[0031] 采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，加入PBS缓冲 液，离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。
[0032] S12、对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养至第三代骨髓间充质干细胞：
[0033] 将原代骨髓间充质干细胞调整至1 X 106~1 X 108个/25ml，加入培养基进行培养， 优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10 6~10 smol/L的氢化可的松、 80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。当细胞生长到融合时，PBS漂洗2~3次， 加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按 1 :2~1 :3比例传代接种培养至细胞生长到融合，重复上述操作继续传代，艮P PBS漂洗2~ 3次，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消 化，按1 :2~1 :3比例传代接种培养至细胞生长到融合，即获得第三代骨髓间充质干细胞。
[0034] 步骤S2的具体过程为：
[0035] 取三维细胞培养支架于蒸馏水中复溶，复溶过程中可添加助溶剂促进三维细胞培 养支架溶解，优选地，助溶剂为乙醇，且乙醇的质量分数为5% -15%。取第三代骨髓间充质 干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1 X 10s~1 X 10 1(]L 1细胞浓度与复溶后三维细胞培 养支架共同接种于培养基中进行培养。
[0036] 优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10 6~10 smol/L的氢化 可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。其中，氢化可的松能够参与细胞的 糖代谢、脂类代谢等，调节骨髓间充质干细胞的增值，促进骨髓间充质干细胞功能表达。青 霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长；链霉素能够作 用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译，从而抑制细菌生长；自然环境下，不考虑人为产生的抗 药性，对青霉素不敏感的绝大多数微生物对链霉素敏感，反之亦然；因此，最为优选地是将 青霉素和链霉素搭配使用能够控制几乎全部常见的细菌，从而能够尽量避免细菌对骨髓间 充质干细胞的生长及活性造成的不良影响。因此，采用该血清培养基培养间充质干细胞不 仅可以促进骨髓间充质干细胞生长和增殖，而且可避免培养过程中产生的细菌对细胞活性 造成的影响。
[0037] 进一步地，步骤S2中所采用的三维细胞培养支架可以是由以下物质组合制成的： 1、胶原和壳聚糖；2、胶原、壳聚糖及戊二醛；3、胶原和赖氨酸；4、胶原和壳聚糖及纳米晶胶 原基骨；5、胶原、壳聚糖和戊二醛及纳米晶胶原基骨；6、胶原和赖氨酸及纳米晶胶原基骨； 7、胶原和壳聚糖及脱细胞软骨；8、胶原、壳聚糖和戊二醛及脱细胞软骨；9、胶原和赖氨酸 及脱细胞软骨。
[0038] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本 发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用 于限定本发明。
[0039] 本发明提供的胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的制备过程为：
[0040] 1、胶原的制备，包括以下步骤：
[0041] 1)取新鲜牛键，去除肌肉、脂肪，并尽可能去除筋膜；用三蒸水反复清洗后，装于 PE自封袋中-30°C保存；
[0042] 2)于冷冻状态下，用手术刀将牛键削为薄片，然后于组织捣碎机中捣碎；
[0043] 3)称取60克左右牛键粉碎物，用0· 05 % (w/v)的醋酸洗必泰浸泡5min消毒，然 后用〇. 9%的生理盐水多次洗涤，纱布过滤，尽可能洗去残留的醋酸洗必泰；
[0044] 4)将消毒后的牛键于含有0. 25%胰酶的PBS消化液（pH = 7. 4)中，37°C下消化 24小时；
[0045] 5)消化结束后，加入几滴H202,浸泡10-15分钟，去除残留的胰酶；然后用三蒸水反 复清洗，洗去H202。
[0046] 6)在消化好的牛键中加入少量3%的乙酸溶液，用组织捣碎机搅拌为粘稠状混合 物，再加入1000毫升3%的乙酸溶液，于4°C溶胀72小时；
[0047] 7)用布氏漏斗将未溶胀的牛键颗粒分离，溶胀物于离心机中离心（2000r/15min)， 以分离不溶物；
[0048] 8)用5% NaCl溶液盐析离心上清液；
[0049] 9)沉淀物再经3 %的乙酸溶胀后，重复步骤7)和8);
[0050] 10)然后于三蒸水中，用截留分子量为3000的透析袋4°C透析72h，每12h换水；
[0051] 11)透析后的胶原经冷冻干燥后，于-20°C条件下保存。
[0052] 2、纳米晶胶原基骨的制备，包括以下步骤：
[0053] 将一定比例的磷酸钠溶液和氯化钙溶液（Ca/P = 1. 66)添加入0. 67g/L的I型胶 原支架溶液中，缓慢搅拌，调节溶液pH在7. 4左右，48小时后离心去除上清，冷冻干燥。冻 干后得到的粉末再与聚乳酸复合成形即得最终的纳米晶胶原基骨三维框架材料；纳米晶胶 原基骨三维框架材料在PBS中漂洗30min共3次，在体积分数为95 %的乙醇中浸泡2h，用 无菌滤纸吸去多余液体，后研碎。
[0054] 3、脱细胞软骨的制备，包括以下步骤：
[0055] 取牛股骨，将股骨头关节面软骨用手术刀切下，蒸馏水冲洗2遍，室温下将关节软 骨浸泡于含〇. 〇35mmol/L PMSF(蛋白酶抑制剂）的PBS缓冲液（pH7. 5)中，经粉碎机粉碎、 梯度离心制成软骨微丝；软骨微丝经脱细胞液脱细胞处理，其中，脱细胞液为：〇. 〇35mmol/L PMSF、1 % TritonX-100 及ρΗ7· 5 的 Tris-HCl 缓冲液；持续震荡 48h，7000r/minX 5min 离心， PBS缓冲液冲洗，然后37°C下加入50U/ml的DNA酶和lU/ml的RNA酶消化2h，重复7000r/ minX5min离心，沉淀用超纯水冲洗3遍后再配成浓度为30g/L的乳糜状悬液，-20°C冰箱 中保存备用。
[0056] 实施例1
[0057] 本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步 骤：
[0058] Sla、获取原代骨髓间充质干细胞；
[0059] 采集骨髓标本，肝素抗凝。每份标本按1 :2的比例加在密度为1.073g/ml的 percoll分离液上，2300rpm转速下离心30min，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，lOOOrpm 离心10min，洗涤3次，弃上清液，即获得原代骨髓间充质干细胞。
[0060] S2a、原代骨髓间充质干细胞的传代培养；
[0061] 将步骤Sla中所获得的骨髓间充质干细胞调整至IX 107个/培养瓶（25ml)密 度，并添加血清培养基进行培养，其中，血清培养基为含有10%胎牛血清、10 6mol/L的氢 化可的松、l〇〇U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基，葡萄糖的浓度为 1500-4500mg/l。当细胞生长到95 %以上完全融合时，倾去旧培养基，用PBS液漂洗2~3 次，倾去PBS液，加入含0. 02% EDTA的0. 25 %的胰蛋白酶，加入量以使胰蛋白酶可以完全 覆盖瓶底的细胞为准。将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，细胞间隙增大后，立 即加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养终止消化，吸管顺序轻轻吹打瓶底，倒置显微镜下 观察细胞完全脱壁后，按1 :2~1 :3比例传代接种于25ml培养瓶，放置于37°C、5% C02、 95%湿度的培养箱中培养，直至细胞生长到几乎完全融合时，再次进行传代，获得第三代骨 髓间充质干细胞，继续培养3天。
[0062] S3a、取步骤S2a中获得的第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行 培养；
[0063] S3 la、三维细胞培养支架的制备过程，包括以下步骤：
[0064] 将胶原溶于3% (0. 5M)的乙酸溶液中，搅拌均匀形成浓度为0. 5%的胶原溶胀液； 并用3% (0. 5M)的乙酸溶液配制0. 5%的壳聚糖溶液，按体积比1 :1充分混合真空脱泡后 4°C储存备用。以每孔0.4ml注入24孔培养板中，于-20°C温度冷冻1小时。然后于冷冻一 干燥机中冻干24小时，即获得由胶原和壳聚糖共同制成的三维细胞培养支架，下简称"胶 原壳聚糖支架"。
[0065] S32a、将骨髓间充质干细胞接种于三维细胞培养支架上进行体外共培养；
[0066] 取步骤S31a中获得的胶原壳聚糖支架0. 5g于3% 10ml乙酸和20ml蒸馏水中复 溶后，接种于培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲 洗2次，0. 25%胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以IX 109L 1浓度接种于含有三维细胞培 养支架的培养容器中。第一天