聚乙烯亚胺和CREDVW构成的分子量为3600-98000的共聚物；所述可降解环状单体共聚物由L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε -己内酯、对二氧环己酮和三亚甲基环碳酸酯之两种聚合成分子量为1600-80000的可降解共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为200-5000。
[0011]—种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤:
[0012](1)按摩尔比为100:(10-500)的比例称取环状单体L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε -己内酯、对二氧环己酮和三亚甲基环碳酸酯之两种，加入引发剂和含锡催化剂，在隔离空气的条件下，120-155°C反应0.5-2h，再在100-130°C反应12_72h，得到混合物；所述引发剂为CnH(2n+2)02，其中10 > η > 8 ;所述引发剂的加入量为环状单体质量的0.16% -8% ;所述含锡催化剂的加入量为环状单体质量的0.001% -5% ；
[0013](2)将步骤(1)获得的混合物经分离提纯得到分子量为1600-80000的可降解共聚物；
[0014](3)按比例将0.125mmol所述可降解共聚物溶于3_8mL极性有机溶剂中得到溶液，滴加到5-10mL浓度为0.25mM异佛尔酮二异氰酸酯的甲苯溶液中，加入含锡催化剂，所述含锡催化剂的加入量为可降解共聚物质量的0.001% -5%，25°C反应12-48h ；
[0015](4)在隔离空气的条件下，将步骤(3)获得的溶液滴加到8-18mL浓度为0.25mM聚乙烯亚胺的甲苯溶液中，50-60°C反应12-72h ;降至室温后，加入10-100mL正己烷进行沉淀，过滤，得到白色可降解两亲性三嵌段共聚物；所述聚乙烯亚胺分子量为200-5000 ；
[0016](5)按比例取步骤(4)获得的可降解两亲性三嵌段共聚物0.5_2g，溶于5_10mLΝ, N-二甲基甲酰胺，加入39-390 μ L三乙胺，在-5?0°C条件下，滴入5mL质量分数为1% -10%的二烯丙基氨基甲酰氯N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，l_2h滴加完毕，室温下反应12-24小时，过滤，向滤液中加入5-10mg2，2- 二甲氧基-2-苯基苯乙酮和2_5mL浓度为0.15M的CREDVW的N，N- 二甲基甲酰胺溶液，在紫外灯波长为365nm的条件下照射10-20min，用正己烷进行沉淀，过滤，得到可降解靶向性三嵌段共聚物。
[0017]含锡催化剂优选为辛酸亚锡、辛酸锡、二丁基氧化锡或二月桂酸二丁基锡。
[0018]步骤⑵优选为:将5-50g的步骤⑴获得的混合物溶于10-100mL三氯甲烷制成溶液，加入30-300mL正己烷，分离，除去未反应的环状单体，提纯得到分子量为1600-80000的可降解共聚物。
[0019]极性有机溶剂为无水三氯甲烷、无水二氯甲烷、无水二甲基亚砜或无水N，N-二甲基甲酰胺。
[0020]上述可降解靶向性三嵌段共聚物制备纳米粒的用途，其特征是包括如下步骤:按比例将10-100mg可降解靶向性三嵌段共聚物溶于Ι-lOmL第二种有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.01-0.10mL/min滴入搅拌速率为400_2000rpm的lO-lOOmL超纯水中，再在400-2000rpm搅拌24_48h，蒸发第二种有机溶剂，得到含有粒径为50_150nm的纳米粒液体，所述第二种有机溶剂为四氣呋喃或体积比为(1-3): 1的四氣呋喃与DMF的混合液。
[0021]实验证明本发明的可降解靶向性三嵌段共聚物细胞毒性低、转染率高且具有内皮细胞靶向性功能。本发明方法简单，无污染，用本发明的可降解靶向性三嵌段共聚物制备的纳米粒具有良好的生物相容性，能够靶向性地携载目的基因进入血管内皮细胞。可降解靶向性三嵌段共聚物作为纳米粒的疏水核心。纳米粒表面链接大量的低分子量的PEI和适量的REDV多肽，提高了纳米粒的转染效率，降低了其细胞毒性，同时还赋予了纳米粒血管内皮细胞靶向选择功能。
【附图说明】
[0022]图1为一种可降解靶向性三嵌段共聚物的制备示意图。
[0023]图2为一种可降解靶向性三嵌段共聚物自组装形成纳米粒示意图。
[0024]图3为以一种可降解靶向性三嵌段共聚物为基材的纳米粒，吸附并压缩PEGFP-ZNF580，进而形成纳米粒/pEGFP_ZNF580复合物示意图。
[0025]图4为可降解共聚物及可降解两亲性三嵌段共聚物的红外光谱分析。(A)可降解共聚物P(LA-co-GA)，(B)可降解两亲性三嵌段共聚物(PE1-g-P(LA-co-GA)-g-PEI)。
[0026]图5为可降解靶向性三嵌段共聚物接枝CREDVW前后荧光吸收。
[0027](a) PE1-g-P (LA-co-GA) -g-PEI 共聚物，(b) REDV-g-PE1-g-P (LA-co-GA) -g-PE1-g-REDV共聚物。
[0028]图6为不同氮磷比条件下的一种纳米粒/pEFGP-ZNF580复合物琼脂糖凝电泳阻滞实验。
[0029]图7为可降解靶向性三嵌段共聚物在PBS中的残余质量)变化情况(37°C，30rpm)。(A)PE1-g-P(LA-co_GA)-g-PEI，(B) PE1-g-P (LA-co-PDO)-g-PEI。误差棒代表标准差(η = 3)。
[0030]图8为Transwe 11试验结果。㈧未经任何处理的HUVECs作为阴性对照组，(B)以 REDV-g-PE1-g-P (LA-co-GA)-g-PE1-g-REDV 为基材的 NPs/pEGFP_ZNF580 复合物转染的 HUVECs，(C)以 REDV-g-PE1-g-P (LA-co-PDO) -g-PE1-g-REDV 共聚物为基材的 NPs/PEGFP-ZNF580 复合物转染的 HUVECs，(D)利用 Lipofectamine?2000 试剂转染 HUVECs 作为阳性对照。