酷幾基（5C170.3)的相关 性，表明C-11(5C73. 7)位连有一个乙酷氧基。H-12(SH4. 19,dd，J= 10. 3,6.OHz)和 C-12 ( 5C75. 3)的化学位移表明C-12连有一个径基。HMBC谱中Me-18与H-12,W及电-古 COSY谱中H-Il与H-12的相关性验证了上述推论。R犯SY谱中，H-17与H-12的相关性，W 及H-Il和H-12之间较大的偶合常数（J= 10. 3Hz)表明C-12的径基为a-构型。R犯SY 谱中，Me-19与Me-29和H-12,W及H-12和H-17相关性表明它们为0 -构型。此夕F，H-9 与H-11，H-9与H-5,H-5与Me-28W及H-Il与Me-18的交叉峰表明它们均为的a-构型。 综合氨谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，W及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合 物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0024] 实施例2:化合物（I)药理作用试验 [00巧]一、材料和仪器
[0026] 786-0肾癌细胞株、0S-RC-2肾癌细胞株均购自中科院细胞库。化合物（I)自 审ij，HPLC归一化纯度大于98%。RPMI-1640培养基、lOOU/mL青霉素及100yg/mL链霉素、IXPBS缓冲液、膜酶-邸TA购于美国HyClone。胎牛血清购于美国Gibco。细胞增殖与毒性 检测试剂盒（中国）。基质胶购于美国抓Bioscience。
[0027] 肥RAcell240i恒溫解箱、Gmb皿-37520低溫离屯、机、1510酶标仪为芬兰化ermo公 司产品。IMT-2倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品。DFC480正置显微镜为德国妹卡 公司产品。MDF-呪3V-80°C超低溫冰箱为日本SANYO公司产品。YDS-50B-80液氮储存罐购 自中国成都液氮容器厂。BC-185GE4°C冰箱为中国益友公司产品。Minispi吨Ius小离屯、机 为化pendo计公司产品。powe巧ac300电泳仪为美国Biorad公司产品。 阳0測二、试验方法 [0029] 1、细胞培养 W30] (1)常规培养及细胞传代：786-0及0S-RC-2肾癌细胞株均培养在改良型 RPMI-1640培养基中，常规培养时加入了 10%胎牛血清及1%青霉素和链霉素，构成完全培 养基。培养条件为37°C、5%C〇2的恒溫培养箱。正常情况下786-0及0S-RC-2细胞均为贴 壁生长。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，一般隔天换液一次。换液时先吸去 培养瓶或培养皿中培养基，加PBS洗漆2次后再加入完全培养基。细胞密度达到80-90 %且 细胞形态仍保持良好时进行传代，传代周期一般为3天。细胞传代步骤如下：1)先弃去培养 瓶内培养基，PBS洗2次；2)培养瓶内加ImL膜蛋白酶-邸TA, 37°C解育约3分钟，倒置显微 镜下观察细胞变圆并脱落后，加入3mL完全培养基终止消化，并用吸管将成团的细胞吹散； 如细胞悬液移至15血离屯、管中，1000转/分离屯、5分钟，弃去上清，加入完全培养基吹散 细胞沉淀，分装到3个培养瓶中，置于37°C、5% 0)2中继续培养。
[0031] (2)细胞冻存：细胞处于对数生长期，状态良好并且细胞密度达到80-90 %冻存细 胞，步骤如下：1)配制细胞冻存液：将改良型RPMI-1640培养基、胎牛血清、DMSO按7:2:1比 例混合、震荡混匀；2)消化、离屯、细胞（具体见细胞传代步骤）；3)离屯、后吸去上清液，加入 冻存液并吹匀，调整细胞计数约1X107mU移至1. 2mL冻存管中。在冻存管标记冻存日期及 细胞株信息，用封口膜封口。置于4°C冰箱30分钟，移至-20°C冰箱2小时，再移至-80°C冰 箱过夜，次日转入液氮中保存。 阳03引 做细胞复苏：1)水浴锅预热到37°C准备；。从-80°(：冰箱或液氮中取出细胞，迅 速放入37°C的水浴锅中并摇动，使其内液体在1-2分钟内融化；3)将融化后的细胞悬液移 置15mL离屯、管中，1000转/分钟离屯、5分钟，离屯、后弃去上清并加入完全培养基。4)将细 胞置于37°C、5%C〇2培养箱中培养，次日观察细胞状态并换液。
[0033] (4)细胞计数：1)细胞消化，吹散制备细胞悬液，方法同细胞传代。用加样器吸取 20yL悬液沿盖玻片边缘烧靠外侧滴加，使悬液由于气压影响均匀吸入计数察，健康活细胞 呈规则圆形、透明状。计算计数板4个角的4大格内细胞数（格子边线上的细胞只记上边、 不计下边；只记左边、不记右边）。细胞密度=4大格细胞总数XO. 25X107mL。
[0034] 2、细胞增殖曲线绘制
[0035] (1)当786-0及0S-RC-2细胞处于对数生长期，密度80-90 %时，制备细胞悬液并 细胞计数，方法同上。调节细胞悬液浓度为1XIOVmL; (2)接种细胞悬液1血接种于于24 孔板上，然后再根据不同条件加药，保证每孔细胞数基本一致。同一种细胞同一种加药条件 设计计数6天，每天计数3个孔，即每种条件需设置18个孔；（3)将培养板置于37°C、5 % 0)2 中培养；(4)从接种次日开始计数，记为第I天（第O天细胞数记为接种细胞数，即IXIO5)。 每孔加200yL膜酶-邸TA,消化、吹散、计数即可。每隔24小时取3个孔进行细胞计数；（5) 根据计数所得数据绘制细胞生长曲线。
[0036] 3、WST-8细胞活力实验
[0037] (1)收集对数生长期的786-0及0S-RC-2细胞，制备细胞悬液、细胞计数，方法同 上。调节细胞悬液浓度为4XIO4HiL; (2)每孔中加入SOiiL细胞悬液（即2000个细胞/ 孔），然后各逾加入含有设计值2倍浓度药物的完全培养基50yL混勾，运样使药物终浓度 恰好为设计值，且保证了各孔细胞数的一致性。每个条件设置5个复孔；（3)将细胞置于 5%C02、37°C条件下的细胞培养箱中解育；(4)分别在24小时和48小时后终止培养，吸取 孔内培养基，更换新鲜完全培养基，每孔加入10yLWST-8溶液，用加了新鲜完全培养基和 WST-I溶液但没有接种细胞的孔作为空白对照；（5)避光条件下置于摇床5分钟摇勾，后继 续放入37°C、5%C〇2条件下培养箱中培养1小时；(6)酶标仪下测定450nm吸光度值；(7) 细胞活性抑制率=(对照组吸光度值-实验组吸光度值）/(对照组吸光度值/空白组吸光 度值）X100%。
[0038] 4、划痕细胞迁移实验
[0039] (1)准备无菌6孔细胞培养板，marker笔在6孔板背面每隔Icm划一道标线；似 取对数生长期细胞，PBS液洗漆2次，0. 25%膜蛋白酶消化、吹散，将细胞悬液离屯、，更换完 全培养基重悬。接种于标记好的6孔培养板中培养，每孔加5X1〇5细胞；（3)37°C、5C0 2培 养，待倒置相差显微镜下观察各孔细胞密度约达到90 %时吸取完全培养基，换用无血清培 养基培养24小时，W消除由于血清引起的增殖对迁移作用的干扰；(6)无血清培养到指定 时间后用高压消毒的200yL枪头垂直6孔板上的标记线划痕。划痕与孔板上mark笔上的 横线交叉点即为观察的固定点。（7)PBS清洗2次洗去划下的细胞。更换新鲜的无血清培 养基，按照实验条件在各组培养基中加入相应浓度的药物，同时设立对照组，置37°C、5C02 解箱中培养；(6)每个孔取8个固定点观察划痕后1化、1化的细胞迁移情况并照相，使用 ImageJ图像分析软件测定每张图片划痕区的面积；(8)迁移率=(观察时间固定点划痕面 积-起始时间固定点划痕面积）/起始时间固定点划痕面积X100%。迁移抑制率=(实验 组迁移率-对照组迁移率）/实验组迁移率X100 %。
[0040] 5、Transwell细胞侵袭实验
[0041] (1)取培养在完全培养基中的对数生长期786-0和0S-RC-2肾癌细胞株，PBS洗 漆2次，换用无血清的RPMI-1640培养基培养12小时，W减少细胞增殖对侵袭实验的影 响；（2)准备Transwell小室。小室可搭置于24孔细胞培养板上，底面为直径6. 5mm、孔 径5ym的膜。取40yLW1:5稀释的Img/血基质胶铺在上室，并放入4°C过夜风干，该 操作需在冰上完成，因基质胶在室溫下易迅速凝固；（3)786-0和0S-RC-2肾癌细胞株经 无血清RPMI-1640培养基培养到12小时后，膜酶-EDTA消化、离屯、后吸去上清，加入无血 清的RPMI-1640培养基重悬，细胞计数调整细胞浓度至lXl〇6/mL;(4)将准备好的带有 Transwell小室的24孔板取出，下室（即24孔板的孔）中加入500yL含有10%胎牛血清的 完全培养基，W提供对细胞的趋化作用。将上室搭在孔上，此时可见上室底面的膜刚好浸在 了下室中的培养基里。观察下室的培养基与上室底面的膜之间没有气泡即可；（5)取50yL 细胞悬液加在各个孔的上室，再加入含有不同浓度药物的无血清RPMI-1640培养基50y以 使各个孔上室药物的浓度达到实验设计浓度。观察各孔中没有气泡；(6)将细胞放入37°C、 5C02的恒溫培养箱中培养12小时