半量换培养液一次，之后的两天全部更换。
[0067] 其中，该步骤所采用的培养液为含有10%胎牛血清、10 6mol/L的氢化可的松、 100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。
[0068] 实施例2
[0069] 与实施例1的不同之处在于，本实施例中，三维细胞培养支架是由胶原、壳聚糖和 戊二醛共同制成的胶原壳聚糖改性支架；
[0070] 在该实施例中，取第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养的过 程，包括以下步骤：
[0071] S31b、三维细胞培养支架的制备：
[0072] 将胶原溶于3% (0. 5M)的乙酸溶液中，搅拌均匀形成浓度为0. 5%的胶原溶胀液； 并用3 % (0.5M)的乙酸溶液配制0.5 %的壳聚糖溶液，将胶原溶胀液和壳聚糖溶液混合后 于150°C，真空烘箱中（真空度〈0. 2mbar)中干热交联24小时，获得胶原/壳聚糖支架；将 真空干热交联的胶原/壳聚糖支架按体积比1:1的比例浸泡于0.25% (w/v)的戊二醛水溶 液中，4°C交联12小时。交联结束后，用三蒸水充分漂洗6次，每次10分钟，洗去残留的戊 二醛，然后再经过冷冻一冻干即获得交联后的胶原壳聚糖改性支架。
[0073] S32b、接种步骤S31b获得的三维细胞培养支架；
[0074] 取0. 5g研碎后的三维细胞培养支架于10ml的3%乙酸和20ml蒸馏水中复溶，然 后将三维细胞培养支架接种于细胞培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸 除旧培养液，用？83冲洗2次，0.25%胰酶40了六常规消化并收集细胞，以1\109个/1浓 度接种与含有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两 天全部更换。
[0075] 其中，该步骤所采用的培养液为含有10%胎牛血清、10 7mol/L的氢化可的松、 80U/ml的青霉素及80mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。
[0076] 实施例3
[0077] 与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维细胞培养支架是由胶原支 架和赖氨酸组合制成的。
[0078] 在该实施例中，取第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养的过 程，包括以下步骤：
[0079] S3 lc、三维细胞培养支架的制备；
[0080] 将胶原溶于3% (w/v) (pH = 2. 78)的乙酸溶液中，搅拌均匀形成浓度为0. 5% (w/ v)的胶原溶胀液，经过真空脱泡处理后，以每孔0. 4ml注入24孔培养板中，于-20°C温度下 冷冻1小时，然后于冷冻干燥机中冻干24小时，即获得胶原支架。
[0081] 将胶原支架于1ml、50mM的MES (2- (N-吗啡啉）乙磺酸）溶液中室温下浸泡1小 时，其中，MES溶液中含有质量分数为3 %的赖氨酸，且MES溶液的pH值为5. 5，呈弱酸性；然 后添加 lml含有40mM的EDAC交联剂（乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺）和20mM的含NHS氨 基酸保护剂（N-羟基琥珀酰亚胺）的MES溶液，并于室温下交联处理24小时；交联后用三 蒸水漂洗6次，每次10分钟，然后经冷冻一干燥，即可制备经氨基酸辅助交联的胶原支架， 以下简称胶原赖氨酸支架。
[0082] S32c、接种步骤S31c获得的三维细胞培养支架；
[0083] 取0. 5g研碎后的三维细胞培养支架于10ml的3%乙酸和20ml蒸馏水中复溶，然 后将三维细胞培养支架接种于细胞培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸 除旧培养液，用？83冲洗2次，0.25%胰酶40了六常规消化并收集细胞，以1\109个/1浓 度接种于含有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两 天全部更换。
[0084] 其中，该步骤所采用的培养液为含有10%胎牛血清、10 smol/L的氢化可的松、 120U/ml的青霉素及120mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。
[0085] 实施例4
[0086] 与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维细胞培养支架是由纳米晶 胶原支架以及胶原壳聚糖支架的组合产物；其中，纳米晶胶原支架的制备方法如上所述，胶 原壳聚糖支架的制备方法见实施例1，在此不再赘述。
[0087] 在该实施例中，取第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养的过 程，包括以下步骤：
[0088] 取纳米晶胶原支架0. 25g和胶原壳聚糖支架0. 5g于3% 10ml乙酸和20ml蒸馏水 中复溶，然后接种于细胞培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养 液，用？85冲洗2次，0.25%胰酶40了4常规消化并收集细胞，以1\10\1浓度接种于含有 三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。
[0089] 其中，该步骤所采用的培养液为含有10%胎牛血清、10 6mol/L的氢化可的松、 100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。
[0090] 实施例5
[0091] 与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维细胞培养支架是由纳米晶 胶原支架以及胶原壳聚糖改性支架的组合产物，其中，纳米晶胶原支架的制备方法如上所 述，胶原与壳聚糖改性支架的制备方法见实施例1，在此不再赘述。
[0092] 在该实施例中，取第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养的过 程，包括以下步骤：
[0093] 取纳米晶胶原支架0. 25g和胶原壳聚糖改性支架0. 5g于3% 10ml乙酸和20ml蒸 馏水中复溶后，接种于细胞培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培 养液，用PBS冲洗2次，0. 25%胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1 X 109L 1浓度接种于含 有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。
[0094] 其中，该步骤所采用的培养液为含有10%胎牛血清、10 6mol/L的氢化可的松、 100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。
[0095] 实施例6
[0096] 与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维细胞培养支架是由纳米晶 胶原支架以及胶原赖氨酸支架组合而成的；其中，纳米晶胶原支架的制备方法如上所述，胶 原赖氨酸支架的制备方法见实施例3,在此不再赘述。
[0097] 在该实施例中，取第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养的过 程，包括以下步骤：
[0098] 取纳米晶胶原支架0. 25g和胶原赖氨酸支架0. 5g于3% 10ml乙酸和20ml蒸馏水 中复溶后接种于细胞培养容器中；取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液， 用PBS冲洗2次，0. 25 %胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1 X 109L 1浓度接种于含有三 维细胞培养支架的三维细胞培养支架。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。
[0099] 其中，该步骤所采用的培养液为含有10%胎牛血清、10 6mol/L的氢化可的松、 100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。
[0100] 实施例7
[0101] 与实施例1的不同之处在于，本实施例中所采用的三维细胞培养支架是由胶原壳 聚糖支架和脱细胞软骨组合而成；其中，胶原壳聚糖支架的制备方法见实施例1，脱细胞软 骨的制备方法如上所述，在此不再赘述。
[0102] 在该实施例中，取第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养的过 程，包括以下步骤：
[0103] 取30g/L的脱细胞软骨匀浆10ml和胶原壳聚糖支架0. 5g于3% 10ml乙酸和20ml 蒸馏水中复溶，然后将其接种于细胞培养容器中；再取第3代培养72h的骨髓间充质干细 胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0. 25 %胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1 X 109L 1浓 度接种于含有上述三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后 的两天全部更换。
[0104] 其中，该步骤所采用的培养液为含有10%胎牛血清、10 6mol/L的氢化可的松、 100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。
[0105] 实施例8
[0106] 本实施例中，三维细胞培养支架是由胶原壳聚糖改性支架和脱细胞软骨组合而成 的，其中，胶原壳聚糖改性支架的制备方式见实施例2,脱细胞软骨的制备方式如上所述，在 此不再赘述；
[0107] 在该实施例中，取第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养的过 程，包括以下步骤：
[0108] 取研碎后的胶原壳聚糖改性支架0. 5g、10ml的30g/L的脱细胞软骨于10ml的3% 乙酸和20ml蒸馏水中复溶，然后将